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문제 정의
- 본 연구에서는 유기물 함량이 높은 느타리 수확후배지의 퇴비화에 필요한 균주를 개발할 목적으로 진주인근 지역의 느타리 재배농가에서 수집한 수확후배지로부터 가수분해효소를 분비하는 고온성 균주를 분리하고 분리균의 특성을 조사하였다.
제안 방법
- Louis, MO, USA)이 각각 기질로 첨가된 TSA 배지에서 확인하였다. CMCase 분비능이 우수한 균주는 분리균을 0.5% CMC와 1% trypan blue(Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA)가 첨가된 TSA 배지에 접종한 다음 55℃에서 48시간 동안 배양한 후 콜로니 주변에 형성된 cellulose 분해환의 크기를 측정하여 선발하였으며 분리균의 xylan 분해능은 0.5% xylan이 기질로 첨가된 TSA 배지에 분리균을 접종한 다음 55℃에서 48시간 동안 배양한 후 iodine으로 염색하여 콜로니 주변에 형성된 xylan 분해환의 크기를 측정하여 선발하였다.
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CMCase와 xylanase 활성이 우수한 고온성 균주를 분리하기 위하여 진주 인근 지역의 느타리 재배농가에서 탈병 후 2시간 이내의 느타리 수확후배지를 수집한 다음 멸균
수에 106으로 희석하였으며 희석액은 TSA 배지에 도말한 다음 55℃에서 배양하여 17개의 균주를 분리하였다. 분리균의 CMCase와 xylanase 활성은 한천확산법에 따라
- 0) 250 ul를 혼합하여 100℃에서 10분 동안 반응시킨 후 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. Xylanase 활성은 CMC 대신에 xylan을 기질로 사용하여 CMCase 와 동일한 방법으로 측정하였다. CMCase와 xylanase 활성 측정에 사용된 표준시료는 각각 glucose와 D-xylose이고 효소 활성을 나타내는 단위인 1 unit은 CMC 또는 xylan으로부터 1분 동안 1 umol의 glucose 또는 D-xylose 에 상응하는 환원당을 생성하는 효소의 양으로 나타내었다.
- 느타리 수확후배지에 우점하는 균주 중 CMCase와 xylanase 활성이 우수한 균주를 분리하기 위하여 진주 인근 지역의 느타리 재배농가로부터 탈병 후 2시간 이내의 수확후배지를 수집하였다. 느타리 수확후배지에 우점하는 고온성 균주는 수집한 배지 1 g을 멸균수에 106으로 희석한 후 trypticase soy agar(TSA, BD Difco, Franklin Lakes, USA) 배지에 도말한 다음 55℃에서 48시간 동안 배양하여 분리하였다.
- 느타리 수확후배지에 우점하는 고온성 균주는 수집한 배지 1 g을 멸균수에 106으로 희석한 후 trypticase soy agar(TSA, BD Difco, Franklin Lakes, USA) 배지에 도말한 다음 55℃에서 48시간 동안 배양하여 분리하였다. 분리균 중 가수분해 효소를 분비하는 균주는 carboxy methyl cellulose(CMC, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 또는 xylan(Xylan from oat spelts, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 각각 기질로 첨가된 TSA 배지에서 확인하였다. CMCase 분비능이 우수한 균주는 분리균을 0.
- 분리균의 생육이 효소 생성에 미치는 영향은 0.5% CMC 또는 xylan이 각각 기질로 첨가된 TSB 배지에 분리균을 접종한 다음 48시간 동안 배양하면서 3시간 간격으로 채취한 배양액의 생육곡선과 DNS 환원당 정량법에 준하여 측정한 CMCase와 xylanase 활성의 상관관계를 조사하여 확인하였다(Fig. 3). CMCase 활성은 분리균이 증식함에 따라 대수증식기 초반부터 급격히 증가하였고 정지기에 진입하면 효소활성이 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났으며 xylanase 활성은 대수증식기 중반부터 지속적으로 증가하여 정지기 초반에 최대활성을 나타내었다.
- 분리균의 생육이 효소 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 0.5% CMC 또는 xylan이 기질로 첨가된 TSB 배지에 분리균을 각각 접종한 다음 48시간 동안 진탕배양하면서 3시간 간격으로 배양액을 채취하였다. 분리균의 생육곡선은 채취한 배양액을 600 nm에서 흡광도를 측정하여 작성하였으며 CMCase와 xylanase 활성은 DNS 환원당 정량법으로 측정하였다(Miller et al, 1960).
- 5 kb에 해당하는 단편을 PCR purification kit(Qiagen, Germantown, USA)를 사용하여 정제한 다음 Macrogen사(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 분석하였다. 최종 선발된 균주의 16S rDNA 염기서열은 GeneBank database에 등록된 균주들의 16S rDNA 염기서열과 상동성을 조사하여 계통학적 유연관계를 분석하였으며 그 결과는 DNAMan analysis system(Lynnon Biosoft, San Ramon, USA)을 이용하여 계통도로 작성하였다.
- 최종 선발된 균주의 16S rDNA 염기서열은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 얻은 산물 중 1.5 kb에 해당하는 단편을 PCR purification kit(Qiagen, Germantown, USA)를 사용하여 정제한 다음 Macrogen사(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 분석하였다. 최종 선발된 균주의 16S rDNA 염기서열은 GeneBank database에 등록된 균주들의 16S rDNA 염기서열과 상동성을 조사하여 계통학적 유연관계를 분석하였으며 그 결과는 DNAMan analysis system(Lynnon Biosoft, San Ramon, USA)을 이용하여 계통도로 작성하였다.
- 최종 선발된 균주의 형태적 특징은 55℃에서 48시간 동안 배양한 다음 현미경으로 관찰하여 확인하였으며 생화학적 특성은 Bacillus ID kit(MicrogenTM, Camberley, UK)와 MicroLog system(BioLogTM, Hayward, USA)을 이용하여 조사하였다.
대상 데이터
- CMCase와 xylanase 분비능이 우수한 고온성 세균을 분리하기 위하여 진주 인근지역의 느타리 재배농장으로부터 수확후배지를 수집하였다. 느타리 수확후배지로부터 17종의 균주를 분리하였으며 이 중 CMCase와 xylanase 활성이 큰 균주 YJ09를 선발하였다.
- CMCase와 xylanase 분비능이 우수한 고온성 세균을 분리하기 위하여 진주 인근지역의 느타리 재배농장으로부터 수확후배지를 수집하였다. 느타리 수확후배지로부터 17종의 균주를 분리하였으며 이 중 CMCase와 xylanase 활성이 큰 균주 YJ09를 선발하였다. Bacillus ID kit와 MicroLog system을 이용하여 분리균 YJ09의 생리적·생화학적 특성을 조사한 결과 분리균 YJ09은 B.
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수에 106으로 희석하였으며 희석액은 TSA 배지에 도말한 다음 55℃에서 배양하여 17개의 균주를 분리하였다. 분리균의 CMCase와 xylanase 활성은 한천확산법에 따라
CMC 또는 xylan이 각각 기질로 첨가된 TSA 배지에서 분해환의 크기를 측정하여 분해환의 크기가 가장 큰 균주 YJ09를 최종 선발하였다.
이론/모형
- 1. CMCase (A) and xylanase (B) activity of the isolate YJ09 by agar diffusion method. The isolate YJ09 grown on TSA medium containing CMC with trypan blue and xylan as substrates.
- Phylogenetic relationships of the isolate YJ09 and other closely related bacteria based on the partial 16S rDNA sequence. The branching pattern was generated by the neighbor-joining method. Bootstrap values(expressed as percentages of 10,000 replications) are shown at major branching points.
- 5% CMC 또는 xylan이 기질로 첨가된 TSB 배지에 분리균을 각각 접종한 다음 48시간 동안 진탕배양하면서 3시간 간격으로 배양액을 채취하였다. 분리균의 생육곡선은 채취한 배양액을 600 nm에서 흡광도를 측정하여 작성하였으며 CMCase와 xylanase 활성은 DNS 환원당 정량법으로 측정하였다(Miller et al, 1960). CMCase 활성은 3시간 간격으로 채취한 분리균 배양액을 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액만 회수한 다음 상등액 250 ul와 0.
성능/효과
- licheniformis와 유사한 생화학적 특성을 나타내었다. Bacillus ID kit와 MicroLog system에 의한 분리균 YJ09의 생화학적인 특성을 종합하면 Table 1과 같이 Dextrin, D-fructose, Gentiobiose, D-glucose, Maltose, Mannan, D-manitol, 3-methylglucose, P-psicose, Sucrose, Dtrehalose, pyruvic acid 등에 대해 양성반응을 보였다.
- 느타리 수확후배지로부터 17종의 균주를 분리하였으며 이 중 CMCase와 xylanase 활성이 큰 균주 YJ09를 선발하였다. Bacillus ID kit와 MicroLog system을 이용하여 분리균 YJ09의 생리적·생화학적 특성을 조사한 결과 분리균 YJ09은 B. licheniformis와 유사한 특징을 나타내었으며 16S rDNA 염기서열 분석 결과에서도 B. licheniformis와 98.9%의 상동성을 나타내었다. 이와 같은 결과를 종합하여 분리균 YJ09은 B.
- 3). CMCase 활성은 분리균이 증식함에 따라 대수증식기 초반부터 급격히 증가하였고 정지기에 진입하면 효소활성이 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났으며 xylanase 활성은 대수증식기 중반부터 지속적으로 증가하여 정지기 초반에 최대활성을 나타내었다. 이 결과는 Bacillus 속이 분비하는 탄수화물 분해효소의 활성이 세포의 생장과 더불어 지속적으로 증가하고 정지기에 도달하면 최대활성을 나타낸다는 이전의 보고와 일치하는 것이었다(Kim et al, 1995; Kim et al, 2004; Shin and Cho, 2011).
- 분리균 YJ09의 생리적·생화학적 특성과 16S rDNA 염기서열 분석을 통한 계통학적 유연관계를 종합하여 분리균 YJ09는 Bacillus licheniformis YJ09로 동정되었다.
- 분리균 YJ09의 형태적 특징은 분리균을 TSA 배지에서 48시간 동안 배양한 후 현미경으로 관찰하였으며 그 결과 분리균 YJ09은 Gram양성 간균이었다. 분리균 YJ09의 생화학적 특성은 Bacillus ID kit와 MicroLog system을 이용하여 분석하였으며 Bacillus ID kit로 분석한 결과 분리균은 B. licheniformis와 96.82%의 probability을 나타내었으며 MicroLog system에 의한 분석결과에서도 B.licheniformis와 유사한 생화학적 특성을 나타내었다. Bacillus ID kit와 MicroLog system에 의한 분리균 YJ09의 생화학적인 특성을 종합하면 Table 1과 같이 Dextrin, D-fructose, Gentiobiose, D-glucose, Maltose, Mannan, D-manitol, 3-methylglucose, P-psicose, Sucrose, Dtrehalose, pyruvic acid 등에 대해 양성반응을 보였다.
- 분리균 YJ09의 형태적 특징은 분리균을 TSA 배지에서 48시간 동안 배양한 후 현미경으로 관찰하였으며 그 결과 분리균 YJ09은 Gram양성 간균이었다. 분리균 YJ09의 생화학적 특성은 Bacillus ID kit와 MicroLog system을 이용하여 분석하였으며 Bacillus ID kit로 분석한 결과 분리균은 B.
- 분리균의 계통학적 유연관계를 조사하기 위하여 16SrDNA 염기서열을 분석한 결과 분리균 YJ09은 B.licheniformis와 98.9%의 상동성을 나타내었으며 분리균의 16S rDNA 염기서열에 근거한 계통도는 GenBank에 등록된 균주들의 16S rDNA 염기서열을 비교하여 그 결과를 Fig. 2에 나타내었다. Bacillus 속은 다양한 환경에서 포자를 생성하여 생존할 수 있기 때문에 환경에 따라 종 다양성이 큰 세균으로 16S rDNA 염기서열에서 100%의 상동성을 나타내더라도 서로 다른 종으로 분류될 수 있는 균주이지만(Seki et al, 1978) 분리균 YJ09는 Bacillus ID kit와 MicroLog system을 이용한 생리적·생화학적 특성 분석과 16S rDNA 염기서열 분석에서 B.
- licheniformis YJ09로 동정되었다. 분리균이 분비하는 CMCase와 xylanase 활성은 분리균이 증식함에 따라 대수증식기 중반부터 급격히 증가하였고 정지기에 진입하면 효소활성이 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났으며 xylanase 활성은 대수증식기 초기부터 지속적으로 증가하여 대수증식기 중반에 최대활성을 나타내었다.
- 9%의 상동성을 나타내었다. 이와 같은 결과를 종합하여 분리균 YJ09은 B. licheniformis YJ09로 동정되었다. 분리균이 분비하는 CMCase와 xylanase 활성은 분리균이 증식함에 따라 대수증식기 중반부터 급격히 증가하였고 정지기에 진입하면 효소활성이 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났으며 xylanase 활성은 대수증식기 초기부터 지속적으로 증가하여 대수증식기 중반에 최대활성을 나타내었다.
후속연구
- Schäfer(2005) 등의 보고에 의한면 Bacillus licheniformis는 50℃에서 잘 생육하며 protease와 amylase 등의 효소를 분비하여 산업적으로 중요한 미생물 자원이다. 따라서 분리균 YJ09는 다양한 효소를 다량 분비하며 포자를 형성하여 고온에서도 생존할 수 있기 때문에 퇴비화를 촉진하는 유용한 미생물 자원으로 이용될 수 있을 것이다.
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