A bacterium producing a large amount of chitinolytic enzyme was isolated from the intestinal tract of earthworm. The isolate was identified as Bacillus licheniformis by 16S ribosomal RNA analysis and designated as B. licheniformis GA9. The enzyme was purified by 40-60% ammonium sulfate precipitation...
A bacterium producing a large amount of chitinolytic enzyme was isolated from the intestinal tract of earthworm. The isolate was identified as Bacillus licheniformis by 16S ribosomal RNA analysis and designated as B. licheniformis GA9. The enzyme was purified by 40-60% ammonium sulfate precipitation, diethyl-aminoethyl groups exchange chromatography, and gel filtration chromatography. The molecular weight was estimated to be 52.1 kDa and the N-terminal amino acid sequence was D-S-G-K-N-G-K-I-I-R-Y-YP-I-R. The optimum activity of the purified chitinolytic enzyme was shown at pH 5.0 and $40^{\circ}C$, and the enzyme was stable in the ranges of $20-50^{\circ}C$ and pH 5.0-6.0. Enzyme activity was increased by $Co^{2+}$, while it was inhibited by $Cu^{2+}$ and $Fe^{2+}$. But it was recovered by chelating metals with ethylenediaminetetraacetic acid. The $K_m$ and $V_{max}$ values of the purified enzyme were 4.02 mg/ml and 0.52 mg/min, respectively. The chitinolytic enzyme characterized in this study has potential applications in areas such as biotechnology, biomedicine, agriculture, and nutrition.
A bacterium producing a large amount of chitinolytic enzyme was isolated from the intestinal tract of earthworm. The isolate was identified as Bacillus licheniformis by 16S ribosomal RNA analysis and designated as B. licheniformis GA9. The enzyme was purified by 40-60% ammonium sulfate precipitation, diethyl-aminoethyl groups exchange chromatography, and gel filtration chromatography. The molecular weight was estimated to be 52.1 kDa and the N-terminal amino acid sequence was D-S-G-K-N-G-K-I-I-R-Y-YP-I-R. The optimum activity of the purified chitinolytic enzyme was shown at pH 5.0 and $40^{\circ}C$, and the enzyme was stable in the ranges of $20-50^{\circ}C$ and pH 5.0-6.0. Enzyme activity was increased by $Co^{2+}$, while it was inhibited by $Cu^{2+}$ and $Fe^{2+}$. But it was recovered by chelating metals with ethylenediaminetetraacetic acid. The $K_m$ and $V_{max}$ values of the purified enzyme were 4.02 mg/ml and 0.52 mg/min, respectively. The chitinolytic enzyme characterized in this study has potential applications in areas such as biotechnology, biomedicine, agriculture, and nutrition.
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문제 정의
본 연구는 키틴 분해효소를 산업적으로 활용하기 위해 키틴 분해활성이 우수한 미생물을 지렁이 장내에서 분리 및 선발하였고, 선발 미생물이 생산하는 키틴 분해효소를 정제하고 이화학적 특성을 확인하였다.
제안 방법
85% (w/v) NaCl 용액에 십진 희석하여 2% (w/v) colloidal chitin을 함유한 고체배지에 도말·배양하여 콜로니 주위로 투명하게 분해환 (clear zone)을 생성하는 미생물 총 1,520주를 1차 선발하였다. 1차 선발미생물은 2% (w/v) colloidal chitin을 함유한 액체배지에 배양한 후, 조효소액을 이용하여 키틴 분해활성이 우수한 균주를 2차 선발하였으며, 키틴 분해효소를 정제하기 위한 영양 최소배지인 DAVIS broth에 접종하여 키틴 분해활성이 가장 우수한 GA9 균주를 최종 선발하였다(data not shown).
B. licheniformis GA9이 생산하는 키틴 분해효소의 정제는 배양상등액 40−60% 황산암모늄 침전, 음이온교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
분리 미생물로부터 분리한 chromosomal DNA를 universal primer인 27 forward primer (5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)와 1492 reverse primer (5’-GGATACCTTGTTACGACTT-3’)를 사용하였다. PCR (MinicyclerTM; MJ research Inc., USA) 증폭은 순차적으로 94℃에서 1분간 denaturation, 51℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분 30초 동안 extension을 30 cycles 실시하였고 72℃에서 5분간 최종 extension을 실시하였다. 증폭된 약 1.
SDS-PAGE 전기영동한 10% (w/v) polyacrylamide gel을 1% Triton X-100 용액(10 mM Tris·HCl buffer, pH 7.5)과 멸균증류수를 이용하여 각각 15분동안 세척하여 SDS를 제거한 후, 8% (w/v) colloidal 키틴을 함유한 10% (w/v) polyacrylamide gel 위에 중첩시켰다.
정제한 키틴 분해효소의 분자량을 측정하고 단일성을 확인하기 위하여 SDS-polyacrylamide gel과 zymography 전기영동을 수행하였다. SDS-PAGE와 zymography를 비교하여 키틴 분해활성이 나타난 위치의 band를 확인한 결과는 Fig. 2A와 Fig. 2B에 각각 나타내었으며, 황산암모늄 분획, 이온교환 크로마토그래피와 겔 크로마토그래피 모두 동일한 위치에서 분해환을 확인하였다. 정제한 키틴 분해효소 단백질의 분자량은 52.
Sample buffer [12.5 mM Tris·HCl (pH 6.8), 2% β- mecaptoethanol, 20% glycerol, 0.02% bromophenol blue, 2% SDS]와 효소액을 4:1로 혼합하여 90℃에서 3분간 열처리한 후, 80 V에서 2시간동안 전기영동을 수행하였다.
동일 완충액에 용해시킨 linear gradient한 0−1 M NaCl로 용출하여 4 ml씩 분획하였다. 각 분획마다 키틴 분해활성을 측정하고 단백질 함량은 280 nm에서 흡광도를 측정하였다. Sephacryl S-300HR 으로 충진된 column (1.
농축한 키틴 분해활성 분획을 겔 크로마토그래피로 정제한 결과, 총 160개의 분획 중 키틴 분해활성을 나타낸 55−71번 분획을 모아 동결건조하여 농축하였다(data not shown).
분리 미생물로부터 분리한 chromosomal DNA를 universal primer인 27 forward primer (5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)와 1492 reverse primer (5’-GGATACCTTGTTACGACTT-3’)를 사용하였다.
분리 미생물을 DAVIS 액체배지에 2% (v/v) 접종하여 30℃에서 72시간동안 배양한 후, 배양액을 원심분리 (10,000 × g, 4℃, 30 min)하여 상등액에 ammonium sulfate (Junsei, Japan)를 0−20%, 20−40%, 40−60%, 60−80%, 80% 이상의 농도로 포화시키며 분획별 침전물을 각각 원심 분리(20,000 × g, 4℃, 25 min)하였다.
분리 미생물의 형태적 동정은 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 따라 분류하였다[19]. 분리 미생물의 생화학적 동정은 API 50 CHB kit (bioMerieux Co., France)로 49개 탄소원에 대한 이용성을 조사하였고 결과는 API web database (http://apiweb.biomerieux.com)을 이용 하여 동정하였다.
분리 미생물의 유전학적 동정은 16S ribosomal DNA 염기 서열 분석을 통해 수행하였다. 분리 미생물로부터 분리한 chromosomal DNA를 universal primer인 27 forward primer (5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)와 1492 reverse primer (5’-GGATACCTTGTTACGACTT-3’)를 사용하였다.
, USA) 40 g을 HCl 용액 400 ml에 넣어 상온에서 30분간 교반하였다. 염산에 의해 갈색으로 점액질 용액이 된 키틴에 증류수 2 L를 첨가하여 약 2시간 동안 교반하였고 Whatman No.2 여과지(Whatman Intl. Ltd., England)를 이용하여 감압여과를 수행하였다. 키틴 수용액의 pH가 6.
정제한 키틴 분해효소의 분자량을 측정하고 단일성을 확인하기 위하여 SDS-polyacrylamide gel과 zymography 전기영동을 수행하였다. SDS-PAGE와 zymography를 비교하여 키틴 분해활성이 나타난 위치의 band를 확인한 결과는 Fig.
정제한 효소 50 μl와 금속이온 450 μl를 혼합하여 금속이온의 최종 농도가 각각 2 mM 과 10 mM이 되도록 하여 37℃에서 30분간 반응시켜 잔존 효소 활성을 측정하였다.
, USA) 증폭은 순차적으로 94℃에서 1분간 denaturation, 51℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분 30초 동안 extension을 30 cycles 실시하였고 72℃에서 5분간 최종 extension을 실시하였다. 증폭된 약 1.4 kb의 fragment를 T vector (Invitrogen, USA)에 결합시킨 후 형질전환하여 T vector sequencing primer를 이용하여 Applied Biosystems 3730 DNA analyzer (Applied Biosystems, USA)로 염기서열을 분석하고 GenBank (NCBI, USA)의 database에 등록된 16S rDNA 염기서열의 정보와 BLAST program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)을 이용하여 분리 미생물을 동정하였다.
최적반응 pH 는 조효소액과 정제한 효소액 각각 50 μl에 10 mM sodium acetate buffer (pH 5.0) 450 μl를 첨가한 후, colloidal chitin을 각 pH의 buffer (pH 4.0−10.0)에 1% 농도로 녹여 기질로서 사용하여 측정하였다.
키틴 분해효소의 활성측정은 Thamthiankul 등 [22]의 방법을 변형하여 1% (w/v) colloidal chitin (0.1 M sodium acetate buffer, pH 5.0)을 기질로 사용하여 DNS 환원당 정량법으로 수행하였다. 1% (w/v) colloidal chitin solution (0.
키틴분해 효소의 Km 값과 Vmax 값은 기질농도([S])에 따른 반응속도([V])를 측정하고 측정값의 역수를 취해 Lineweaver- Burk plot을 작성하여 결정하였다. 기질은 0.
황산암모늄 활성분획을 10 mM Tris·HCl buffer (pH 7.5) 에 용해시킨 후, 동일한 완충용액으로 투석하여 황산암모늄을 제거한 시료를 음이온 교환수지 DEAE-sepharose fast flow에 흡착시키고 0−1 M NaCl 용액을 linear gradient하게 용출시켜서 분획마다 키틴 분해활성을 측정한 결과, 총 240개의 분획 중 149−186번 분획에서 키틴 분해활성을 확인하였으며, 활성분획은 투석을 실시한 후, 동결건조하여 농축하였다.
효소 활성의 최적 pH를 측정하기 위하여 0.1 M sodium acetate buffer (pH 4.0−6.0), 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.0−8.0), 0.1 M Tris·HCl buffer (pH 8.0−10.0) 를 키틴분해 활성측정 완충액으로 사용하였다.
효소 활성의 최적반응 온도는 20℃에서 80℃까지 각 온도에서 조효소액과 정제한 효소액을 2시간동안 1% (w/v) colloidal chitin (0.1 M sodium acetate buffer, pH 5.0) 기질과 반응시켜 측정하였고, 온도 안정성은 조효소액과 정제한 효소액을 최적온도 조건과 동일하게 4시간동안 반응시킨 후, 잔존효소 활성을 측정하였다.
단백질 분자량 측정을 위한 표준 단백질로 broad-range pre-stained marker (7−240 kDa; Elpis Biotech Inc., Korea)를 사용하였다.
분리미생물은 최소배지인 DAVIS 액체배지(0.2% colloidal chitin, 0.07% K2HPO4, 0.03% KH2PO4, 0.05% MgSO4·5H2O, 0.001% FeSO4· 7H2O, 0.001% ZnSO4, 0.01 g MnCl2, 0.2% yeast extract)에서 30℃, 72시간동안 배양하였으며 배양액을 원심분리(10,000 × g, 4℃, 10 min)한 후, 상등액을 조효소액으로 사용하였다.
지렁이의 장 내용물을 0.85% (w/v) NaCl 용액에 십진 희석하여 2% (w/v) colloidal chitin을 함유한 고체배지에 도말·배양하여 콜로니 주위로 투명하게 분해환 (clear zone)을 생성하는 미생물 총 1,520주를 1차 선발하였다.
키틴 분해활성이 있는 미생물의 분리는 지렁이 농장(강원도 홍천)에서 지렁이(Eisenia fetida)를 구입하여 각종 우분, 도축 부산물, 키틴, 제지 슬러지, 톱밥 등을 먹이원으로 공급하면서 16주동안 지렁이를 사육하였다. Clean bench내에서 지렁이 표면을 70% ethanol로 소독하고 화염 멸균한 blade 로 절개한 후, 지렁이 장 내용물을 취해 0.
키틴분해 효소의 활성에 영향을 미치는 금속이온을 조사하기 위하여 CaCl2, CoCl2, CuCl2, FeCl2, MgCl2, MnCl2, ZnCl2를 사용하여 측정하였다. 정제한 효소 50 μl와 금속이온 450 μl를 혼합하여 금속이온의 최종 농도가 각각 2 mM 과 10 mM이 되도록 하여 37℃에서 30분간 반응시켜 잔존 효소 활성을 측정하였다.
이론/모형
Transfer한 후, PVDF membrane은 coomassie brilliant blue로 염색하고 methanol로 탈색하였다. PVDF membrane을 건조하여 염색한 효소단백질을 확인한 후, Edman 방법에 따라 Protein/Peptide sequencer (Applied Biosystems Inc.)를 이용하여 아미노산 서열을 확인하였다[4].
분리 미생물의 형태적 동정은 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 따라 분류하였다[19].
키틴 분해효소 단백질의 정량은 Lowry’s method에 따라 수행하였다[15].
키틴 분해효소의 분자량 측정은 sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 사용하였다. Sample buffer [12.
성능/효과
정제한 키틴 분해효소의 금속이온에 대한 영향을 조사하기 위하여 각각의 금속이온을 최종농도가 2 mM과 10 mM 이 되도록 조정하여 측정한 결과는 Table 3에 나타내었다. 10 mM Co2+ 금속이온 존재시 효소활성은 118.3%로 증가하였으며, 2 mM Fe2+과 Cu2+ 금속이온 존재시 효소활성은 각각 4.1%와 61.3%로 감소하였고 10 mM의 경우는 각각 10%와 31.6%로 감소하였다.
74 mg/ml의 Km 값을 나타내었다. Bacillus 속(이) 생성하는 키틴 분해효소의 Km 값이 B. licheniformis GA9가 생산하는 키틴 분해효소보다 비교적 높아 기질 친화도는 낮은 것으로 판단되었다. Hong과 Seu [8] 가 분리한 Streptomyces속(이) 생산하는 키틴 분해효소와 Lee 등[12]이 분리한 Aeromonas salmonicida YA7-625가 생산하는 키틴 분해효소의 Km 값은 각각 1.
circulans WL-12가 생산하는 키틴 분해효소 ChiA1 역시 부분적으로 일치(Ala-Asp-Ser-Tyr-Leu-Ile-Val-Gly-Tyr-Tyr-Pro-Ser-Trp- Ala-Ala-Gly-Arg-Asn-Tyr)하는 것을 확인하였다[23, 27]. 그러나 그 외에 Bacillus 속(이) 생성하는 키틴 분해효소의 아미노산 서열은 일치하지 않는 것으로 확인되었다(Table 2).
대부분의 Bacillus 속(이) 생산하는 키틴 분해효소들은 pH 5.0−8.0 사이에서 최대활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
0을 사용하여 Phylogenetic tree 분석한 결과, Bacillus licheniformis와 가장 가까운 유연관계를 보였다. 따라서, 형태적 특징, 생화학적 특성과 16S rRNA 염기서열 분석결과를 종합하여, 선발 미생물을 Bacillus licheniformis GA9으로 명명하였다(Fig. 1).
선발 미생물을 Gram 염색과 아포염색을 하여 현미경으로 관찰한 결과, 그람 양성 간균으로 관찰되었고 내생포자를 생성하는 것으로 확인되었다(data not shown). 생화학적 동정을 위하여 API 50 CHB kit test를 실시한 결과, Bacillus licheniformis와 99.9% 상동성을 나타내었다(data not shown). 유전학적 동정을 위하여 16S ribosomal RNA 유전자 염기서열을 CLUSTAL X로 Multiple sequence alignment 한 후, MEGA 4.
선발 미생물을 Gram 염색과 아포염색을 하여 현미경으로 관찰한 결과, 그람 양성 간균으로 관찰되었고 내생포자를 생성하는 것으로 확인되었다(data not shown). 생화학적 동정을 위하여 API 50 CHB kit test를 실시한 결과, Bacillus licheniformis와 99.
9% 상동성을 나타내었다(data not shown). 유전학적 동정을 위하여 16S ribosomal RNA 유전자 염기서열을 CLUSTAL X로 Multiple sequence alignment 한 후, MEGA 4.0을 사용하여 Phylogenetic tree 분석한 결과, Bacillus licheniformis와 가장 가까운 유연관계를 보였다. 따라서, 형태적 특징, 생화학적 특성과 16S rRNA 염기서열 분석결과를 종합하여, 선발 미생물을 Bacillus licheniformis GA9으로 명명하였다(Fig.
1%로 금속이온의 농도가 증가할수록 잔존 효소활성이 감소한다고 보고하였다. 정제한 키틴 분해효소 활성에 영향을 미치는 금속이온과 EDTA를 혼합하였을 때, 효소 활성이 크게 감소되었던 Fe2+와 Cu2+는 EDTA 존재시 효소활성이 회복되었으며, Co2+ 금속이온은 EDTA가 존재할 때, 증가되었던 효소활성이 감소하는 결과를 나타내었다.
키틴 분해효소의 최적반응 온도와 온도안정성의 경우, 40℃에서 최대 활성을 나타내었으며, 60℃까지 60%의 잔존 활성을 나타내었다. 정제한 키틴 분해효소는 10 mM Co2+ 금속이온에 의해 효소활성이 증가하였으며, Fe2+과 Cu2+ 금속이온에 의해 효소활성이 감소하였으나, EDTA 첨가시 감소한 효소활성이 일부 회복되 었다. 정제한 효소의 Km 및 Vmax는 각각 4.
정제한 키틴 분해효소의 기질 친화도를 측정하기 위해 다양한 농도의 기질(0.1−0.4% (w/v) colloidal chitin)을 이용해 Lineweaver-Burk 방법으로 plot하여 기질별로 Km과 Vmax 값을 계산한 결과, Km 값은 4.02 mg/ml이었고 Vmax 값은 0.52 mg/min이었다(Fig. 4).
0%를 나타내었다. 정제한 키틴 분해효소의 분자량은 약 52.1 kDa으로 나타났으며, N-terminal amino acid sequencing 분석결과, 아미노산 서열은 D-S-G-K-N-G-K-I-I-R-Y-Y-P-IR로 확인되었다. 키틴 분해효소의 최적반응 pH와 pH 안정성을 측정한 결과, pH 5.
조효소액과 정제한 효소액 모두 pH 5.0에서 최대 활성을 나타내었으며(Fig. 3A), 조효소액은 pH 5.0−8.0 사이에서 안정하였고 정제한 효소액의 경우 pH 5.0−6.0에서 안정하였다(Fig. 3B).
조효소액과 정제한 효소액의 키틴 분해활성은 알칼리 조건에서보다 산성 조건에서 비교적 높게 나타내었다. Wang 등[25]이 분리한 Bacillus amyloliquefaciens V656이 생산한두 개의 항진균성 키틴 분해효소 F1와 F2는 각각 pH 7.
지렁이의 장내로부터 분리한 미생물 중에서 키틴 가수분해 활성이 우수한 미생물을 선발하였으며, 이를 동정하여 Bacillus licheniformis GA9으로 명명하였다. B.
licheniformis GA9이 생산하는 키틴 분해효소의 정제는 배양상등액 40−60% 황산암모늄 침전, 음이온교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 최종적으로 정제한 키틴 분해효소는 45.2배로 정제되었고 효소단백질 회수율은 20.0%를 나타내었다. 정제한 키틴 분해효소의 분자량은 약 52.
키틴 분해효소를 정제하기 위하여 2% (w/v) colloidal chitin이 함유된 DAVIS 액체배지에서 30℃, 48시간동안 배양한 B. licheniformis GA9의 배양상등액에 황산암모늄을 0−20%, 20−40%, 40−60%, 60−80% 농도로 포화시켰으며, 생성된 침전물을 각각 키틴 분해활성을 비교한 결과, 40−60%황산암모늄 침전물에서 키틴 분해효소의 활성이 존재함을 확인하였다(data not shown).
농축한 키틴 분해활성 분획을 겔 크로마토그래피로 정제한 결과, 총 160개의 분획 중 키틴 분해활성을 나타낸 55−71번 분획을 모아 동결건조하여 농축하였다(data not shown). 키틴 분해효소를 최종 정제한 결과, 배양상등액에 비해 45.2배 농축되었으며 회수율은 20.0%로 확인하였다 (Table 1).
키틴 분해효소의 최적반응 pH와 pH 안정성을 측정한 결과, pH 5.0에서 최대 활성을 나타내었으며 pH 5.0−6.0에서 안정성을 나타내었다.
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