[논문]LPS유도 대식세포에서 Kaempferol-7-O-β-D-glucoside의 NO, PGE2 및 염증성 사이토카인 생성 저해 효과

박종철; 한희수; 이승빈; 이경태

LPS유도 대식세포에서 Kaempferol-7-O-β-D-glucoside의 NO, PGE2 및 염증성 사이토카인 생성 저해 효과
Inhibitory Effects of Kaempferol-7-O-β-D-glucoside on LPS-induced NO, PGE2 and Inflammatory Cytokines Production in RAW264.7 Macrophages 원문보기

생약학회지, v.47 no.4, 2016년, pp.295 - 300

박종철 (국립순천대학교 생명산업과학대학 한약자원개발학과) , 한희수 (경희대학교 약학대학 약품생화학실) , 이승빈 (경희대학교 약학대학 약품생화학실) , 이경태 (경희대학교 약학대학 약품생화학실)

Abstract ▼ AI-Helper

Flavonoids are widely reported to be beneficial to human health. Among flavonoids, in general, flavonoid aglycons have better biological activities than flavonoid glycosides, in that aglycons can easily penetrate through cell membrane because of their low polarity. Therefore, kaempferol, quercetin and various their glycosides were evaluated for their abilities to inhibit NO and $PGE_2$ productions in LPS-induced RAW 264.7 cells. Of these flavonoids and flavonoid glycosides, kaempferol-7-O-${\beta}$-D-glucoside(kp-7-glu) which possesses a glycoside at C-7 position of the A ring in kaempferol, potently inhibited NO, $PGE_2$ and $TNF-{\alpha}$, $IL-1{\beta}$, IL-6 productions in LPS-induced RAW 264.7 macrophages.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

이러한 염증 매개체들이나 사이토카인을 조절하는 것이 염증성 질환을 치료하는 하나의 방법으로 제시되고 있다. 따라서 본 연구에서는 다양한 flavonoid 성분들이 염증 매개 인자들과 사이토카인을 억제하는 데 효과가 있는지 확인하였다. LPS로 유도한 murine macrophage cell line인 RAW 264.
본 연구에서는 다양한 식물에서 분리한 flavonoid 성분들 중 kaempferol, quercetin 및 이들의 다양한 배당체 성분들의 대식세포에서 LPS로 유도된 항염증 매개 물질들의 생성억제를 확인하였다. 실험을 통해 얻은 결론은 다음과 같다.
7 세포는 염증반응 매개 인자를 연구하고, 화합물의 항염증 활성을 연구하는데 널리 사용된다. 본 연구에서는 다양한 식물에서 추출, 분리해 낸 flavonoid 계 성분들 중 kaempferol 및 quercetin과 이들의 다양한 glycosides 등이 RAW 264.7 대식세포에서 항염증 활성을 나타내는 지를 확인하였다.
6-8) 그 외에 flavonoids 성분들은 항암,⁹⁾항바이러스,¹⁰⁾ 항알레르기¹¹⁾와 같은 활성을 지닌 유용한 물질이라고 보고되었다. 본 연구에서는 앞서 언급한 flavonoid 성분들 중 kaempferol 및 quercetin과 이들 배당체들의 항염증 활성을 비교 하고자 한다.

제안 방법

먼저, kaempferol, quercetin 및 이들 배당체 성분들이 RAW 264.7 대식세포의 생존에 미치는 영향을 측정하기 위해 MTT assay를 진행하였다. 실험 결과, 대부분의 화합물들은 모두 2, 10, 50, 100 μg/ml의 농도로 처리하였을 때, 80~100%의 세포 생존율을 보여 세포 독성이 거의 없음을 확인하였다.
상층액과 standard(NaNO2)를 100 μl씩 96 well에 분주하고, Griess reagent를 100 μl씩 첨가한 후, ELISA를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
수거한 상층액으로 enzyme immunoassay(EIA) kits(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 PGE2를 측정하였다.
수거한 상층액으로 enzyme immunoassay(EIA) kits(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 pro-inflammatory cytokines인 TNF-α, IL-1β, IL-6를 측정하였다.
이러한 구조적 특징 및 앞서 실험한 화합물의 세포 독성 및 NO 생성 억제 효과를 고려했을 때, kaempferol-7-O-β-D-glucoside의 NO 생성 저해 효과가 가장 우수하여 추가적인 LPS유도 PGE2 및 항염증 사이토카인 생성 억제 실험을 진행하였다.

대상 데이터

− 본 실험에 사용된 flavonoid 화합물은 공동저자(박종철)에 의해 분리된 것을 사용하였다.
− 실험에 사용한 RAW 264.7 대식세포는 murine macrophage cell line으로, 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)에서 구입하였으며, 10% FBS와 100 unit/ml penicillin-streptomycin이 포함된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2 incubator에 적응시켜 배양하였다.
(Enzo, New York, USA)에서, mouse TNF-α, IL-1β, IL-6 EIA kits는 BD biosciences(San Diego, USA)에서 구입하였다.
− 세포배양에서 필요한 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM) 배지와 Fetal bovine serum(FBS)와 Penicillin-Streptomycin(PS)는 Life Technologies Inc.(Grand Island, NY, U.S.A.)에서 구입해 사용하였다. Thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT) 시약은 Alfa Aesar(MA, USA)에서, PGE₂ ELISA kit는 Enzo Life Sciences, Inc.

데이터처리

#p<0.05 vs. the control group; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. the LPS-treated group; the significances of the difference between the treated groups was evaluated using the Student’s t-test.
− 본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 평균치±표준오차(mean±S.E)로 나타내었으며, 그 유의성은 Student’s t-test로 분석하여 얻은 p-value 값으로 통계적 유의차를 평가하였다.

성능/효과

보통 염증 반응은 조직 손상, 반응, 회복의 3단계를 거쳐 생체 조직을 방어하는데, 염증 반응이 지속되면 오히려 점막의 손상을 촉진하고, 심한 경우 암이나 동맥경화증, 관절염과 같은 염증 질환을 유발 한다.¹⁾ 염증의 병변은 여러 NO, PGE₂, 염증성 cytokine이나 이들의 생성에 관여하는 iNOS, COX-2와 같은 염증성 유전 인자들이 관여하는 매우 복잡한 과정이다. 따라서, 염증성 매개 인자의 생성이나 유전 인자를 조절하는 물질은 염증 치료제로서 잠재적인 가능성이 있다.
Kaempferol-7-O-β-D-glucoside가 세포 독성을 나타나지 않으며 NO 및 PGE2 생성 억제 효과를 나타내는 농도를 고려하여, 10, 20 및 40 µg/ml에서 염증 반응의 지표인 TNF-α, IL-1β, IL-6등의 염증성 사이토카인 생성 양을 측정해 본 결과, kaempferol-7-O-β-D-glucoside가LPS로 유도된 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생성을 농도의존적으로 저해하였다(Fig. 2).
Kaempferol-7-O-β-D-glucoside의 PGE2 생성 억제 효과를 확인한 결과, IC50 값이 5.82 µg/ml로 우수한 억제 효과를 보였으며 상대적으로 kampferol, quercetin 및 quercetin-3-α-L-arabinoside의 IC50 값은 각각 7.85, 6.79 및 39.07 µg/ml을보였다(Table I).
LPS로 자극한 RAW 264.7 대식세포에서 NO 생성 억제효과가 뛰어난 kaempferol, kaempferol-7-O-β-D-glucoside, quercetin 및 quercetin-3-α-L-arabinoside 중, kaempferol-7-O-β-D-glucoside의 PGE2 생성 저해 효과가 제일 우수 하였다.
비배당체의 경우, 당이 결합한 배당체보다 극성이 낮기 때문에 세포막을 쉽게 통과하므로 활성이 높게 나타난다. 그러나 실험 결과를 살펴보면, kaempferol의 7번 위치에 1개의 glucose가 결합한 배당체는 비배당체보다 우수한 활성이 관찰되는 반면, 비배당체의 3번 위치에 glucose, rhamnose, xylose등의 당이 결합하거나 xyloxyl-galactose와 rhamnose-rhamnose등의 2개의 당이 결합한 배당체의 경우에는 NO의 생성 저해활성이 비배당체보다 낮았다. 이러한 구조적 특징 및 앞서 실험한 화합물의 세포 독성 및 NO 생성 억제 효과를 고려했을 때, kaempferol-7-O-β-D-glucoside의 NO 생성 저해 효과가 가장 우수하여 추가적인 LPS유도 PGE₂ 및 항염증 사이토카인 생성 억제 실험을 진행하였다.
본 실험의 결과를 종합해 보면, kaempferol, quercetin 및 이들의 배당체 화합물들은 모두 농도 의존적인 NO 생성 억제 효과를 보이고 있다. 총 16 가지의 화합물을 가지고 실험을 진행하였으며, 그 중 4 가지 화합물(kaempferol-7-O-β-D-glucoside, kaempferol, quercetin, quercetin-3-α-L-arabinoside)이 실험 농도에서 LPS로 유도된 NO의 생성을 50% 이상 저해함으로써 우수한 활성을 보였다.
본 연구 결과를 종합해보면, flavonoid계 성분들은 LPS로 활성화된 RAW 264.7 대식세포에서 염증성 매개 인자들을 억제하는 효과가 있었으며, 그 중 kaempferol-7-O-β-D-glucoside가 가장 뛰어난 염증 유발 물질의 억제효과를 나타내었다.
실험 결과, 대부분의 화합물들은 모두 2, 10, 50, 100 μg/ml의 농도로 처리하였을 때, 80~100%의 세포 생존율을 보여 세포 독성이 거의 없음을 확인하였다.
실험을 진행하는 과정에서, 화합물의 세포 독성이 염증 발생을 억제하는 비특이적인 억제 작용을 배제하기 위해, 각 화합물이 독성을 나타내지 않는 농도에서 LPS에 유도되어 생성되는 NO 양의 생성 억제를 측정한 결과,모든 화합물이 농도의존적으로 NO 생성을 억제하였으나, kaempferol, kaempferol-7-O-β-D-glucoside, quercetin 및 quercetin-3-α-L-arabinoside의 4가지 화합물이 NO 생성을 50% 이상 억제하는 뛰어난 효과를 보였다(Table I).
총 16 가지의 화합물을 가지고 실험을 진행하였으며, 그 중 4 가지 화합물(kaempferol-7-O-β-D-glucoside, kaempferol, quercetin, quercetin-3-α-L-arabinoside)이 실험 농도에서 LPS로 유도된 NO의 생성을 50% 이상 저해함으로써 우수한 활성을 보였다.

후속연구

따라서, kaempferol-7-O-β-D-glucoside가 항염증 활성을 나타내는 메커니즘에 대해 추가적인 연구를 진행한다면, 각 화합물이 영향을 미치는 메커니즘을 표적으로 하는 염증 치료제로서의 가능성을 확인할 수 있을 것이다. 더불어, 이들이 배당체임에도 불구하고 뛰어난 활성을 나타내는 이유를 구조적인 특징과 연관시킬 수 있다면 더욱 의미 있는 연구가 될 것으로 보인다.
따라서, kaempferol-7-O-β-D-glucoside가 항염증 활성을 나타내는 메커니즘에 대해 추가적인 연구를 진행한다면, 각 화합물이 영향을 미치는 메커니즘을 표적으로 하는 염증 치료제로서의 가능성을 확인할 수 있을 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	염증이란 무엇인가?	염증이란 외부 자극에 대한 생체 조직의 방어 반응의 하나로, 발열, 통증, 홍반 및 조직 손상, 장기의 기능 장애를 수반하는 선천적 면역반응의 일종이다. 일반적으로 조직 내에 병원체가 침입하거나 자극이 가해지면, 국소적으로histamine, prostaglandins, leukotriene 및 kinin 등의 물질이 유리된다.
	Flavonoid를 C3 단위의 형태에 따라 분류하면?	Flavonoid는 식물에 널리 함유되어 있는 황색 계통의 식물 색소로, 환상 구조의 페닐기(C6) 2개가 C3 사슬을 매개하여 결합한 C6-C3-C6형 탄소 골격 구조를 갖는 물질이다. 일반적으로 C3 단위의 형태에 따라 flavonol, flavone, flavanone, flavanonol, flavan, anthocyanin, anthocyanidin, chalcone 등으로 나뉜다. 또한 3개의 고리 중에서 B 환이 결합된 위치에 따라 isoflavonoid 및 neoflavonoid 등으로 분류한다.
	flavonoids계 화합물에서 항산화 활성을 조절하는 인자는 무엇인가?	Flavonoids가 다양한 구조를 갖는 것과 더불어, 구조적인 차이에 따라 활성이 달라진다는 것이 보고 되었다.3) 일반적으로 flavonoids계 화합물들은 모두 항산화 작용을 갖는데, flavonoids 구조 중 B 환의 히드록실기의 배열 형태가 항산화 활성을 조절하는 중요한 인자이다.3,4) Flavonol glycosides, isoflavones, flavanones, chalchones 등은 항박테리아 활성을 갖는 것으로 알려져 있는데, flavanone 구조에서 A 환의 5번, 7번 위치의 산화나 B 환의 2번, 4번 또는 2번, 6번 위치의 산화는 항 MRSA(methicilline resistant Staphylococcus aureus) 활성을 나타내는 데 중요하다고 알려져 있다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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