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문제 정의
- 또한 길경의 주요 생리활성 물질인 platycodin D 역시 폐암을 비롯한 몇 가지 암에서 자가포식을 유도함이 밝혀졌다6,24). 이러한 길경의 자가포식이 길경이 포함 되어있는 4가지 처방에서도 유도되는지를 알아보기 위하여 세포의 형태를 도립 현미경으로 관찰하였다. Fig.
- 이에 본 연구에서는 「동의보감(東醫寶鑑)」 잡병편(雜病篇) 권칠(券七)·옹저(癰疽) 부분에 기록되어 있는 폐옹(肺癰)을 치료하는 처방을 항산화능을 통한 폐암에서 항암 효과를 내는 최적의 후보로 판단하여 선정하였다8,9).
- 문헌상에서 직접적으로 폐암이라는 용어는 찾아볼 수 없으나, 증상으로 미루어 보아 폐적·폐옹의 중증(重症)은 폐암의 표현으로 생각된다10). 이에 본 연구에서는 폐옹 치료 처방을 이용하여 항산화능과 폐암 세포 억제 효과를 조사해보았다. 선행 연구에 의하면, 길경탕은 가미길경탕과 더불어 폐암에서의 항암 효과를 조사한 결과, 동물 실험에서 암세포의 증식, 전이를 억제시키고 면역 세포의 수는 증가시키는 효과를 보였다33).
- GGT), 목단피탕(牧丹皮湯, Mokdanpi-tang, MDPT), 삼소음(參蘇飮, Samso-eum, SSE), 삼출보비탕(參朮補脾湯, Samchulbobi-tang, SCBBT)-을 선정하여 산화적 스트레스를 억제하는 능력을 조사해보았다. 이와 더불어 A549 비소세포폐암 세포주에서의 세포성장 억제 효과를 비교하고, 자가포식 유도 여부를 관찰하여 의미 있는 결과를 얻었기를 이를 보고하는 바이다.
제안 방법
- cells/well로 분주하여 안정화 시킨 후 적정농도로 처방 추출물을 처리하였다. 24시간동안 배양한 후 처방 추출물 처리농도에 따른 성장정도와 형태의 변화를 도립 현미경을 이용하여 50배의 배율로 관찰한 다음 사진 촬영을 하였다.
- 세포 배양용 6 well plate에 A549 세포를 1×105cells/well로 분주하여 안정화 시킨 후 각 처방 추출물을 적정농도로 처리하였다. 24시간동안 배양한 후 희석된 0.5 mg/ml 농도의 MTT용액을 200 ㎕씩 분주하고 2시간 동안 CO2 incubator에서 배양시킨 다음 배지와 MTT 시약을 깨끗하게 제거하고 dimethyl sulfoxide (DMSO)를2 ml씩 분주하여 well에 생성된 formazan crystals을모두 녹인 후 96 well plate에 200 ㎕씩 옮겨서 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) reader(Versa max, Molecular Devices, CA, USA)로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 세포에 대한 독성은 각각의 대조군의 평균 흡광도 값을 구하여 평균 흡광도 값에 대한 백분율로 나타내었다.
- 5% agarose gel에 100 V로 전기영동하였다. 30분 후 gel을 ethidium bromide (EtBr, Sigma-Aldrich Chemical Co.)로 염색하고 AlphaEase R gel image analysis software(Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA)을 이용하여 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상의 회복 정도를 관찰하였다.
- . 4가지 처방의 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상에 대한 방어 능력을 알아보기 위하여 A549 페암 세포로부터 gDNA를 추출하여 DNA 밴드의 밀도로 평가하였다. Fig.
- 이에 여러 가지 한약재로 이루어진 4가지 처방의 총 페놀 함량을 조사하였다. 4가지 처방의 총 폴리페놀 함량을 gallic acid equivalents (GAE)으로 구하였으며 그 값은 Table 2와 같다. 총 폴리페놀 함량은 목단피탕이 126.
- A549 세포에서 길경탕, 목단피탕, 삼소음, 삼출보비탕이 유발하는 세포 생존율 감소 현상을 알아보기 위하여 각 처방을 2 mg/ml까지의 농도로 24시간 동안 처리한 후, MTT assay를 이용하여 조사하였다. Fig.
- FRAP에 의한 처방추출물들의 항산화력을 측정하기 위하여 300 mM acetatebuffer (pH 3.6), 40 mM HCl에 용해한 10mM 2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ, Sigma-Aldrich Chemical Co.)및 20 mM FeCl3·6H2O를 각각 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합하여 FRAP 시약을 제조하였다.
- gDNA는 AquaPure Genomic DNA isolation Kit(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 사용방법에 따라 A549 폐암 세포로부터 추출하였다. 이를 위하여 A549 세포를 100 mm dish에 1×105cells/ml로 세포를 분주하여 37℃, 5% CO2incubator에서 24시간 배양 후 세포를 모으고, gDNA lysis 용매를 이용하여 세포를 용해한 후 protein precipitation 용매 100 ㎕를 첨가하였다.
- ) 4 ㎕를 혼합하여 최종부피가 40 ㎕가 되게 각 반응액의 부피를 설정하였다. 각 반응액의 부피 설정 후 gDNA, 추출물 시료, FeSO4, H2O2와 물을 혼합하여 실온에서 20분간 반응시켰다. 그 후 산화 반응을 정지시키기 위하여 10mM EDAT 4 ㎕를 첨가하고, 1.
- 각 반응액의 부피 설정 후 gDNA, 추출물 시료, FeSO4, H2O2와 물을 혼합하여 실온에서 20분간 반응시켰다. 그 후 산화 반응을 정지시키기 위하여 10mM EDAT 4 ㎕를 첨가하고, 1.5% agarose gel에 100 V로 전기영동하였다. 30분 후 gel을 ethidium bromide (EtBr, Sigma-Aldrich Chemical Co.
- ) 용액 150 ㎕에 처방추출물이 적정 농도로 희석된 시료 100 ㎕을 첨가한 후 37℃에서 30분간 반응시킨 후 518 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그리고 반응물에 대한 흡광도 값을 대조군에 대한 처방 추출물 시료의 DPPH radical 소거 활성으로 항산화 활성도를 나타내었으며, trolox를 양성대조군으로 비교하였으며, 음성 대조군으로는 0.4 mM DPPH 용액 대신 메탄올을 이용한 아래 식에 준하여 산출하였다.
- 조건하에서 배양하였다. 세포수의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 성장배지의 교환을 매 48시간마다 실시하여 적정수의 세포를 유지하였다.
- 실험을 하기 전에 gDNA의 양은 여러 농도의 gDNA를 전기영동하여 적정 농도를 설정한 후 FeSO4와 H2O2의 최종 농도는 각각 200 μM과 2mM이 되게 하여 동량을 첨가하였으며, gDNA 반응액은 물과 10 mM의 ethylenediaminetetraacetic acid(EDAT, Sigma-Aldrich Chemical Co.) 4 ㎕를 혼합하여 최종부피가 40 ㎕가 되게 각 반응액의 부피를 설정하였다.
- 적정 농도로 희석된 시료액 10 ㎕과 240 ㎕의 FRAP 시약을 혼합하고 37℃에서 5분간 반응시킨 후 593nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군(positive control)은 trolox (Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 사용하여 검량선을 작성하였으며, 결과는 mg trolox/g of sample DW로 나타내었다.
- 이를 위하여 A549 세포를 100 mm dish에 1×105cells/ml로 세포를 분주하여 37℃, 5% CO2incubator에서 24시간 배양 후 세포를 모으고, gDNA lysis 용매를 이용하여 세포를 용해한 후 protein precipitation 용매 100 ㎕를 첨가하였다.
- 또한 페놀계 물질들은 산화적 스트레스로부터 DNA 및 세포 수준의 손상을 억제하는 능력이 있는 것으로 알려져 있다19-21). 이에 여러 가지 한약재로 이루어진 4가지 처방의 총 페놀 함량을 조사하였다. 4가지 처방의 총 폴리페놀 함량을 gallic acid equivalents (GAE)으로 구하였으며 그 값은 Table 2와 같다.
- 4)으로 희석하였다. 적정농도로 희석한 시료 10 ㎕에 ABTS radical cation solution 190 ㎕ 를 가하여 실온에서 6분간 반응시켜 734 nm에서 흡광도를 측정하였으며 trolox를 양성 대조군으로 하여 다음 식에 준하여 항산화 효능을 비교하였다.
- . 짙은 보라색을 띄는 DPPH 라디칼이 페놀성 화합물, cysteine, glutathione, aromatic amine,ascorbic acid 등에 의해 전자를 얻고 환원되어 탈색되는 정도를 측정하였다13). 본 연구의 결과에 의하면,길경탕, 삼소음, 삼출보비탕은 DPPH radical 소거능이 거의 없었으나, 목단피탕은 저농도부터 높은 소거능을 보여 농도 의존적으로 소거능이 증가하였다(Fig.
- 처방 추출물에 의한 A549 세포의 형태 변화 정도를 살펴보기 위하여 세포배양용 6 well plate에 세포를 1×105cells/well로 분주하여 안정화 시킨 후 적정농도로 처방 추출물을 처리하였다.
- 폐옹은 폐농양과 같은 폐의 염증 상태에 가깝지만, 증상의 유사성으로 인해 폐적(肺積)·폐옹의 중증(重症)은 폐암의 표현으로 생각되어진다10). 폐옹을 치료하는 처방으로는 모두 12가지가 기재되어 있는데, 이 중 자가포식(autophagy)를 일으키는 것으로 알려진 길경11,12)이 포함된 4가지 처방-길경탕(桔梗湯, Gilgyung-tang. GGT), 목단피탕(牧丹皮湯, Mokdanpi-tang, MDPT), 삼소음(參蘇飮, Samso-eum, SSE), 삼출보비탕(參朮補脾湯, Samchulbobi-tang, SCBBT)-을 선정하여 산화적 스트레스를 억제하는 능력을 조사해보았다. 이와 더불어 A549 비소세포폐암 세포주에서의 세포성장 억제 효과를 비교하고, 자가포식 유도 여부를 관찰하여 의미 있는 결과를 얻었기를 이를 보고하는 바이다.
- 항산화능을 측정하기 위한 다른 방법으로 ABTS radical 소거능을 측정하였다. 이는 ABTS 자유 라디칼이 항산화 물질로부터 수소를 받아 ABTS 라디칼 특유의 청록색이 탈색되는 원리로 물질의 항산화능을 측정하는 방법으로 DPPH radical 소거 활성과 더불어 널리 사용되는 방법이다22).
대상 데이터
- 4가지의 처방(길경탕, 목단피탕, 삼출보비탕 및 삼소음)은 ㈜서경한방약업사(Busan, Korea)에서 각 처방구성의 형태로 구입하였으며 이들의 구성 한약재는 Table 1에 나타내었다. 열수 추출물을 얻기 위하여 약재 무게의 10배에 해당하는 증류수로 100℃에서 3시간 동안 추출하였다.
- 본 연구에 사용된 A549 인체 폐암세포(American Type Culture Collection, Rockville, MD)는 10% fetal bovine serum (Welgene, Daegu, Korea) 및 1%의 penicillin 및 streptomycin이 포함된 RPMI-1640 배지(Welgene)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 세포수의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 성장배지의 교환을 매 48시간마다 실시하여 적정수의 세포를 유지하였다.
데이터처리
- 5 mg/ml 농도의 MTT용액을 200 ㎕씩 분주하고 2시간 동안 CO2 incubator에서 배양시킨 다음 배지와 MTT 시약을 깨끗하게 제거하고 dimethyl sulfoxide (DMSO)를2 ml씩 분주하여 well에 생성된 formazan crystals을모두 녹인 후 96 well plate에 200 ㎕씩 옮겨서 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) reader(Versa max, Molecular Devices, CA, USA)로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 세포에 대한 독성은 각각의 대조군의 평균 흡광도 값을 구하여 평균 흡광도 값에 대한 백분율로 나타내었다.
- 각각의 평가 분석은 3반복 이상으로 하였으며 시료로부터 얻어진 실험 결과들의 유의성을 검정하기 위하여 분산분석을 실시한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range tests를 실시하였다.
이론/모형
- H2O2에 의한 DNA 산화는 Milne et al.18)의 방법에 준하여 실험하였다. 실험을 하기 전에 gDNA의 양은 여러 농도의 gDNA를 전기영동하여 적정 농도를 설정한 후 FeSO4와 H2O2의 최종 농도는 각각 200 μM과 2mM이 되게 하여 동량을 첨가하였으며, gDNA 반응액은 물과 10 mM의 ethylenediaminetetraacetic acid(EDAT, Sigma-Aldrich Chemical Co.
- The cells were treated with various concentrations of the indicated 4 prescriptions for 24 h. The alterations of cell viability were measured by MTT assay. Columns represent the mean ± SD of three independent experiments.
- 각 처방 추출물들에 함유된 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu reagent가 환원되면 molybdenum이 청색으로 발색되는 원리를 이용한 Singleton 등의 방법13,14)에 준하여 측정하였으며, gallic acid (Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 표준물질로 사용하였다. 이를 위하여 적정 실험 농도로 희석한 시료 50 ㎕에 2%의 Na2CO3 1 ml을 첨가하고 2분간 실온에 방치한 후 50% Folin-Ciocalteu reagent (Sigma-Aldrich Chemical Co.
- 시료의 환원력은 전자공여를 통한 라디칼의 소거능과 관련이 높은 것으로 알려져 있으므로20), 산화반응의 촉매제로 작용하는 금속이온을 환원시키는 효력을 측정하는 방법인 FRAP 법을 이용하여 4가지의 처방의 환원력을 측정하였다. 4가지 처방 중 가장 높은 환원력을 보인 처방은 목단피탕으로 166.
- 처방 추출물들의 항산화력을 측정하기 위한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazl (DPPH) radical에 대한 전자공여능은 Blios16)의 방법에 준하여 조사하였다. 이 방법은 DPPH radical에 전자를 공여함으로써 radical을 소거하는 효과를 측정하는 방법으로 0.
- 처방 추출물에 의한 세포의 성장억제 정도를 확인하기 위하여 MTT assay를 이용하였다. 세포 배양용 6 well plate에 A549 세포를 1×105cells/well로 분주하여 안정화 시킨 후 각 처방 추출물을 적정농도로 처리하였다.
- 추출물들의 항산화력을 측정하기 위한 2,2'-azinobis(3-ethybenzothiazolin-6-sulphonicacid) (ABTS) radical 소거능은 Re et al.17)의 방법에 준하여 조사하였다.
성능/효과
- 4가지 처방 중 가장 높은 환원력을 보인 처방은 목단피탕으로 166.74±23.17 mgTrolox/g으로 가장 낮은 환원력을 보인 길경탕에 비해 8배가량 높은 값을 나타내었다(Table 2).
- A549 세포에서 길경탕, 목단피탕, 삼소음, 삼출보비탕이 유발하는 세포 생존율 감소 현상을 알아보기 위하여 각 처방을 2 mg/ml까지의 농도로 24시간 동안 처리한 후, MTT assay를 이용하여 조사하였다. Fig.4에 나타낸 바와 같이 길경탕과 삼출보비탕은 세포 생존율 억제 효과가 거의 없었으며, 삼출보비탕은 2mg/ml 농도에서 약 20% 정도의 세포 성장 억제 효과가 있었다. 하지만, 목단피탕은 저농도에서부터 농도 의존적으로 세포 생존율을 감소시켰으며, IC50은 1.
- 폐옹을 치료하는 처방 중 길경이 포함된 4가지 처방인 길경탕, 목단피탕, 삼소음, 삼출보비탕의 항산화능평가를 위하여, 총 페놀 함량, FRAP 활성, DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능, DNA 손상 억제능을 조사한 결과 모든 항목에서 목단피탕이 가장 높은 효과를 나타내었다. 또한, A549 폐암 세포의 성장 억제 효과를 비교해 보았을 때도 목단피탕이 역시 세포 성장을 가장 효과적으로 억제하면서, 4가지 처방 모두에서 세포자식이 유도된 것으로 보이는 세포질 내 뚜렷한 공포를 확인하였다. 이러한 결과는 항산화능이 가장 높은 목단피탕이 A549 폐암 세포에서의 항암 효과도 가장 큼을 나타낸 결과로 목단피탕이 효과적인 폐암 치료제로의 가능성이 높을 수 있음을 시사하는 기초 연구로서 가치가 있을 것으로 생각된다.
- 짙은 보라색을 띄는 DPPH 라디칼이 페놀성 화합물, cysteine, glutathione, aromatic amine,ascorbic acid 등에 의해 전자를 얻고 환원되어 탈색되는 정도를 측정하였다13). 본 연구의 결과에 의하면,길경탕, 삼소음, 삼출보비탕은 DPPH radical 소거능이 거의 없었으나, 목단피탕은 저농도부터 높은 소거능을 보여 농도 의존적으로 소거능이 증가하였다(Fig. 1).
- 374 mg/ml으로 4가지 처방 중 가장 생존율 감소 효과가 크게 나타났다. 위의 모든 실험에서 가장 높은 항산화 효과를 보여준 목단피탕이 A549 폐암 세포의 성장 억제 효과도 가장 큼을 알 수 있었다.
- 또한 4가지 처방의 항산화능과 항암 능력을 비교하여 관련성을 연구는 없는 실정이다. 이번 논문에서 목단피탕은 총페놀함량이 가장 높았으며, 모든 항산화능을 가늠해보는 실험에서 가장 높은 활성을 나타내었으며, 폐암 세포의 증식 억제 효과도 가장 좋았다. 이는 항산화능을 가진 물질이 폐암 세포에서 강한 세포독성 효과를 나타내는 다른 논문들과 같은 결과이다36).
- 이는 ABTS 자유 라디칼이 항산화 물질로부터 수소를 받아 ABTS 라디칼 특유의 청록색이 탈색되는 원리로 물질의 항산화능을 측정하는 방법으로 DPPH radical 소거 활성과 더불어 널리 사용되는 방법이다22). 이번 실험에서도 목단피탕이 가장 높은 radical 소거 활성을 보였으나, 나머지 세 가지 처방도 농도가 증가할수록 radical 소거활성이 증가되어 90% 내외의 높은 소거능을 보였다(Fig. 2).
- 총 폴리페놀 함량은 목단피탕이 126.56±12.98 mg GAE/g으로 가장 높았으며, 다음으로 삼소음, 길경탕, 삼출보비탕 순서로 함량이 낮아졌다.
- 5에 나타낸 바와 같이, H2O2로 손상되어 없어진 밴드가 처방을 처리하였을 경우 모든 처방에서 밴드가 다시 나타났다. 특히 목단피탕은 저농도에서부터 좋은 보호 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다(Fig. 3). 이는 처방에 포함되어 있는 항산화제 역할을 하는 화합물들이 H2O2를 비롯한 활성산소종에 의한 세포 손상을 방어하는 능력이 있음을 보여주는 것으로 앞선 다른 연구들과 유사하게 목단피탕이 가장 높은 항산화능을 가지고 있음을 알 수 있다.
- 폐옹을 치료하는 처방 중 길경이 포함된 4가지 처방인 길경탕, 목단피탕, 삼소음, 삼출보비탕의 항산화능평가를 위하여, 총 페놀 함량, FRAP 활성, DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능, DNA 손상 억제능을 조사한 결과 모든 항목에서 목단피탕이 가장 높은 효과를 나타내었다. 또한, A549 폐암 세포의 성장 억제 효과를 비교해 보았을 때도 목단피탕이 역시 세포 성장을 가장 효과적으로 억제하면서, 4가지 처방 모두에서 세포자식이 유도된 것으로 보이는 세포질 내 뚜렷한 공포를 확인하였다.
- 4에 나타낸 바와 같이 길경탕과 삼출보비탕은 세포 생존율 억제 효과가 거의 없었으며, 삼출보비탕은 2mg/ml 농도에서 약 20% 정도의 세포 성장 억제 효과가 있었다. 하지만, 목단피탕은 저농도에서부터 농도 의존적으로 세포 생존율을 감소시켰으며, IC50은 1.374 mg/ml으로 4가지 처방 중 가장 생존율 감소 효과가 크게 나타났다. 위의 모든 실험에서 가장 높은 항산화 효과를 보여준 목단피탕이 A549 폐암 세포의 성장 억제 효과도 가장 큼을 알 수 있었다.
후속연구
- 또한, A549 폐암 세포의 성장 억제 효과를 비교해 보았을 때도 목단피탕이 역시 세포 성장을 가장 효과적으로 억제하면서, 4가지 처방 모두에서 세포자식이 유도된 것으로 보이는 세포질 내 뚜렷한 공포를 확인하였다. 이러한 결과는 항산화능이 가장 높은 목단피탕이 A549 폐암 세포에서의 항암 효과도 가장 큼을 나타낸 결과로 목단피탕이 효과적인 폐암 치료제로의 가능성이 높을 수 있음을 시사하는 기초 연구로서 가치가 있을 것으로 생각된다.
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