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문제 정의
- 이는 큰느타리 WESMS로 병 저항성 SAR 신호전달 물질인 salicylic acid (SA) 축적에 따른 저항성 유도 발현을 추정할 수 있었다. 따라서 버섯 WESMS 처리에 따른 토마토 잎의 SA 함량 여부를 조사하였다. 표준물질은 salicylic acid (Sigma-Aldrich)을 사용하였다.
- 식물의 병 저항성 반응의 생화학적 변화는 salicylic acid 등 신호물질 증가와 phytoalexin생합성물질 증가이며 이들은 페놀 성분으로 구성되어 있으며 페놀 성분증가는 저항성 유도와 관련이 있는 것으로 보고되었다[18]. 따라서, WESMS 처리에 따른 토마토의 페놀 함량 변화를 조사하였다. 노루궁뎅이 WESMS 처리구는 페놀함량이 35.
- 본 연구는 국내 주요 생산 버섯 큰느타리버섯의 수확 후 배지를 이용하여 토마토 풋마름병균의 방제효과, 병 저항성 유도 및 식물 생장촉진 효과를 조사하여 큰느타리 수확 후 배지의 농업적 활용성을 제고하고자 한다.
가설 설정
- a)The WEMS indicates mushroom substrate, which was not inoculated with mushroom spawn.
제안 방법
- 큰느타리 WESMS의 토마토 유묘 성장 효과를 조사하기 위하여 토마토 종자를 pot (직경10 cm)에 파종하여 3주 경과 후 8엽기의 토마토 유묘를 사용하였다. WESMS 30 mL를 토마토 유묘 뿌리 주변에 관주 처리하고 15주 후에 초장, 엽장, 엽폭, 엽수, 줄기 및 뿌리 생체량을 측정하여 유묘 생육촉진 효과 여부를 조사하였다. 대조구로서는 큰느타리버섯 종균을 접종하지 않은 원배지(mushroom substrate, MS)로부터 동일한 방법으로 물 추출한 WEMS와 물을 사용하였다.
- 큰느타리 SMS는 큰느타리버섯 재배농가로부터 분양받아 사용하였다. 그 SMS로부터 유효성분을 추출하기 위하여 SMS:물(1:5 w/v) 비율로 하여 1시간 동안 90oC에서 열 처리하였다. SMS 혼합액을 2겹의 미라크로스로 거르고 7,000 × g에서 10분 동안 원심 분리하여 상등액을 SMS 물 추출물(water extract from spent mushroom substrate, WESMS)로 하여 실험에 사용하였다.
- 상층 분배체를 감압 농축기로 농축하여 잔여물을 5% trichloroacetic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 5 μL와 99% methanol (w/v)의 혼합물을 첨가하여 녹이고 이어서 증류수 5 mL를 첨가하여 원심분리하여 상등액을 페놀 성분과 salicylic acid (SA) 함량 조사하는데 활용하였다.
- 접종 후 3일 후에 WESMS 30 mL를 2차 관주 처리하고 5일 후에 3차 추출물을 관주 처리하였으며 병 방제효과는 최종 처리 토마토 풋마름병 접종 후 15일 후에 관찰하였다. 양성 대조군 DL-3- aminobutylic acid (BABA) 0.5%와 음성대조군 물이 상기 방법에 준하여 처리되었다. 발병 정도(disease index)는 Kwak 등[9]이 제시한 1: 잎이 10~20%, 2: 20~50% 전체 식물체가 시듦, 3: 50~70% 식물체가 시듦, 4: 식물체가 70~ 100% 이상 시듦으로 표시하였으며 방제율은 Sunwoo 등 [12]이 제시한 100 (1-x/y, x는 처리구 발병 정도, y는 비 처리구 발병 정도)식으로 산출하였다.
- 접종방법은 토마토 유묘 뿌리를 가위로 일부 상처를 준 후 토마토 풋마름균 2 × 106 세포 현탁액 5 mL를 뿌리 주변에 접종하였다. 접종 후 3일 후에 WESMS 30 mL를 2차 관주 처리하고 5일 후에 3차 추출물을 관주 처리하였으며 병 방제효과는 최종 처리 토마토 풋마름병 접종 후 15일 후에 관찰하였다. 양성 대조군 DL-3- aminobutylic acid (BABA) 0.
- 접종방법은 토마토 유묘 뿌리를 가위로 일부 상처를 준 후 토마토 풋마름균 2 × 106 세포 현탁액 5 mL를 뿌리 주변에 접종하였다.
- 토마토(품종: 슈퍼도 네랑) 파종 후 20일 된 유묘를 사용하였다. 처리 방법은 1차로 큰느타리 WESMS 30 mL를 토마토 모종에 관주하고 3일 후 토마토 풋마름균(Ralstonia solanacearum)을 접종하였다. 접종방법은 토마토 유묘 뿌리를 가위로 일부 상처를 준 후 토마토 풋마름균 2 × 106 세포 현탁액 5 mL를 뿌리 주변에 접종하였다.
- 큰느타리 WESMS 처리에 따른 토마토 풋마름병 억제효과를 조사하였다. Fig.
- 큰느타리 수확 후 배지 열수추출액(WESMS)을 토마토 유묘에 관주 처리하고 20일 후에 초장, 엽장, 엽폭, 엽수와 생체량을 측정하여 생육 촉진 효과를 조사하였다. Table 2는 그 결과로써 큰느타리 WESMS 처리 토마토 유묘는 초장이 31.
- 토마토 페놀 추출물 600 μL를 500 μL, 7% Folin Ciocalteu regent와 혼합하고 4% Na2CO3 500 μL를 첨가하여 60분 후에 spectrophotometer 로 720 nm에서 흡광도를 측정하였으며 garlic acid를 페놀 성분 standard로 하여 정량분석 하였다.
대상 데이터
- SMS 혼합액을 2겹의 미라크로스로 거르고 7,000 × g에서 10분 동안 원심 분리하여 상등액을 SMS 물 추출물(water extract from spent mushroom substrate, WESMS)로 하여 실험에 사용하였다.
- WESMS 30 mL를 토마토 유묘 뿌리 주변에 관주 처리하고 15주 후에 초장, 엽장, 엽폭, 엽수, 줄기 및 뿌리 생체량을 측정하여 유묘 생육촉진 효과 여부를 조사하였다. 대조구로서는 큰느타리버섯 종균을 접종하지 않은 원배지(mushroom substrate, MS)로부터 동일한 방법으로 물 추출한 WEMS와 물을 사용하였다.
- 큰느타리 SMS는 큰느타리버섯 재배농가로부터 분양받아 사용하였다. 그 SMS로부터 유효성분을 추출하기 위하여 SMS:물(1:5 w/v) 비율로 하여 1시간 동안 90oC에서 열 처리하였다.
- 큰느타리 WESMS의 토마토 유묘 성장 효과를 조사하기 위하여 토마토 종자를 pot (직경10 cm)에 파종하여 3주 경과 후 8엽기의 토마토 유묘를 사용하였다. WESMS 30 mL를 토마토 유묘 뿌리 주변에 관주 처리하고 15주 후에 초장, 엽장, 엽폭, 엽수, 줄기 및 뿌리 생체량을 측정하여 유묘 생육촉진 효과 여부를 조사하였다.
- 토마토(품종: 슈퍼도 네랑) 파종 후 20일 된 유묘를 사용하였다. 처리 방법은 1차로 큰느타리 WESMS 30 mL를 토마토 모종에 관주하고 3일 후 토마토 풋마름균(Ralstonia solanacearum)을 접종하였다.
- 따라서 버섯 WESMS 처리에 따른 토마토 잎의 SA 함량 여부를 조사하였다. 표준물질은 salicylic acid (Sigma-Aldrich)을 사용하였다. 표준 salicylic acid의 calibration curve는 10~50 ng/ mL에서 correlation coefficient 값을 확인한 결과, 농도에 따라 좋은 직선성(R2> 0.
이론/모형
- SMS 열수추출물 50 mL를 포트에 성장한 토마토 유묘(4주)에 관주 처리하여 96시간 경과 후 Hassan 등[13]에 의한 방법에 의하여 페놀 성분을 추출하였다. 처리별 토마토 잎 1 g을 액체질소에 마쇄하였으며 3 mL의 90% methanol로 혼합하고 원심분리하여 분배하였다.
- Salicylic acid 함량조사를 위하여 상기 추출물 500 μL를 Liquid chromatograph Mass Spectrometer (LCMS8050; Shimadzu, Kyoto, Japan)로 제공된 사용지침에 따라 분석하였다.
- 5%와 음성대조군 물이 상기 방법에 준하여 처리되었다. 발병 정도(disease index)는 Kwak 등[9]이 제시한 1: 잎이 10~20%, 2: 20~50% 전체 식물체가 시듦, 3: 50~70% 식물체가 시듦, 4: 식물체가 70~ 100% 이상 시듦으로 표시하였으며 방제율은 Sunwoo 등 [12]이 제시한 100 (1-x/y, x는 처리구 발병 정도, y는 비 처리구 발병 정도)식으로 산출하였다.
성능/효과
- 큰느타리 수확 후 배지 열수추출액(WESMS)을 토마토 유묘에 관주 처리하고 20일 후에 초장, 엽장, 엽폭, 엽수와 생체량을 측정하여 생육 촉진 효과를 조사하였다. Table 2는 그 결과로써 큰느타리 WESMS 처리 토마토 유묘는 초장이 31.25 cm로서 물 처리 유묘 17.30 cm에 비하여 47% 이상의 초장이 증가되었다. 큰느타리 WEMS처리구와 비교하여도 초장이 22% 이상 증가되었다.
- 큰느타리 WEMS처리구와 비교하여도 초장이 22% 이상 증가되었다. WESMS 처리구는 물과 WEMS처리구에 비하여 엽장과 엽폭의 경우는 15~ 25%, 잎수는 30~40%가 증가하였다. 큰느타리 WESMS 처리구는 물 처리구보다 토마토 생체량이 85% 이상 증가되 었으며 뿌리생체량도 70% 이상 증가되었다.
- 이러한 유용한 성분은 식물체의 생육을 촉진하고 결국 식물체를 건강하게 함으로써 병 저항성이 증가되는 효과가 있을 것으로 생각된다. 결론적으로 본 연구의 큰느타리 SMS의 토마토 풋마름병 억제효과는 병저항성 유도, 식물 생장촉진의 복합기능성에 기인되는 것으로 생각된다. 버섯 수확 후 배지는 버섯 대사과정에서 생산되는 다양한 생리 활성 물질과 버섯균사체를 포함하고 있으며 향후 토마토 풋마름병 억제인자를 탐색 발굴한다면 큰느타리버섯 수확 후 배지는 고부가가치 기능성 물질 생산을 위한 유용한 재료로 이용될 수 있을 것으로 기 대된다.
- 0으로 토마토 식물체가 완전히 고사하였다. 그러나 큰느타리 WESMS 처리구는 토마토 풋마름병균 접종 후 13일까지 발병 정도가 1.0 이하로 토마토 풋마름병 억제효과가 뚜렷하게 관찰되었다(Fig. 1A). Fig.
- 따라서, WESMS 처리에 따른 토마토의 페놀 함량 변화를 조사하였다. 노루궁뎅이 WESMS 처리구는 페놀함량이 35.28 mg/g 로 물 처리구 30.96 mg/g보다 13%의 페놀 함량이 증가하였으며 표고 WESMS 처리구는 43.56 mg/g의 페놀 성분이 검출되어 물 처리구보다 30% 이상 증가되었다(Fig. 2). 식물의 병 저항성 유도체로 널리 알려져 있는 BABA 처리구 는 33.
- 6 ng/mL으로 SA함량이 4배 이상 검출되었다(Table 1). 다른 노루궁뎅이와 표고버섯 WESMS 처리 토마토 잎 시료는 SA 함량이 5.2 ng/mL, 9.8 ng/mL와 비교해 큰느타리 WESMS 처리구는 2.5배에서 1.5배 SA 함량이 증가되었다.
- 큰느타리버섯(Pleurotus eryngii) 수확 후 배지(spent mushroom substrate, SMS)의 물 추출액(WESMS)을 처리한 토마토 식물체는 토마토 풋마름병을 70% 이상 억제하였으며 페놀 성분(3%)과 salicylic acid 함량이 증가되었다. 또한 큰느타리 WESMS 처리 토마토는, 초장, 엽폭, 입장, 입수, 줄기와 뿌리 생체량 등에서 물 처리 및 큰느타리버섯 배지만을 사용한 대조군에 비하여 높은 생육 촉진 효과를 보였다. 이는 큰느타리 WESMS가 병 저항성유도와 생육촉진의 토마토 복합기능성으로 환경친화적 풋마름병 방제에 유용하게 활용될 수 있음을 나타낸다.
- 버섯 수확 후 배지 WESMS 처리에 따른 토마토 잎의 SA 축적 여부를 조사하기 위하여 큰느타리, 노루궁뎅이, 표고버섯 WESMS를 토마토 잎과 뿌리에 처리하고 96시간 경과 후 토마토잎의 SA 함량을 분석한 결과 큰느타리 WEMS 처리구 3.9 ng/mL와 물 처리구 3.6 ng/mL에 비하여 큰느타리 WESMS 처리구에서 15.6 ng/mL으로 SA함량이 4배 이상 검출되었다(Table 1). 다른 노루궁뎅이와 표고버섯 WESMS 처리 토마토 잎 시료는 SA 함량이 5.
- flaccumfaciens 등의 식물병원세균의 성장 억제효과가 있으며 토마토 세균성 시들음병 방제에 효과적인 것으로 보고되었다[14, 15]. 본 연구의 큰느타리 WESMS는 토마토 풋마름병에 대하여 항균활성이 없어 항균활성에 의한 직접적인 병 억제를 하기보다는 토마토 식물체에 병 저항성 증대를 통한 병 억제효과 등 이외에 다른 요소가 있는 것으로 추정할 수 있었다.
- 12 mg/g의 페놀 함량이 나타났다. 큰느타리 WESMS 처리구는 31.68 mg/g으로 다른 WESMS 처리구에 비하여 낮은 페놀함량이 검출되었다.
- WESMS 처리구는 물과 WEMS처리구에 비하여 엽장과 엽폭의 경우는 15~ 25%, 잎수는 30~40%가 증가하였다. 큰느타리 WESMS 처리구는 물 처리구보다 토마토 생체량이 85% 이상 증가되 었으며 뿌리생체량도 70% 이상 증가되었다. Fig.
- 큰느타리 WESMS는 항균활성이 없었지만 토마토 풋마름병 억제효과가 관찰되었다. 이는 큰느타리 WESMS로 병 저항성 SAR 신호전달 물질인 salicylic acid (SA) 축적에 따른 저항성 유도 발현을 추정할 수 있었다.
- 큰느타리버섯(Pleurotus eryngii) 수확 후 배지(spent mushroom substrate, SMS)의 물 추출액(WESMS)을 처리한 토마토 식물체는 토마토 풋마름병을 70% 이상 억제하였으며 페놀 성분(3%)과 salicylic acid 함량이 증가되었다. 또한 큰느타리 WESMS 처리 토마토는, 초장, 엽폭, 입장, 입수, 줄기와 뿌리 생체량 등에서 물 처리 및 큰느타리버섯 배지만을 사용한 대조군에 비하여 높은 생육 촉진 효과를 보였다.
- 표준 salicylic acid의 calibration curve는 10~50 ng/ mL에서 correlation coefficient 값을 확인한 결과, 농도에 따라 좋은 직선성(R2> 0.9999)을 보여 함량 측정 정확도를 확인하였다(Fig. 3).
- 1B는 병원균 접종 후 15일 후에 큰느타리 WESMS 처리구와 물처리구를 비교한 사진으로 WESMS 처리구에서 토마토 풋마름병 억제효과를 관찰할 수 있다. 한편, 양성 대조구로 이용되었던 병 저항성 유도 물질로 알려진 BABA 처리구는 병원균 접종 후 10일까지 큰느타리 WESMS 처리구와 유사한 병 억제효과가 나타났으나 13일 후에는 병이 진전되기 시작하여 15일 후에는 발병 정도 3.0 이상의 토마토 풋마름병이 발생하였다. BABA는 직접적으로 항균활성 없이 다양한 토마토를 가해하는 세균, 진균식물병원균에 대하여 식물체의 저항성을 유도하여 병 방어를 하는 것으로 알려져 있다[13].
후속연구
- 결론적으로 본 연구의 큰느타리 SMS의 토마토 풋마름병 억제효과는 병저항성 유도, 식물 생장촉진의 복합기능성에 기인되는 것으로 생각된다. 버섯 수확 후 배지는 버섯 대사과정에서 생산되는 다양한 생리 활성 물질과 버섯균사체를 포함하고 있으며 향후 토마토 풋마름병 억제인자를 탐색 발굴한다면 큰느타리버섯 수확 후 배지는 고부가가치 기능성 물질 생산을 위한 유용한 재료로 이용될 수 있을 것으로 기 대된다.
- 큰느타리버섯 수확 후 배지의 성분분석이 수행된 바 있는데 대체적으로 종균 접종 전 배지와 비교하여 단백질함량이 낮고 cellulose 함량이 낮으며, 회분(Ash)은 5% 정도 증가하고 버섯 수확 후에 당 함량이 30~62% 소모되는 것으로 보고되었다[17]. 수확 후 배지는 영양, 생식과정을 거치며 다양한 대사 산물이 생산될 것으로 추측되며 또한 배지에 잔존하는 균사체로부터의 세포벽 추출물이 병 억제에 유효 기능을 할 수 있어 큰느타리 SMS 열수추출물 중에 어떠한 성분이 토마토 식물체의 저항성을 증대시키는 저항성 유도체(elicitor) 기능으로 작용하는지 향후 연구가 필요하다.
- 따라서, 버섯 수확 후 배지는 다량의 버섯균사체 가 밀집해 있으며 열수추출 과정에서 균사체 세포벽물질이 방출되어 병 저항성 유도체로 작용할 수 있을 것으로 생각된다. 특히 본 연구에서 큰느타리 SMS는 다른 버섯SMS보다 강력한 토마토 풋마름병 저항성 유도를 촉진하는 것으 로 나타나 향후 병 저항성 유도체 성분의 정제 및 구조분석에 의한 기초자료가 확보되면 보다 체계화된 식물병원균의 방제제 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 전망된다.
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