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문제 정의
- 이러한 연구결과들을 바탕으로 높은 항산화능을 가진 물질이 암세포의 사멸에도 긍정적인 영향을 미칠 것으로 예상하였다. 이에 본 연구에서는 SIE, PME 및 SBE의 처리가 전립선 암세포의 성장억제에 미치는 영향을 알아보기 위하여 뼈에 전이된 형태인 안드로겐 비민감성 PC-3 세포와 림프절에 전이된 형태인 안드로겐 민감성 LNCaP 세포의 성장억제 효과를 SRB assay를 이용하여 확인하였다(Fig. 3). PC-3 및 LNCaP 세포에 각각의 추출물들을 농도별로 희석하여 처리하였을 때 SIE 및 PME는 대조군과 비교하여 250~1,000 μg/mL의 농도에서 유의적인 세포사멸을 나타내었다(Fig.
- 이에 본 연구에서는 대표적으로 섭취되는 잡곡인 조, 기장 및 수수의 항산화 및 암세포 성장 억제 효과를 알아보았으며, 이들의 총 폴리페놀 함량을 측정하여 생리활성과의 상관관계를 비교분석 하였다.
제안 방법
- 본 실험에 사용된 조, 기장, 수수는 ‘황금조’, ‘황금기장’, ‘황금찰’ 품종으로 2015년에 농촌진흥청 국립식량과학원에서 제공받아 4℃에 냉장보관 후 사용하였다. 각각 분쇄기로 마쇄한 후 분말 시료의 20배(w/v)량 94% 에탄올(SK Chemicals Co., Ltd., Seongnam, Korea)을 혼합한 후 24시간 추출하여 여과하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 여과액을 회전감압농축기(EYELA, Tokyo Rikakikai Co.
- 본 연구진들의 시료인 SIE, PME 및 SBE의 항산화능을 측정하기 위해 합성 항산화제인 BHT와 천연 항산화제인 α -tocopherol 및 ascorbic acid를 양성 대조구로 이들의 항산화 활성을 비교분석한 결과를 Fig. 1 및 2에 나타내었다.
- 5 mL의 trichloroacetic acid(10%, w/v)를 첨가하여 섞은 후, 3,000 rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 상층액의 1 mL을 취해 시험관에 담고 1 mL의 증류수와 0.2 mL의FeCl3(0.1%, w/v)을 첨가하여 흡광도 700 nm에서 UV/Visspectrophotometer(U-1800, Hitachi)를 이용하여 환원력을 측정하였다.
- 005 정도가 되도록 조정하였다. 시료 0.1 mL 와 3.9 mL ABTS 용액을 혼합한 후, 23℃에서 6분간 반응시킨 후 734 nm에서 UV/Vis-spectrophotometer(U-1800, Hitachi)로 흡광도를 측정하였다. ABTS+ 라디칼 소거능은 다음의 식에 따라 계산하였다.
- 시료들의 환원력은 Yildirim 등(26)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 2.
- 시료에 대한 ABTS+ 소거활성은 Biglari 등(25)의 방법을 변형하여 측정하였다. 7 mM의 2,2'-Azobi(2-aminopropane) dihydrochloride(Sigma-Aldrich Co.
- 암세포 증식 억제능은 각각의 세포를 2×104cells/mL가 되도록 희석하여 48 well plate에 분주한 다음 37°C, 5% CO2 incubator에서 24 시간 배양한 후, SIE, PME, SBE를 농도별로 첨가하고 24 시간 동안 반응시켰다.
- )을 첨가하여 실온에서 10분간 염색시킨 후 PBS로 2회 세척하였다. 염색된 핵을 형광현미경으로 관찰하였다.
- , Seongnam, Korea)을 혼합한 후 24시간 추출하여 여과하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 여과액을 회전감압농축기(EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 농축하여 조추출물(Setaria italica ethanol extract, SIE), 기장추출물(Panicum miliaceum ethanol extract, PME)및 수수추출물(Sorghum bicolor ethanol extract, SBE)을 얻었다.
- incubator에서 24시간 배양하여 각각 추출물을 500 μg/mL의 농도로 well plate에 처리하고 24시간 동안 반응시켰다. 이후 세포의 형태학적 변화는 200배율의 광학현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)으로 관찰하고 사진을 촬영하였다.
- 5 mg/g 정도의 페놀화합물을 함유되어 있다고 보고하였으며, 본 연구에서 측정한 SIE, PME 및 SBE의 폴리페놀 함량이 대체로 높은 수준으로 확인되었다. 이후 항산화 및 항암효능을 평가하여 SIE, PME 및 SBE의 폴리페놀 함량과 생리활성효능의 관련성을 알아보았다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 조, 기장, 수수는 ‘황금조’, ‘황금기장’, ‘황금찰’ 품종으로 2015년에 농촌진흥청 국립식량과학원에서 제공받아 4℃에 냉장보관 후 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 LNCaP 세포 및 PC-3 전립선암세포주는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받아 100 unit/mL의 Antibiotic Antimycotic(GIBCO® /InvitrogenTM , Gran Island, NY, USA)와 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 첨가된 DMEM(GIBCO® /InvitrogenTM )을 이용하여 37℃, 5% CO2 incubator(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)에서 계대 배양하여 사용하였다.
데이터처리
- 각 군 간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's t-test를 실시하여 유의성 여부를 판정하였다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
- 실험결과는 3 반복에 대한 평균 및 표준편차로 표시하였으며, 각 실험군을 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 각 군 간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's t-test를 실시하여 유의성 여부를 판정하였다(*p<0.
이론/모형
- 각 추출물의 농도별에 대한 1,1-Diphenyl-β-picrylhydrazine (DPPH, Sigma-Aldrich Co.)라디칼에 대한 소거효과는 Blois(24)의 방법에 준하여 측정하였다.
- 암세포 증식 억제능은 sulforhodamine B(SRB, Sigma Aldrich Co.)법을 이용하여 측정하였다. SRB assay는 생존 세포 내의 단백질 총량을 흡광도로 나타내어 세포 사멸 정도를 확인하는 방법으로 trichloroacetic acid(TCA, SigmaAldrich Co.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalten 방법에 따라 측정하였다(23). 즉, 시료 0.
성능/효과
- 10 및 100 μg/mL 농도에서는 SIE, PME 및 SBE 모두 비교적 낮은 활성을 보였으나, 1,000 μg/mL의 농도에서 SBE가 양성대조군과 비교할 때 39%의 활성을 나타내었다(Fig. 2B).
- PC-3 및 LNCaP 세포에서 500 μg/mL의 농도로 SIE 및 PME를 처리하였을 때 세포형태가 대조군과 유사하게 유지되는 것으로 확인되었다(Fig. 4A 및 B).
- SIE, PME 및 SBE에 대한 항산화 및 항암효능이 폴리페놀 함량과 연관이 있는지 알아보기 위해 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과는 Table 1과 같다. SIE, PME 및 SBE의 폴리페놀 함량은 각각 2.04, 1.71 및 29.71 mg GAE/g으로 확인되었으며 SBE가 SIE 및 PME보다 폴리페놀 함량이 높은 것으로 나타났다. Kim 등(30)은 곡류에 약 0.
- SIE를 가장 높은 농도인 1,000 μg/mL로 처리하였을 때 PC-3 세포에서 76.65%, LNCaP 세포에서 74.25%의 세포생존율을 나타내었으며 PME는 PC-3 세포에서 62.15%, LNCaP 세포에서 64.41%의 세포생존율을 보였다.
- 반면 SBE를 농도별로 처리하였을 때 LNCaP 세포의 경우 비교적 낮은 농도인 10 μg/mL에서부터 유의적인 세포 성장 억제 효과를 나타내었으며 PC-3세포는 500 μg/mL의 농도에서 유의적인 세포성장 억제효능을 확인할 수 있었다(Fig. 3C).
- Laidler 등(37)에 따르면 안드로겐 민감성이 다른 전립선 암세포주에 docetaxel을 처리한 결과 안드로겐 민감성 LNCaP 세포의 사멸율이 비민감성 PC-3 세포보다 높게 나타났으며 항암활성을 갖는 물질과 안드로겐 수용체의 발현유무가 암세포의 사멸에 밀접한 연관이 있다고 보고하였다. 본 연구결과는 SIE, PME 및 SBE 중에서 SBE가 가장 뛰어난 전립선 암세포 증식억제효능을 가지는 것으로 나타났다. 특히, SBE에 의한 전립선 암세포 성장 억제효과는 안드로겐 의존성 암세포에서 특이적으로 유도된다는 결과를 보았을 때 수수의 생리활성 물질이 안드로겐 수용체 의존성 세포사멸과 연관이 있을 것으로 생각된다.
- 본 연구에서 SIE, PME 및 SBE의 ABTS radical 소거능은 대조구와 비교하여 1,000 μg/mL의 농도에서 각각 4.9%, 4.8%, 62.3%의 활성을 나타내어 SBE가 가장 높게 나타났으며 이는 DPPH radical 소거활성과 비슷한 경향을 보였다 (Fig. 1B).
- 암은 정상조직 내 활성산소의 과도한 축적에 의해 정상 세포 및 DNA 손상이 발생하고 감염, 노화, 유전자 돌연변이 등이 유도되어 세포사멸이 억제됨에 따라 암세포로 변화되는 것으로 알려져 있다(35,36). 이러한 연구결과들을 바탕으로 높은 항산화능을 가진 물질이 암세포의 사멸에도 긍정적인 영향을 미칠 것으로 예상하였다. 이에 본 연구에서는 SIE, PME 및 SBE의 처리가 전립선 암세포의 성장억제에 미치는 영향을 알아보기 위하여 뼈에 전이된 형태인 안드로겐 비민감성 PC-3 세포와 림프절에 전이된 형태인 안드로겐 민감성 LNCaP 세포의 성장억제 효과를 SRB assay를 이용하여 확인하였다(Fig.
- 2B). 전반적으로 SIE, PME 및 SBE의 항산화능은 양성대조군들과 비교하여 낮은 수치를 기록하였지만, 폴리페놀 함량이 가장 높았던 SBE가 SIE 및 PME보다 대체적으로 높은 항산화 활성을 보였다. Ko 등(34)은 발아온도에 따른 조, 기장 및 수수 추출물의 항산화 활성을 비교하였을 때, 조 및 기장보다 수수 추출물의 항산화능이 높게 나타났다고 보고하였다.
- 추출물들의 DPPH 라디칼 소거활성은 SBE를 제외하고는 활성을 나타내지 않았으며, SBE는 농도의존적으로 활성이 증가하여 1000 μg/mL의 농도에서 양성대조구과 유사한 활성을 나타내었다(Fig. 1A).
- 추출물들의 환원력은 양성대조구와 비교하였을 때 1,000 μg/mL의 농도에서 1.71의 흡광도 값을 나타낸 SBE만이 활성을 보였으며 SIE와 PME의 경우, 각각 0.15, 0.18의 흡광도를 나타내어 환원력의 활성이 매우 낮은 것으로 나타났다(Fig. 2A).
- 본 연구결과는 SIE, PME 및 SBE 중에서 SBE가 가장 뛰어난 전립선 암세포 증식억제효능을 가지는 것으로 나타났다. 특히, SBE에 의한 전립선 암세포 성장 억제효과는 안드로겐 의존성 암세포에서 특이적으로 유도된다는 결과를 보았을 때 수수의 생리활성 물질이 안드로겐 수용체 의존성 세포사멸과 연관이 있을 것으로 생각된다.
후속연구
- 과실류, 채소류 및 곡류를 많이 섭취할수록 여러 만성질병들을 예방할 수 있다고 보고되었으나 쌀과 함께 보리, 수수, 기장, 옥수수, 귀리, 조 등의 잡곡을 포함하는 곡류는 우리나라에서 주식으로 섭취되었음에도 불구하고 과실과 채소류에 비해 중요성에 대한 인식이나 관심은 상대적으로 낮다. 그러므로 국내에 생산되는 곡류에 대한 생리활성 연구들이 지속적으로 이루어져야 할 필요 성이 있으며, 국민의 건강한 식생활관리에 도움을 줄 수 있는 정확한 연구를 기반으로 산업적으로도 곡류를 이용한 기능성 소재 개발을 촉진할 필요가 있다고 사료된다. 현재 국내에서는 주로 현미, 율무, 메밀 등에 대한 몇몇의 생리활성 연구가 있을 뿐, 그 밖의 잡곡류에 대한 생리활성 연구보고는 미비한 실정이다(14).
- 이러한 연구들과 유사하게 SBE에 의한 안드로겐 의존성 전립선 암세포 성장억제효과는 apoptosis의 유발과 밀접한 연관이 있는 것으로 판단된다. 앞으로 수수의 항산화 효능과 암 억제 메커니즘에 대한 자세한 연구가 필요하 다고 사료되어지며, 이를 바탕으로 수수를 효과적인 기능성 식품원료로 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
- Ko 등(34)은 발아온도에 따른 조, 기장 및 수수 추출물의 항산화 활성을 비교하였을 때, 조 및 기장보다 수수 추출물의 항산화능이 높게 나타났다고 보고하였다. 이는 본 연구의 결과와 유사하였으며 이를 통해 조나 기장보다 폴리페놀 함량이 높은 수수를 섭취할 때 보다 높은 항산화능을 기대할 수 있을 것으로 판단된다.
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