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문제 정의
- 하지만 피부 안정성 등의 문제가 알려지게 되면서 비교적 안전성이 높은 천연물 소재의 기능성 제품 개발이 요구되고 있으며, 천연물 및 한방 추출물을 이용한 화장품은 꾸준히 인기를 끌고 있다. 따라서 본 연구는 천연 작물 소재인 흰목이버섯 추출물에 대한 미백 및 주름개선 효능을 평가하여 향후에 기존보다 안전성 높고 효과적인 제품화 소재로 이용하기 위해 진행하였다.
- 본 연구는 흰목이버섯 추출물의 미백 및 주름개선 효능을 증명하기 위해 melanin 생성 억제 및 tyrosinase 활성 및 미백관련유전자 발현을 분석하였고, collagen 합성 증가 및 collagen 분해효소 억제를 확인하였다. Melanin 세포는 자외선 (UV)에 일정 이상 노출되면 melanocortin peptide 인 α-MSH (melanocyte stimulating hormone) 및 ACTH (adrenocorticotropic hormone) 를 분비하게 된다 (Thody and Graham, 1998).
제안 방법
- 2 - 1,000 ㎍/㎖ 범위에서 처리하였다. 100℃ 추출물에서는 독성이 없었으나 80℃ 추출물에서는 500 ㎍/㎖ 농도부터 세포 생존율에 영향이 있으므로, 모든 실험은 높은 생존율을 보이는 500 ㎍/㎖ 이하 농도에서 진행하였다 (Fig. 2).
- 클로로포름 200 ㎕ 를 넣고 다시 교반하여 13,000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리한 후 상등액 500 ㎕에 이소프로판올을 가하여 다시 원심 분리하여 RNA pellet을 얻었다. 5 ㎍ 의 mRNA를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Appiled biosystem, Foster city, CA, USA)를 이용하여 cDNA로 합성을 하였다. 합성된 cDNA 1 ㎕, taqman primer 1 ㎕, Taqman Universal Master Mix II (Appiled biosystem, Foster city, CA, USA) 10 ㎕, 3차 증류수 8 ㎕ 를 넣고 realtime PCR 기기 (ABI7500, Applied biosystem, Foster city, CA, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
- 96 well plate에 5 × 104cells/㎖ 로 분주하였고 Media-FBS 10% 조건에서 각 시료 추출물을 농도별로 72시간 처리하였다.
- 흰목이버섯 추출물이 melanin 형성 과정 중 억제효과를 나타내는지 규명하기 위해 tyrosinase의활성을 확인하였다. B16F10 melanoma cell에서 각 시료를 농도별로 처리하여 72시간 후 측정하였으며, 대조군으로는 kojic acid (100 ㎍/㎖)를 사용하였고 모든 결과는 blank 대비 백분율로 나타내었다. 80℃ 추출물에서 melanin 함량은 농도 의존적으로 감소했으나, 100℃ 추출물에서는 효능을 보이지 않았다.
- 각 흰목이버섯 추출물이 세포 생존율에 영향을 주는지 검사 하기 위해서 B16F10 및 HDFn 세포에 각 추출물을 처리하고 MTS assay 방법으로 생존율을 측정하였다. 각 흰목이버섯 추출물의 농도는 31.
- 정량 중합 효소 반응에 쓰인 TaqMan gene은 Appiled biosystem에서 검색하여 주문 후 사용하였다. 또한 real-time PCR 반응 조건은 50℃에서 2분 95℃에서 10분 동안 1회 수행하고, 변성 온도 95℃에서 15초, annealing 온도 60℃에서 15초인 사이클을 40회 반복 수행하였다.
- 모든 추출물들은 Rotary evaporator (NE-1001V, Eyela, Tokyo, Japan)를 이용 수조 온도 70℃로 감압 농축하고 동결건조기 (PVTFD20A, Ilshin, Dongducheon, Korea)를 이용하여 콜드 트랩 온도를 −70℃ 기본설정으로 하여 동결건조를 실시하였다.
- 미백관련 인자 발현에 미치는 영향을 검증하기 위해 B16F10 세포를 6 well plate에 1 × 10 cells/well로 분주하여 안전화 시킨 후 다양한 농도의 시료를 1시간 처리한 후 α-MSH (100 nM)로 melanin 생성을 유도하여 24시간 뒤에 세포를 수확하였다.
- 4℃, 15,000 rpm에서 30분간 원심분리를 하여 얻은 상층액을 tyrosinase 활성측정 용액으로 사용하였고, Bradford 법으로 (Bradford, 1976) 595 ㎚에서 흡광도를 측정하여 동량의 단백질 양을 계산하였다. 시료 50 ㎕ 와 10 mM L-DOPA 50 ㎕ 를 분주하여 혼합한 후 37℃에서 30분 반응시킨 뒤 ELISA reader (BMG Labtech, Offenburg, Germany)를 이용하여 490 ㎚ 의 파장으로 흡광도를 측정하였다. Melanin 함량은 lysis buffer를 이용하여 세포를 용해한 뒤 4℃, 15,000 rpm에서 30 분간 원심분리를 한 후 세포 침전물을 이용하였다.
- 이 중 MITF는 melanin 합성과정에 중요한 전사 조절 인자로 TRP-1과 Dct 의 전사과정을 촉진한다고 알려져 있다 (Liu and Fisher, 2010; Olivares and Solano, 2009). 앞선 결과에서 더 좋은 효능을 보인 80℃ 추출물을 이용하여 melanin 합성관련 인자인 MITF, TRP-1, Dct의 발현 정도를 측정하였다. 흰목이버섯 80℃ 추출물이 melanin 합성관련 인자인 MITF, TRP-1, Dct 발현을 모두 유의성 있게 감소시켰다 (Fig.
- , 2015). 이와 관련하여 흰목이버섯 추출물이 주름개선 효능이 있는지 알아보기 위해 procollagen 및 MMP-1의 변화를 측정하였다. 그 결과 흰목이 버섯 추출물은 procollagen 합성을 촉진하는 것으로 나타났으며, MMP-1 유전자를 효과적으로 감소시킴을 확인하였다.
- 주름 관련 인자 발현을 확인하기 위해 HDFn 세포를 6 well plate에 1 × 10 cells/well 세포로 분주하여 안정화시킨 후 다양한 농도의 시료를 1시간 처리한 후 UV (300 mJ/㎠)를 처리하여 주름 형성 관련 유전자를 유도하여 24시간 후에 세포를 수확하였다.
- 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu’s phenol (F9252, Sigma, St. Louis, MO, USA) 시약을 각각 160 ㎕ 를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다.
- 총 플라보노이드 함량은 96 well plate에 농도별 시료 10 ㎕ 에 10% aluminum nitrate (237973, Sigma, St. Louis MO, USA)와 1 M potassium acetate (236497, Sigma, St. Louis, MO, USA)를 각각 4 ㎕, methanol을 82 ㎕ 를 첨가한 뒤 40분간 암실에서 반응 한 뒤 415 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질의 검량선 작성을 위해 rutin (R5143, Sigma, St. Louis, MO, USA)을 이용하였다.
- , 2011). 폴리페놀 함량을 gallic acid, 총 플라보노이드 함량은 rutin을 기준물질로 하여 측정하였다. 80℃와 100℃ 추출물에서의 각 폴리페놀 함량은 12.
- 5 ㎍ 의 mRNA를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Appiled biosystem, Foster city, CA, USA)를 이용하여 cDNA로 합성을 하였다. 합성된 cDNA 1 ㎕, taqman primer 1 ㎕, Taqman Universal Master Mix II (Appiled biosystem, Foster city, CA, USA) 10 ㎕, 3차 증류수 8 ㎕ 를 넣고 realtime PCR 기기 (ABI7500, Applied biosystem, Foster city, CA, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 정량 중합 효소 반응에 쓰인 TaqMan gene은 Appiled biosystem에서 검색하여 주문 후 사용하였다.
- , 2015). 흰목이 버섯 추출물이 MMP-1을 저해하여 이러한 효능이 있는지 알아보기 위해 mRNA 발현을 확인하였다. 그 결과 100℃ 추출물에서는 가장 높은 농도에서 유의적인 감소를 보였으며, 80℃ 추출물에서는 농도의존적으로 모든 농도에서 유의적으로 MMP-1을 감소시켰다 (Fig.
- 즉 프로펩타이드의 양을 측정하여 세포내에서의 collagen 생합성정도를 파악할 수 있다. 흰목이 버섯을 이용하여 collagen 합성 실험을 진행하였고, 100℃ 추출물에서는 큰 변화는 보이지 않았지만 80℃ 추출물에서는 125 ㎍/㎖ 농도에서부터 유의적으로 procollagen 합성이 증가 하였다 (Fig. 6). 이는 노간주나무의 주름개선 효과를 증명한 연구논문 (Jun et al.
- 흰목이버섯 시료를 200 g씩 정량하여 열수추출물은 각각 80℃와 100℃ 환류추출기를 이용하여 추출하였다.
- 앞서 언급되었듯이 tyrosinase 활성에 관여하는 중요한 전사 인자인 MITF는 melanin 합성을 위해 관련된 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 등 유전자 발현을 증가시킨다 (Liu and Fisher, 2010; Olivares and Solano, 2009). 흰목이버섯 추출물에 의한 tyrosinase 억제효능과 관련하여 그 기전에 관련된 인자들인 MITF, TRP-1, DCT 유전자 발현을 확인하였다. 그결과 melanin 형성에 관련된 전사인자들의 유전자 발현을 흰목이버섯 추출물에 의해 감소시킴을 확인할 수 있었다.
- , 2000). 흰목이버섯 추출물이 melanin 형성 과정 중 억제효과를 나타내는지 규명하기 위해 tyrosinase의활성을 확인하였다. B16F10 melanoma cell에서 각 시료를 농도별로 처리하여 72시간 후 측정하였으며, 대조군으로는 kojic acid (100 ㎍/㎖)를 사용하였고 모든 결과는 blank 대비 백분율로 나타내었다.
대상 데이터
- B16F10 과 HDFn 세포는 한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양 받았으며, penicillin/streptomycin 100 unit/㎖ (10378, Invitrogen, Grand Island, NY, USA) 과 10% FBS (16000, Invitrogen, Grand Island, NY, USA) 가 함유된 DMEM 배지 (11995, Invitrogen, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator (MCO-17A1, Sanyo, Osaka, Japan)에서 배양하였다.
- 합성된 cDNA 1 ㎕, taqman primer 1 ㎕, Taqman Universal Master Mix II (Appiled biosystem, Foster city, CA, USA) 10 ㎕, 3차 증류수 8 ㎕ 를 넣고 realtime PCR 기기 (ABI7500, Applied biosystem, Foster city, CA, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 정량 중합 효소 반응에 쓰인 TaqMan gene은 Appiled biosystem에서 검색하여 주문 후 사용하였다. 또한 real-time PCR 반응 조건은 50℃에서 2분 95℃에서 10분 동안 1회 수행하고, 변성 온도 95℃에서 15초, annealing 온도 60℃에서 15초인 사이클을 40회 반복 수행하였다.
- 그 후 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리 하였으며 상등액을 이용하여 750 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질의 검량선 작성을 위해 gallic acid (G7384, Sigma, St. Louis, MO, USA)를 이용하였다.
데이터처리
- Different letters (a - c) are significantly difference between groups based on one-way ANOVA with Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) at p < 0.05 post hoc.
- Different letters (a - d) are significantly difference between groups based on one-way ANOVA with Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) at p < 0.05 post hoc.
- Different letters (a - e) are significantly difference between groups based on one-way ANOVA with Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) at p < 0.05 post hoc.
- Different letters (a - f) are significantly difference between groups based on one-way ANOVA with Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) at p < 0.05 post hoc.
- 또한 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, 유의성이 있는 경우 p < 0.05 수준에서 Duncan’s Multiple Range Test (DMRT)로 사후 검정하였다.
- 실험에서 얻어진 결과의 통계적 유의성은 SPSS (18.0, Statistical Package for Social Sciences, Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을 이용하여 일원변량분석 (One way ANOVA) 을 시행하였다. 또한 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, 유의성이 있는 경우 p < 0.
이론/모형
- 72시간 후 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척한 후 lysis buffer를 이용하여 세포를 용해하였다. 4℃, 15,000 rpm에서 30분간 원심분리를 하여 얻은 상층액을 tyrosinase 활성측정 용액으로 사용하였고, Bradford 법으로 (Bradford, 1976) 595 ㎚에서 흡광도를 측정하여 동량의 단백질 양을 계산하였다. 시료 50 ㎕ 와 10 mM L-DOPA 50 ㎕ 를 분주하여 혼합한 후 37℃에서 30분 반응시킨 뒤 ELISA reader (BMG Labtech, Offenburg, Germany)를 이용하여 490 ㎚ 의 파장으로 흡광도를 측정하였다.
- Cytotoxicity of Tremella fuciformis extracts on the (A); B16F10 melanocyte and (B); HDFn cells. Cell cytotoxicity was evaluated with the MTS assay. Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown.
- Lysis buffer 200 ㎕ 를 첨가하여 세포를 용해 시키고 15,000 rpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 세포막 성분들을 제거하였다. 원심분리하여 얻은 단백질을 Bradford 법으로 (Bradford, 1976) 정량하였으며, 30 ㎍의 단백질을 10% SDS-PAGE를 이용하여 전기 영동한 후 PVDF membrane에 transfer 하였다. Transfer가 끝나면 TBST buffer로 2회 이상 씻은 후 꺼내서 5% skin milk로 blocking 하였다.
성능/효과
- 폴리페놀 함량을 gallic acid, 총 플라보노이드 함량은 rutin을 기준물질로 하여 측정하였다. 80℃와 100℃ 추출물에서의 각 폴리페놀 함량은 12.11 ㎎/g, 8.54 ㎎/g으로 나타났으며 플라보노이드 함량은 11.12 ㎎/g, 5.05 ㎎/g으로 확인되었다. 즉, 80℃ 추출물이 100℃ 추출물에 비해 더 많은 양의 폴리페놀 및 플라보노이드를 함유하고 있는 것으로 확인되었다 (Fig.
- 80℃ 추출물에서 melanin 함량은 농도 의존적으로 감소했으나, 100℃ 추출물에서는 효능을 보이지 않았다. tyrosinase 저해활성을 확인할 결과에서도 80℃ 추출물에서 62.5 ㎍/㎖ 농도부터 농도 의존적으로 감소하였고 100℃ 추출물에서는 저해효과를 보이지 않았다 (Fig. 3). 기존의 천연물 중의 하나인 미선나무 추출물의 결과 (Kim and Lee, 2015b) 에서 최대 25% 정도 저해효과를 보인 것에 비해 흰목이버섯 추출물이 월등한 저해효과를 나타내고 있기 때문에 다른 천연물 이상의 효과가 있음을 시사한다.
- 결과를 요약하면, 흰목이버섯 추출물이 B16F10 세포에서 tyrosinase 효소 활성을 저해하였고 melanin 합성 인자들을 조절함을 통하여 melanin 함량을 감소시킴을 확인할 수 있었으며, 추가적으로 HDFn 세포에서 procollagen 합성을 증가시켰고 이를 분해하는 효소는 반대로 억제함을 나타내었다. 또한 추출온도와 처리농도를 다르게 설정하여 가장 효능이 좋은방법을 모색하고자 하였고 결과적으로 80℃ 추출물에서 250 ㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때 가장 뛰어난 미백 및 주름 개선 효과를 보였다.
- 4). 결과를 종합해 보면 흰목이 버섯 80℃ 추출물에 의해 tyrosinase 활성이 감소함을 확인하였으며, 이로 인해 melanin 합성이 저해되어 총 melanin 함량이 감소하는 효과를 나타내는 것으로 예상할 수 있다. 특히 그 농도가 높아짐에 따라 더 좋은 효능을 보이는 것으로 확인되었다.
- 흰목이 버섯 추출물이 MMP-1을 저해하여 이러한 효능이 있는지 알아보기 위해 mRNA 발현을 확인하였다. 그 결과 100℃ 추출물에서는 가장 높은 농도에서 유의적인 감소를 보였으며, 80℃ 추출물에서는 농도의존적으로 모든 농도에서 유의적으로 MMP-1을 감소시켰다 (Fig. 7). 우산고로쇠의 화장품효능에 대한 연구논문에서도 MMP-1 발현을 억제함을 증명하였다 (Sohn et al.
- 이와 관련하여 흰목이버섯 추출물이 주름개선 효능이 있는지 알아보기 위해 procollagen 및 MMP-1의 변화를 측정하였다. 그 결과 흰목이 버섯 추출물은 procollagen 합성을 촉진하는 것으로 나타났으며, MMP-1 유전자를 효과적으로 감소시킴을 확인하였다.
- 흰목이버섯 추출물에 의한 tyrosinase 억제효능과 관련하여 그 기전에 관련된 인자들인 MITF, TRP-1, DCT 유전자 발현을 확인하였다. 그결과 melanin 형성에 관련된 전사인자들의 유전자 발현을 흰목이버섯 추출물에 의해 감소시킴을 확인할 수 있었다. Collagen은 피부를 구성하는 주요단백질로 피부노화와 주름생성에 밀접한 관계이므로 collagen 생성 및 유지는 피부건강에 중요다고 알려져 있으며 MMP-1은 collagenase 역할을 하는 피부주름 생성의 큰 원인임이 밝혀져 있다 (Brenneisen et al.
- 결과를 요약하면, 흰목이버섯 추출물이 B16F10 세포에서 tyrosinase 효소 활성을 저해하였고 melanin 합성 인자들을 조절함을 통하여 melanin 함량을 감소시킴을 확인할 수 있었으며, 추가적으로 HDFn 세포에서 procollagen 합성을 증가시켰고 이를 분해하는 효소는 반대로 억제함을 나타내었다. 또한 추출온도와 처리농도를 다르게 설정하여 가장 효능이 좋은방법을 모색하고자 하였고 결과적으로 80℃ 추출물에서 250 ㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때 가장 뛰어난 미백 및 주름 개선 효과를 보였다.
- 흰목이버섯 추출물은 α-MSH를 처리하여 melanin 생성이 유도된상태에서 농도 의존적으로 melanin 생성을 억제하였으며, 기존 효과가 알려진 양성대조군으로 kojic acid 100 ㎍/㎖ 를 처리했을 때보다 유사하거나 월등한 melanin 억제 효능을 나타내었다. 이어서 melanin 생성에 관여하는 tyrosinase 활성을 측정했을 때도 흰목이버섯 추출물은 양성대조군인 kojic acid와 유사하거나 뛰어난 tyrosinase 활성 억제 및 단백질 발현 억제 효과를 보였다.
- , 2013). 이와 같은 결과로 흰목이버섯의 80℃ 추출물은 유의적으로 MMP-1 발현을 억제하여 collagen 활성을 유지 및 증가시켜 피부에 도움을 줄 것으로 예상할 수 있다.
- 05 ㎎/g으로 확인되었다. 즉, 80℃ 추출물이 100℃ 추출물에 비해 더 많은 양의 폴리페놀 및 플라보노이드를 함유하고 있는 것으로 확인되었다 (Fig. 1). 최근 연구에 식물 추출물에서 페놀함량에 비례하게 항산화 효능을 나타내어 (Suh et al.
- 결과를 종합해 보면 흰목이 버섯 80℃ 추출물에 의해 tyrosinase 활성이 감소함을 확인하였으며, 이로 인해 melanin 합성이 저해되어 총 melanin 함량이 감소하는 효과를 나타내는 것으로 예상할 수 있다. 특히 그 농도가 높아짐에 따라 더 좋은 효능을 보이는 것으로 확인되었다. 또한 최근에 대추 및 포도 발효물에 대한 미백관련연구 (Park et al.
- 앞선 결과에서 더 좋은 효능을 보인 80℃ 추출물을 이용하여 melanin 합성관련 인자인 MITF, TRP-1, Dct의 발현 정도를 측정하였다. 흰목이버섯 80℃ 추출물이 melanin 합성관련 인자인 MITF, TRP-1, Dct 발현을 모두 유의성 있게 감소시켰다 (Fig. 5). 이는 환초석곡 메탄올 추출물에 대한 연구 결과 (Jung et al.
- 흰목이버섯 추출물은 α-MSH를 처리하여 melanin 생성이 유도된상태에서 농도 의존적으로 melanin 생성을 억제하였으며, 기존 효과가 알려진 양성대조군으로 kojic acid 100 ㎍/㎖ 를 처리했을 때보다 유사하거나 월등한 melanin 억제 효능을 나타내었다.
후속연구
- 이러한 연구결과를 통하여 흰목이버섯 추출물은 미백 기능성을 보이며 효과적으로 주름을 개선할 수 있는 화장품 및 다양한 소재로 사용할 수 있을 것으로 예상되며, 식용이 가능한 천연작물소재를 이용하기 때문에 현대인들이 신뢰하는 안전한 제품이 될 수 있을 것으로 기대된다.
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