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문제 정의
- Shim등16)의 연구에서 ISF법의 경우 ELISA법 보다 민감도 측면에서 ISF의 민감도가 매우 향상된 것이 보고되었기 때문에 본 연구에서도 ID-ELISA의 낮은 민감도를 보완하여 고감도로 V. parahaemolyticus를 분석하기 위해 ISF법을 개발하였다. 그 결과 Fig.
- 이 분석법은 분석시간이 짧고 측정감도가 높아 최근 식중독균의 빠른 검출에 이용되고 있다15,16). 따라서 본 연구에서는 V. parahaemolyticus에 대한 특이 단클론성 항체를 개발하여 일반적인 ELISA법을 개발하고, ELISA법의 낮은 민감도를 보완할 수 있는 ISF법을 개발하였다.
제안 방법
- 1차 면역 후 2주 간격으로 1차 면역과 동일한 면역원을 incomplete freund’s adjuvant와 동량 혼합하여 2회 추가 면역을 실시하였고, 세포융합 4일 전에 2배 정도의 면역원만을 복강 내 주사하여 최종 면역시켰다.
- aureus, Sal. Typhimurium, L. monocytogenes 등과의 교차반응 여부를 확인하였다.
- aureus, Sal. Typhimurium, L. monocytogenes 등과의 교차반응성을 확인하였다.
- cereus, Sal. Typhimurium과의 교차반응성을 확인한 후 V. parahaemolyticus에 대한특이성이 높은 hybridoma cell을 선택하였다. 선택된 hybrid-oma cell은 대량 배양한 후 mouse의 복강에 1× 107 cell/ 200 µL를 주입하여 복수액을 생산하였으며, 1주일 후 생산된 복수액을 채취하여 ammonium sulfate 침전법으로 정제한 후, PBS를 이용하여 3일 동안 투석하였다.
- parahaemolyticus에 대해 특이성이 높은 hybridoma cell을 선택하기 위해 western blot을 이용하여 Vibrio속 및 다른 식중독균과의 교차반응성을 확인하였다. 그 결과 목표균에 높은 항체역가를 나타내는 HKVP 4H9-9와 16번 hybridoma cell을 선택하였고 western blot을 통해 특이성을 확인하였다. Fig.
- HKVP와 FKVP를 면역원으로 하여 면역시킨 mouse 중 HKVP로 면역시킨 마우스에서 항체 생성역가가 대체적으로 높았으며(data not shown), 이들 마우스의 spleen cell을이용하여 세포융합을 실시한 결과 총 13종의 융합세포를획득하였고, 이들을 cloning하여 총 22종의 hybridoma cell을 획득하였다. 그 중에서 V. parahaemolyticus에 대해 특이성이 높은 hybridoma cell을 선택하기 위해 western blot을 이용하여 Vibrio속 및 다른 식중독균과의 교차반응성을 확인하였다. 그 결과 목표균에 높은 항체역가를 나타내는 HKVP 4H9-9와 16번 hybridoma cell을 선택하였고 western blot을 통해 특이성을 확인하였다.
- aureus에 대한 교차반응은 우려할 만한 문제는 아니라고 판단된다. 따라서 Vibrio속과는 교차반응 정도가 비교적 높지만 식중독 균과는 교차반응을 거의 하지 않는 HKVP 4H9-9번 hybridoma cell을 선택하여 mouse 복강에 주입한 후 복수액을 대량 생산하였고, ammonium sulfate 침전법으로 정제하여 V. parahaemolyticus에 특이적인 단클론성 항체를 생산하였다.
- HKVP는 류 등13)의 방법에 따라 다음과 같이 준비하였다. 먼저 V. parahaemolyticus를 2% NaCl이첨가된 TSB 500 mL에 접종하여 37oC에서 18시간 진탕배양한 후 100oC에서 1시간 동안 열처리하여 하였다. 열처리된 HKVP를 8,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 멸균 0.
- 선택된 hybrid-oma cell은 대량 배양한 후 mouse의 복강에 1× 107 cell/ 200 µL를 주입하여 복수액을 생산하였으며, 1주일 후 생산된 복수액을 채취하여 ammonium sulfate 침전법으로 정제한 후, PBS를 이용하여 3일 동안 투석하였다.
- aureus (ATCC 14458), Listeria monocytogenes (ATCC 19111), Bacillus cereus (ATCC 40136) 및 Salmonella Typhimurium (ATCC 19586) 등을 사용하였다. 이상의 균주들을 배양하기 위한 배지로는 trypic soy agar (TSA, Difco, Laboratories, Detroit, MI, USA) 및 tryptic soy broth (TSB, Difco)를 사용하였고, Vibrio 속 균주 배양 시에는2% NaCl을 첨가하여 사용하였다.
- 준비된 항원인 HKVP를 complete freund’s adjuvant (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)와 1:1(v/v)로유화시켜 생후 7주된 암컷 BALB/C mouse (Hyochang Science, Korea)에 마리당 1× 108 cell/200 µL씩 복강에 주입하여 1차 면역을 실시하였다.
- 즉, PBS (containing 1% BSA) buffer로 10배 희석한 MNP-MAb 복합물 10 µL를 106-101 cell/200 µL로 준비한 각 시료에 첨가하여 37oC에서 30분 동안 반응시킨 후 magnetic particle concentrator를 이용해 MNP-MAb 복합물을 회수하였다.
- 최종 면역 후 mouse의 꼬리 정맥에서 5µL의 혈청을 채취하여 효소면역분석법으로 항체의역가를 측정하였다.
- 혼합액에 NAbTM Protein G Spin Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Meridian, Rockford, USA)를 이용하여 2차 정제한 V. parahaemolyticus MAb를 50 µg 첨가한 후 2시간 동안 실온에서 교반 반응시켜 MNP-MAb 복합물을 합성하였다.
- 즉, PBS (containing 1% BSA) buffer로 10배 희석한 MNP-MAb 복합물 10 µL를 106-101 cell/200 µL로 준비한 각 시료에 첨가하여 37oC에서 30분 동안 반응시킨 후 magnetic particle concentrator를 이용해 MNP-MAb 복합물을 회수하였다. 회수한 MNP-MAb 복합물은 멸균된 PBS로 2회 세척하고 membrane에 분주 후 감압장치를 이용해 filtration시켜 membrane 상의spot signal 형성 유무를 확인하였고(Fig. 1), Image J 프로그램(Java image processing program)을 이용하여 spot signal insensity를 측정하여 표준곡선을 작성하였다. ELISA법과 마찬가지로 확립된 분석법의 특이성을 확인하기 위해 V.
대상 데이터
- V. parahaemolyticus에 대한 단클론성 항체를 개발하기위해 heat killed V. parahaemolyticus (HKVP)를 면역원으로 사용하였다. HKVP는 류 등13)의 방법에 따라 다음과 같이 준비하였다.
- 본 연구를 위해 Vibrio속 균주는 V. parahaemolyticus (ATCC 17802), V. vulnificus (KCTC 2959), V. alginolyticus (KCCM 40513), V. cincinnatiensis (KCCM 41683), V. fluvialis (KCCM 40287) 및 V. mimicus (KCCM 42257)를사용하였고, 주요 식중독균 균주는 E. coli (ATCC 25922), S. aureus (ATCC 14458), Listeria monocytogenes (ATCC 19111), Bacillus cereus (ATCC 40136) 및 Salmonella Typhimurium (ATCC 19586) 등을 사용하였다. 이상의 균주들을 배양하기 위한 배지로는 trypic soy agar (TSA, Difco, Laboratories, Detroit, MI, USA) 및 tryptic soy broth (TSB, Difco)를 사용하였고, Vibrio 속 균주 배양 시에는2% NaCl을 첨가하여 사용하였다.
데이터처리
- 개발된 ISF법과 ID-ELISA법에 대해 민감도와 특이성,소요시간, 실험에 사용되는 분석과정 등을 비교 분석하였다. 개발된 ISF법과 ID-ELISA법의 검출한계는 각각 5 × 101 cell/mL과 106 cell/mL로 ISF법의 민감도가 매우 높은 것으로 확인되었다.
이론/모형
- parahaemolyticus (HKVP)를 면역원으로 사용하였다. HKVP는 류 등13)의 방법에 따라 다음과 같이 준비하였다. 먼저 V.
- 최종 면역 후 mouse의 꼬리 정맥에서 5µL의 혈청을 채취하여 효소면역분석법으로 항체의역가를 측정하였다. 그 중 높은 역가를 갖는 mouse로부터spleen cell를 분리한 후 myeloma cell (Sp2/0-Ag14)을 사용하여 Kohler and Milstein17)의 방법으로 세포융합을 실시하였고, McKearn 등18)의 무한대 희석법으로 cloning을실시하여 단일클론의 hybridoma cell을 획득하였다. 획득한 hybridoma cell 중 특이성이 높은 항체를 생산하는 cell을 선택하기 위해 western blot으로 Vibrio 속 균주인 V.
- 생산된 단클론성 항체를 이용하여 V. parahaemolyticus분석을 위한 최적의 ID-ELISA법을 다음과 같이 확립하였다. 즉, HKVP를 0.
- , Grand Island, NY, USA)를 이용하여 분리한 후 1mL의 PBS로 3회 세척하였다. 이렇게 합성된 MNP-MAb 복합물을 이용하여 다음과 같이 ISF법을 확립하였다. 즉, PBS (containing 1% BSA) buffer로 10배 희석한 MNP-MAb 복합물 10 µL를 106-101 cell/200 µL로 준비한 각 시료에 첨가하여 37oC에서 30분 동안 반응시킨 후 magnetic particle concentrator를 이용해 MNP-MAb 복합물을 회수하였다.
성능/효과
- 그리고 두 분석법 모두 일부 Vibrio spp.(ID-ELISA법: V. alginolyticus, ISF법: V. vulnificus)과 S. aureus에 교차반응을 보이지만 V. parahaemolyticus에 반응성이 강하기 때문에 특이성은 높은 것으로 판단된다. 분석에 소요되는 시간은 ELISA법의 경우 96 well을 코팅하는 단계부터 결과를 확인하기까지 총 16시간이 소요되는반면, ISF법은 MNP-MAb conjugate와 균을 반응시키는 30분을 포함하여 1시간 이내에 분석을 완료할 수 있는 것으로 확인되었다.
- HKVP와 FKVP를 면역원으로 하여 면역시킨 mouse 중 HKVP로 면역시킨 마우스에서 항체 생성역가가 대체적으로 높았으며(data not shown), 이들 마우스의 spleen cell을이용하여 세포융합을 실시한 결과 총 13종의 융합세포를획득하였고, 이들을 cloning하여 총 22종의 hybridoma cell을 획득하였다. 그 중에서 V.
- 개발된 ISF법과 ID-ELISA법의 검출한계는 각각 5 × 101 cell/mL과 106 cell/mL로 ISF법의 민감도가 매우 높은 것으로 확인되었다.
- 그 결과 Fig. 5와 같이 5 × 101 cell/mL까지 검출이 가능한 고감도 분석법으로 확인되었다.
- parahaemolyticus와 생리학적 및화학적 특성이 매우 유사하기 때문에20) 교차반응성이 높게 나타난 것으로 판단된다. 다른 식중독균에 대한 교차반응성을 확인한 결과 S. aureus와 약한 교차반응성을 나타내었다(Fig. 4B). S.
- 3과 같았으며, 106 cell/mL까지 검출이 가능한 것으로 확인되었다. 또한, 개발된 ID-ELISA법의 다른 Vibrio속 균에대한 교차반응성을 확인한 결과 V. alginolyticus와 교차반응성이 높은 것으로 확인되었고, 107 cell/mL 이상의 농도에서는 V. vulnificus, V. fluvialis 및 V. mimicus와도 약한교차반응성을 보였다(Fig. 4A). 높은 농도에서의 교차반응은 항원-항체의 비특이적인 반응에 의한 것이라 생각되며,특히 V.
- 5와 같이 5 × 101 cell/mL까지 검출이 가능한 고감도 분석법으로 확인되었다. 또한,교차반응성을 확인한 결과 Vibrio속 균에 대해서는 ID-ELISA법과는 달리 V. vulnificus와 교차반응성이 있는 것으로 확인되었고, 다른 식중독균에 대해서는 ID-ELISA법과 동일하게 S. aureus와 약한 교차반응성을 나타내었다(Fig. 6). 일부 Vibrio속과 S.
- 분석에 소요되는 시간은 ELISA법의 경우 96 well을 코팅하는 단계부터 결과를 확인하기까지 총 16시간이 소요되는반면, ISF법은 MNP-MAb conjugate와 균을 반응시키는 30분을 포함하여 1시간 이내에 분석을 완료할 수 있는 것으로 확인되었다. 분석과정 또한 ELISA법은 세척단계를 포함하여 9단계의 과정을 거쳐야 하지만 ISF법은 세척단계를 포함하여 3단계의 과정을 통해 분석결과를 확인할 수있고, 분석소요시간 내에 처리할 수 있는 시료양은 두 분석법 모두 다수의 시료를 분석할 수 있는 것으로 평가되었다(Table 1). 이상의 결과 민감도와 소요시간, 분석과정등 모든 면에서 ISF법이 ID-ELISA법 보다 효율성이 뛰어나고 신속하게 V.
- parahaemolyticus에 반응성이 강하기 때문에 특이성은 높은 것으로 판단된다. 분석에 소요되는 시간은 ELISA법의 경우 96 well을 코팅하는 단계부터 결과를 확인하기까지 총 16시간이 소요되는반면, ISF법은 MNP-MAb conjugate와 균을 반응시키는 30분을 포함하여 1시간 이내에 분석을 완료할 수 있는 것으로 확인되었다. 분석과정 또한 ELISA법은 세척단계를 포함하여 9단계의 과정을 거쳐야 하지만 ISF법은 세척단계를 포함하여 3단계의 과정을 통해 분석결과를 확인할 수있고, 분석소요시간 내에 처리할 수 있는 시료양은 두 분석법 모두 다수의 시료를 분석할 수 있는 것으로 평가되었다(Table 1).
- 생산된 HKVP 4H9-9 항체를 사용하여 V. parahaemolyticus를 분석하기 위해 개발된 ID-ELISA법의 표준곡선은 Fig. 3과 같았으며, 106 cell/mL까지 검출이 가능한 것으로 확인되었다. 또한, 개발된 ID-ELISA법의 다른 Vibrio속 균에대한 교차반응성을 확인한 결과 V.
- 분석과정 또한 ELISA법은 세척단계를 포함하여 9단계의 과정을 거쳐야 하지만 ISF법은 세척단계를 포함하여 3단계의 과정을 통해 분석결과를 확인할 수있고, 분석소요시간 내에 처리할 수 있는 시료양은 두 분석법 모두 다수의 시료를 분석할 수 있는 것으로 평가되었다(Table 1). 이상의 결과 민감도와 소요시간, 분석과정등 모든 면에서 ISF법이 ID-ELISA법 보다 효율성이 뛰어나고 신속하게 V. parahaemolyticus를 검출할 수 있는 분석법인 것으로 판단된다.
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