[논문]렛 근육세포 L6에서 둥굴레 추출물의 인슐린저항성 개선

최미애

doi:10.6116/kjh.2016.31.1.1.

렛 근육세포 L6에서 둥굴레 추출물의 인슐린저항성 개선
Attenuation of insulin resistance using steamed Polygonatum odoratum var pluriflorum extract in rat skeletal muscle cells L6 myoblast 원문보기

大韓本草學會誌 = The Korea journal of herbology, v.31 no.1, 2016년, pp.1 - 5

최미애 (대구한의대학교 한방산업대학 한방식품조리영양학부)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : The purpose of this study was to investigate inhibitory effects of steamed Polygonatum odoratum extract (POE) on insulin resistance in rat skeletal muscle cells, L6 cells.Methods : Polygonatum odoratum (P. odoratum) extract was extracted with ethyl acetate. Activity of α-glucosidase in POE was measured for blood glucose regulation. MTT assay was examined for cell toxicity. Western blot analysis for measurement of adiponectine, peroxisome proliferator-activated receptorγ (PPARγ), insulin receptor substrate (IRS), glucose transporter 4 (Glut-4) and phosphorylation of serine/threonine-specific protein kinase (Akt) expressions were performed. Akt signaling pathway were analyzed with LY294002, which is a specific PI3K/Akt inhibitor.Results : The results revealed that POE inhibited α-glucosidase activity. Treatment of POE in L6 cells inhibited the differentiation of L6 cells compared to those of vehicl control. Additionally, protein expressions of adiponectine, PPARγ, IRS and Glut-4 were significantly regulated compared to those of vehicle control (p < 0.05), respectively. Futhermore, phosphorylation of Akt was increased in L6 cells treated with POE compared to that of vehicle control (p < 0.05). pAkt expression was significantly accentuated with Akt inhibitor (LY294002).Conclusions : These results suggest that POE may have potential as a natural agent for prevention/improvement of diabetes, especially, regulation of blood glucose. Therefore, further additional study should be conducted to elucidate in depth the pharmaceutical efficacy of these.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

증자 둥굴레 추출물의 선행연구에서 강등은 증자 둥굴레 추출물(POE)의 우수한 항산화력을 관찰 할 수 있었을 뿐만 아니라 지방세포 3T3- L1 에서 초기 지방세포 분화 억제 및 지방합성 억제 효과가 관찰되어 항비만 예방 및 치료에 대한 후보 약물로써 활용성 이 보고 하였다¹¹⁾. 따라서 본 연구에서는 증자 둥굴레 추출물의 제2형 당뇨병 예방 및 치료에 매우 중요한 혈당유지와 이와 밀접한 관련 있는 근육세포에서의 포도당 이용률, 인슐린 저항성 및 그 기전을 확인하였다.
혈액으로부터 포도당의 세포내 유입 시 인슐린의 감수성이 증가하면 IRS 발현이 증가되며 이는 Akt 인산화를 촉진하여 세포질에서 Glut-4의 세포막으로 이동을 촉지하므 로 혈액에서 포도당 유입이 증가되어 혈당을 조절하게 된다 ^22-26). 본 실험의 증자 둥굴레 추출물 처리 세포에서 IRS, Akt 인산화 그리고 Glut-4의 발현 증가는 둥굴레 추출물이 혈액으로부터 세포내 포도당 유입의 증가를 유도 할 수 있으며, 그 기전이 Akt 인산화 기전을 통하는 것임을 Akt 억제제 (LY294002, 50µM)를 처리하여 확인하므로 둥굴레 추출물이 제 2형 당뇨에서 혈당조절 및 인슐린 저항성을 개선하는데 효과가 있을 것으로 사료되어 본 연구결과를 보고한다. 나아 가 본 실험을 바탕으로 in vivo 동물모델에서의 보다 더 정확 한 분자적 기전 확인을 진행할 계획이다.
본 연구에서 증자 둥굴레 추출물의 L6 근육세포에서 인슐린저항성 및 혈당강하 효과를 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
7%, 54%). 본 연구에서는 당뇨치료제로 쓰이는 acarbose와 유사한 α-glucosidase 저해 활성 효과를 보여 주어 당뇨 개선을 위한 천연소재로 이용 가능성이 사료된다.

제안 방법

1. 증자 둥굴레 추출물(POE)는 α-glucosidase 저해 활성 효과를 보여 주어 당뇨 개선을 위한 천연소재로 이용 가능성을 관찰하였다.
5mM 3-isobutyl–1-me thylxanthine (IBMX, Sigma Aldrich, USA), 2µΜ Dexametasone (DEX, Sigma Aldrich, USA), 2µg/ml insulin (Sigma Aldrich, USA)/10% FBS)으로 바 꾸어 증자 둥굴레 추출물을 처리하여 2일간 배양한다. 2일 후 2µg/mL insulin/10% FBS 배지로 교환하며, 약물을 이 틀에 한 번씩 5번 처리하였다.
단백질 전이된 membrane을 5% skim milk를 처리하여 비특이적인 단백질에 대한 blocking을 실시하고, Adiponetine, glucose transporter 4 (Glut-4), insulin receptor substrate (IRS), proliferater activated receptor-γ (PPARγ), serine/threonine-specific protein kinase (Akt), β-actin 단백질 항체(Santa Cruz, USA)를 4℃에서 하룻밤 각각 반응 처리하였다. TBS-T로 세척한 후에 각각의 단백질 항제에 알맞은 2차 항체로 반응 하여 ECL 시약을 처리하여 X-ray film에 감광시켜 타겟 단백질 발현 량을 관찰하였다.
적정양의 단백질을 10∼12% sodium dodecyl sulfate (SDS)-PAGE에 분리한 후, Polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane으로 전이시켰다. 단백질 전이된 membrane을 5% skim milk를 처리하여 비특이적인 단백질에 대한 blocking을 실시하고, Adiponetine, glucose transporter 4 (Glut-4), insulin receptor substrate (IRS), proliferater activated receptor-γ (PPARγ), serine/threonine-specific protein kinase (Akt), β-actin 단백질 항체(Santa Cruz, USA)를 4℃에서 하룻밤 각각 반응 처리하였다. TBS-T로 세척한 후에 각각의 단백질 항제에 알맞은 2차 항체로 반응 하여 ECL 시약을 처리하여 X-ray film에 감광시켜 타겟 단백질 발현 량을 관찰하였다.
그 결과, 두 세포 모두 증자 둥굴레 추출물의 처리농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다. 따라서 본 실험에서는 세포 생 존율에 영향을 미치지 않는 농도인 1 mg/ml 농도에서 이후 실험들을 진행하였다(Fig. 2).
cells/ml로 분주하여 안정화시킨 후 증자 둥굴레 추출물을 농도 별로 24시간 처리 하였다. 배양 후 배지를 제거하고 3-[4, 5-dimethylthiazolyl] -2, 5–di phenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma Aldrich, USA) 시약을 0.5mg/ml 농도로 첨가하고 2시간 뒤 생성된 불용성 결정을 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma Aldrich, USA)로 완전히 녹인 다음, microplate reader (TECAN Austria Gmbh, Austria)를 이용하여 570nm 파장에서 흡광도를 측 정하였다. 실험결과인 세포 생존율은 대조군에 대한 백분율로 표시하여 세포 독성 실험하였다.
05 수준에서 실시하였다. 밴드의 강도은 L process and multi gauge software (Version 2.01, Fujifilm)을 사용하여 분석 정량하였다.
5. 세포막 단백질 분리

분화한 L6 근관세포(myotube)를 FBS 무첨가 DMEM에서 일정시간 배양한 후, insulin과 0.2mg/ml 농도의 증자 둥굴 레 추출물을 처리하였다. 세포 배양액을 제거하고, Krebs- Henseleit buffer modified(KHB) buffer (Sigma Aldrich, USA)로 세척한 후, RIPA buffer (Invitrogen, USA)를 처리 하여 스크레이퍼를 이용하여 세포를 떼어낸 후 용해하였다.
5mg/ml 농도로 첨가하고 2시간 뒤 생성된 불용성 결정을 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma Aldrich, USA)로 완전히 녹인 다음, microplate reader (TECAN Austria Gmbh, Austria)를 이용하여 570nm 파장에서 흡광도를 측 정하였다. 실험결과인 세포 생존율은 대조군에 대한 백분율로 표시하여 세포 독성 실험하였다.
증자 둥굴레 추출물의 세포 독성을 알아보기 위해 L6 근육 세포에 0.05∼1 mg/ml 농도의 증자 둥굴레 추출물를 각각 처리하고 MTT 분석법을 이용하여 세포생존율을 측정하였다. 그 결과, 두 세포 모두 증자 둥굴레 추출물의 처리농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다.

대상 데이터

본 실험에 사용한 둥굴레 (국내산, 대원약업사, 대구)뿌리는 세척하고 껍질을 제거한 다음, 수증기로 1시간 증자하고 55∼60℃ 범위에서 열풍건조기로 6시간 건조하여 선행연구¹¹⁾ 와 같은 방법으로 추출하여 동결건조하여 시료를 얻은 후에 methanol에 용해하여 실험에 사용하였다.
본 실험에 사용한 세포주는 American type culture collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입한 렛 근육세포(rat myoblast 미분화 근원 세포) L6을 사용하였다. 세포는 high- glucose Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Thermo Scientific, USA) 배지 (10% fetal bovine serum (FBS, Thermo Scientific, USA), 1% penicillin-streptomycin (P/S) 포함)를 처리하여 37℃, 5% CO₂ 배양기(MCO-15AC, SANYO, Japan)에서 배양한 후, 약 70% confluent 해졌을 때 배양액을 근관세포(myotube) 분화유도 배양액 (0.

데이터처리

5 and 1 ㎎/㎖. Data are expressed as mean±S.D. Statistical significances of differences were determined by student's t-test (^*P<0.05).
7. 통계방법

통계처리(Student's t-test)는 GraphPad Prism 5 program (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)을 사용하였 고, 대조세포에 대한 유의성 검증은 p<0.05 수준에서 실시하였다. 밴드의 강도은 L process and multi gauge software (Version 2.

이론/모형

α-Glucosidase 활성 억제 효과 측정은 Watanabe의 방법 으로 측정하였다¹²⁾. 100mM phosphate buffer(pH 7.

성능/효과

2. 증자 둥굴레 추출물는 0.05~1.0mg/ml 처리 농도에서 L6 세포에 독성을 나타내지 않았다.
3. POE 처리가 렛 근육세포인 L6세포에서 비만관련 지표인 초기 분화전사인자 PPARγ 발현이 유의적인 수준(p <0.05)으로 억제되었고, 체내 포도당의 세포내 이용률에 영향 미치는 adiponetin, IRS, Glut-4 발현을 유의적(p<0.05)으로 증가시켰다. 이러한 결과는 둥굴레 추출물이 근육세포에서의 포도당 이용률에 영향을 미친다.
4. Glut-4의 세포막 이동에 영향을 미치는 Akt 인산화 수준은 POE 처리 세포에서 LY294002 처리시 대조세포에 비하여 유의적인 수준(p<0.05)으로 억제되었지만 처리하지 않은 세포에서 유위적으로 증가하여 둥굴레 추출물의 세포내 포도당 유입과 인슐린 저항성 개선기전이 Akt인산화 기전을 통하는 것을 확인하였다.
05∼1 mg/ml 농도의 증자 둥굴레 추출물를 각각 처리하고 MTT 분석법을 이용하여 세포생존율을 측정하였다. 그 결과, 두 세포 모두 증자 둥굴레 추출물의 처리농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다. 따라서 본 실험에서는 세포 생 존율에 영향을 미치지 않는 농도인 1 mg/ml 농도에서 이후 실험들을 진행하였다(Fig.
근육세포 L6에 둥굴레 추출물처리가 인슐린 저항성과 관련한 근육 세포에 존재하는 비만관련 지표인 초기 지방세포분화 전사인자인 PPARγ 발현을 유의적(P<0.05)으로 억제하며 (Fig. 3A), adiponectin 발현(Fig. 3B)과 혈액 중 포도당의 세포내 이용률에 영향 미치는 IRS, Glut-4 발현(Fig. 3C, D)을 유의적(P<0.05)으로 증가시켰다. 이러한 결과는 증자 둥굴레 추출물이 근육세포에서의 포도당 이용률에 영향을 미쳐 체내 혈당 유지와 인슐린 저항성 예방 및 개선 효과가 있을 것으로 사료된다.
05)으로 증가되었다. 따라서 둥굴레 추출물 의 혈당조절 기전은 Akt 인산화 기전을 통한다는 것을 확인 할 수 있다.
이 유전자는 근육에서의 지방산 산화를 유도하여 인슐린 저항성을 낮추어 인슐린의 감수성과 포도당의 이용률을 증가시킨다²¹⁾. 본 실험에서 Adiponetin 발현 증가는 인슐린 저항성과 혈당조절에 영향을 미칠 것으로 생각된다. 혈액으로부터 포도당의 세포내 유입 시 인슐린의 감수성이 증가하면 IRS 발현이 증가되며 이는 Akt 인산화를 촉진하여 세포질에서 Glut-4의 세포막으로 이동을 촉지하므 로 혈액에서 포도당 유입이 증가되어 혈당을 조절하게 된다 ^22-26).
Akt 인산화 증가는 Glut-4의 세포막 이동을 증가시켜 세포내 포도당 이용을 증가 시킨다. 이 기전을 확인 하기 위해 Akt 기전 억제제 LY294002 처리 시 Akt 인산화가 유의적(P<0.05)으로 억제되었고, 반면에 Akt 억제제를 처리하지 않으면 Akt 인산화가 둥굴레 추출물 처리에 의해 유의적(P<0.05)으로 증가되었다. 따라서 둥굴레 추출물 의 혈당조절 기전은 Akt 인산화 기전을 통한다는 것을 확인 할 수 있다.
1에 나타내었다. 증자 둥굴레 추출물 0.5㎎/㎖ 농도에서는 양성대조물질인 acarbose의 저해 활성에 비해 유의적으로 낮은 효과를 나타냈지만, 증자 둥굴레 추출물 1㎎/㎖ 농도에서는 대조구인 acarbose와 통계적으로 유의한 차이 없이 높은 저해 활성을 나타냈다(각각 55.7%, 54%). 본 연구에서는 당뇨치료제로 쓰이는 acarbose와 유사한 α-glucosidase 저해 활성 효과를 보여 주어 당뇨 개선을 위한 천연소재로 이용 가능성이 사료된다.

후속연구

본 실험의 증자 둥굴레 추출물 처리 세포에서 IRS, Akt 인산화 그리고 Glut-4의 발현 증가는 둥굴레 추출물이 혈액으로부터 세포내 포도당 유입의 증가를 유도 할 수 있으며, 그 기전이 Akt 인산화 기전을 통하는 것임을 Akt 억제제 (LY294002, 50µM)를 처리하여 확인하므로 둥굴레 추출물이 제 2형 당뇨에서 혈당조절 및 인슐린 저항성을 개선하는데 효과가 있을 것으로 사료되어 본 연구결과를 보고한다. 나아 가 본 실험을 바탕으로 in vivo 동물모델에서의 보다 더 정확 한 분자적 기전 확인을 진행할 계획이다.
. 따라서 증자 둥굴레 추출 물처리 세포에서 PPARr 발현이 낮은 것은 세포에 지방의 축적을 억제하므로 지방세포의 증가가 원인인 비만을 예방하여 인슐린 저항성이 나타나는 제2형 당뇨병 예방에 효과를 기대 할 수 있을 것으로 사료된다. Adiponetin은 세포에서의 인슐린 감수성과 매우 밀접한 인자로 알려져 있으며 지방조직의 부피와 역의 상관관계를 보인다^{19, 20)}.
05)으로 증가시켰다. 이러한 결과는 증자 둥굴레 추출물이 근육세포에서의 포도당 이용률에 영향을 미쳐 체내 혈당 유지와 인슐린 저항성 예방 및 개선 효과가 있을 것으로 사료된다.
이상의 결과에서 증자 둥굴레 추출물(POE)의 우수한 혈당 강하 효과를 관찰 할 수 있었을 뿐만 아니라 비만유도 지방세포 분화 관련인자인 PPARγ 발현억제 지방축적 억제 및 Akt 의 인산화 증가로 세포내 포도당 이용률 증가 효과가 관찰되어 체내 혈당 조절 및 인슐린 저항성 예방 및 치료 작용이 기대 되어진다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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