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문제 정의
- 본 연구에서는 2014년도에 출시된 Yfiler® PLUS PCR Amplification Kit (이하 Yfiler plus 키트)를 2004 년도에 출시되어 본 기관에서 DNA 감정에 오랜 기간 사용되었던 AmpF/STR® YfilerTM PCR Amplification Kit (이하 Yfiler 키트)와 비교함으로써 민감도 차이를 관찰하고, 법과학 현장 시료 중 DNA의 농도가 적은 시료에서의 활용 가능성에 대해 분석하고자 하였다. Yfiler 키트는 17개의 STR 좌위 (DYS456, DYS389I, DYS390, DYS389Ⅱ, DYS458, DYS19, DYS385, DYS393, DYS391, DYS439, DYS635, DYS392, DYS437, DYS438, DYS448, GATA H4)를 포함하고 있고, 7 Yfiler plus 키트는 기존 Yfiler 키트에 포함되었던 17개의 Y-STR 좌위를 공통 좌위로 포함하면서 10개의 새로운 Y-STR 좌위 (DYS576, DYS627, DYS460, DYS518, DYS570, DYS449, DYS481, DYF387S1, DYS533) 가추가되어 총 27개의 좌위를 동시에 증폭할 수 있는 키트이다.
- 본 연구에서는 Yfiler 키트와 Yfiler plus 키트의 비교를 위해 표준 DNA를 다양한 농도로 증폭하였고, 법과학 현장시료 중 DNA 농도가 낮은 시료 16 개를 선별하여 미량의 DNA시료에서의 활용 가능성에 대한 분석을 수행하였다. 표준 DNA를 사용한 두 키트 간의 비교 분석결과에서 Yfiler plus 키트는 0.
- 5 ng 미만인 미량시료 (low copy number samples) 16개를 선별하여 키트 간의 비교 실험을 수행하여 실제 현장 증거물에서의 검출률 차이를 관찰하였다. 분석된 결과를 통해 Yfiler plus 키트가 기존의 Yfiler 키트보다 비교적 높은 민감도로 증폭이 되었고, 농도가 낮은 현장 시료에서 더욱 활용 가능성이 있음을 관찰하였으며, 이를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 5 µL를 혼합하여 반응시켰고, PCR 조건은 95oC 11분 pre-denaturation → 94oC 1분 denaturation, 61oC 1분 annealing→ 72oC 1분 extension, 30회 반응→ 60oC 80분 final- extension 과정으로 진행하였다. Yfiler plus 키트의 증폭은 총 20 µL로 Primer set 5 µL, 2X Reaction master mix 10 µL, 주형 DNA 1 µL, 증류수 4 µL를혼합하여 반응시켰고, PCR 조건은 95oC 1분 pre- denaturation→94oC 4초 denaturation→61oC 1분 annealing/extension 30회 반응→60oC 22분 final- extension 과정으로 진행하였다.
- 1 µL의 LIZTM 600 size standard (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 혼합하여 준비하였다. 모든 시료는 3500xL Genetic Analyzer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)로 모세관 전기영동을 실시하였고, GeneMapper® ID-X v1.4 Software (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 이용하여 RFU (relative fluorescent units) 50 기준으로 분석하였다.
- 본 연구에서는 Yfiler 키트와 Yfiler plus 키트의 민감도 차이를 확인하고자 표준 DNA를 희석하여 농도별로 증폭하였고, 법과학 현장시료 중 농도가 0.5 ng 미만인 미량시료 (low copy number samples) 16개를 선별하여 키트 간의 비교 실험을 수행하여 실제 현장 증거물에서의 검출률 차이를 관찰하였다. 분석된 결과를 통해 Yfiler plus 키트가 기존의 Yfiler 키트보다 비교적 높은 민감도로 증폭이 되었고, 농도가 낮은 현장 시료에서 더욱 활용 가능성이 있음을 관찰하였으며, 이를 보고하고자 한다.
- 실제 현장 증거물에서의 적용 가능성에 대한 검토를 위하여 법과학 현장시료 16개를 Yfiler 키트와 Yfiler plus 키트로 증폭하여 검출률을 비교하였다. 현장 시료는 모두 0.
- 정량된 현장시료 DNA는 모두 1 µL를 주형으로 사용하여 AmpF/STR® YfilerTM PCR Amplification Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)와 Yfiler® PLUS PCR Amplification Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 이용하여 증폭하였다. Yfiler 키트를 사용한 증폭은 총 20µL로 Primer set 4µL, 5X Reaction master mix 8µL, AmpliTaq Gold DNA polymerase 0.
- 추출하였다. 추출된 DNA는 Quantifier® DUO DNA Quantification Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)로 정량하였고, 13 7500 System SDS Software v1.2.3 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 이용하여 정량 값을 분석하였으며, 2회 반복 실험하였다(Table 3).
- 표준 DNA 2800M, 007을 모두 동일한 농도로 희석하여 Yfiler 키트와 Yfiler plus 키트로 증폭한 후, 두 키트의 17개 공통좌위에 대한 검출 Y-STR 유전자형 (called allele) 개수 비율을 퍼센트로 계산하여 검출률 (detection rate)을 분석함으로써 두 키트의 민감도를 비교하였다. 그 결과, 2800M 표준 DNA는 0.
- 현장시료의 DNA는 QIAamp DNA micro kit (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 사용자 지침서에 따라 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 Quantifier® DUO DNA Quantification Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)로 정량하였고, 13 7500 System SDS Software v1.
대상 데이터
- 5 ng 미만인 미량시료 16개를 선별했다. 농도가 낮은 DNA에서 검출된 프로필은 drop-out 혹은 drop-in 현상이 일어날 수 있으므로12 검출된 프로필을 대조하기 위한 시료가 함께 요구되기에 대조시료 개념으로 농도가 1 ng 이상의 현장시료가 함께 의뢰된 사건들 중에서 선별하였다. 대조시료의 종류는 혈흔, 담배꽁초, 모발 등 (자료미 제시)이다.
- 농도가 낮은 DNA에서 검출된 프로필은 drop-out 혹은 drop-in 현상이 일어날 수 있으므로12 검출된 프로필을 대조하기 위한 시료가 함께 요구되기에 대조시료 개념으로 농도가 1 ng 이상의 현장시료가 함께 의뢰된 사건들 중에서 선별하였다. 대조시료의 종류는 혈흔, 담배꽁초, 모발 등 (자료미 제시)이다.
- 표준 DNA는 2800M (Promega, Madison, WI)과 007 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 두 종류를 사용하여 각각 0.5 ng, 0.25 ng, 0.125 ng, 0.0625 ng, 0.0313 ng, 0.0156 ng, 0.0078 ng으로 희석하여 준비하였다. 현장시료는 DNA 농도가 0.
- 현장 시료는 모두 0.5 ng 미만인 미량시료로 선별되었다. 분석 결과, 표준 DNA 실험에서는 0.
- 0078 ng으로 희석하여 준비하였다. 현장시료는 DNA 농도가 0.5 ng 미만인 미량시료 16개를 선별했다. 농도가 낮은 DNA에서 검출된 프로필은 drop-out 혹은 drop-in 현상이 일어날 수 있으므로12 검출된 프로필을 대조하기 위한 시료가 함께 요구되기에 대조시료 개념으로 농도가 1 ng 이상의 현장시료가 함께 의뢰된 사건들 중에서 선별하였다.
성능/효과
- 0313 ng 이상의 농도에서 27개 Y- STR 유전자형이 100% 검출되는 결과를 관찰하였다. 0.0156 ng, 0.0078 ng의 농도에서 2800M DNA는 각각 77.78%, 55.56%의 검출률을, 007 DNA는 각각 81.48%, 77.78%의 검출률을 보였으며, 농도가 낮아지면서 불검출(not detected, ND) 확률이 높아지는 특정 좌위는 관찰되지 않았다(Table 2). 본 결과를 통해 Yfiler plus 키트가 Yfiler 키트보다 공통좌위에 대한민감도가 높을 뿐만 아니라 27개 전체 좌위에 대한 검출률이 높아 농도가 낮은 시료의 분석에 도움을 줄 것으로 사료된다.
- 0313 ng 이하의 농도에서 키트간의 검출률 차이를 보였다. 0.0313 ng의 농도에서는 Yfiler 키트를 사용한 경우 88.24%의 검출률을 보인 반면, Yfiler plus 키트를 사용한 경우 100%의 검출률을 보이며 11.76%의 차이를 나타냈고, 0.0156 ng에서 Yfiler 키트는 58.82%, Yfiler plus 키트는 76.47%로 17.65% 의 차이를 보이며 Yfiler plus 키트가 Yfiler 키트보다 민감도가 높음을 관찰하였다. 교차 검증의 의미로 수행된 007 표준 DNA를 이용한 실험에서는 0.
- Yfiler plus 키트는 10개의 Y-STR 좌위를 추가로 한 27좌위에 대해 검출된 Y-STR 유전자형의 개수를추가적으로 분석하였는데 2800M 표준 DNA와 007 표준 DNA 모두 0.0313 ng 이상의 농도에서 27개 Y- STR 유전자형이 100% 검출되는 결과를 관찰하였다. 0.
- 하지만 표준 DNA는 농도가 낮을수록 검출률이 낮아지는 상관관계가 관찰되는 반면, 현장시료에서는 DNA의 농도와 검출률 사이의 상관관계를 보이지 않았다. Yfiler 키트를 사용한 검출률 결과를 시료의 농도와 비교하여 보았을 때, 시료 No.11(젖은 담배꽁초), No.13 (커피 캔을 닦은 면봉)의 경우 농도는 각각 0.017 ng, 0.0149 ng 이지만 검출률은 각각 17.65%, 29.41%로, 농도가 가장 낮은 시료 No.16 (일회용 주사기)의 검출률 58.82%보다 현저히 낮았다(Table 3). 이는 현장시료의 특성상 채취일, 보관상태, 외부 오염의 정도, 현장시료에 묻은 인체시료의 종류 등 다양한 요인에 의해 분리 및 증폭 과정이 영향을 받기 때문이고, 이와 유사한 사례가 보고된바 있다.
- 78% 검출률이 증가하였다. 검출된 Y-STR 유전자형의 개수를 비교하였을 때는 포함된 좌위의 개수가 많은 Yfiler plus 키트를 사용함으로써 전체의 시료로부터 더 많은 Y-STR 유전자형을 확보할 수 있었지만, 검출률을 비교했을 때는 일부 Yfiler 키트와 검출률이 차이가 나지 않거나 더 낮은 결과를 보인 경우도 관찰되었다. 하지만 각 현장시료마다 차이는 있지만 최대 29.
- 공통좌위 17개에 대한 두 키트간의 검출률 비교에서 전반적으로 Yfiler plus 키트의 사용이 검출률을 향상시켰으나 3개의 시료 No.7, No.12, No.15는 두 키트 간에 차이가 없었고, No.16은 오히려 Yfiler plus의 검출률이 더 낮았다. 하지만 공통좌위의 검출률에 대한 평균을 비교하면 Yfiler plus의 사용으로 4.
- 65% 의 차이를 보이며 Yfiler plus 키트가 Yfiler 키트보다 민감도가 높음을 관찰하였다. 교차 검증의 의미로 수행된 007 표준 DNA를 이용한 실험에서는 0.0313 ng 이상의 농도에서 두 키트 모두 100%의 검출률을 보였지만, 0.0156 ng, 0.0078 ng의 농도에서 각각 5.88%, 17.65%의 검출률 차이를 보이며 Yfiler plus 키트의 높은 민감도가 확인되었다(Table 2).
- 그 결과, 2800M 표준 DNA는 0.0625 ng 이상의 농도에서 두 키트 모두 100%의 검출률을 보였고, 0.0313 ng 이하의 농도에서 키트간의 검출률 차이를 보였다. 0.
- 78%의 검출률을 보였으며, 농도가 낮아지면서 불검출(not detected, ND) 확률이 높아지는 특정 좌위는 관찰되지 않았다(Table 2). 본 결과를 통해 Yfiler plus 키트가 Yfiler 키트보다 공통좌위에 대한민감도가 높을 뿐만 아니라 27개 전체 좌위에 대한 검출률이 높아 농도가 낮은 시료의 분석에 도움을 줄 것으로 사료된다.
- 5 ng 미만인 미량시료로 선별되었다. 분석 결과, 표준 DNA 실험에서는 0.0313 ng 이하의 농도에서 불검출 좌위가 관찰되었고, 현장시료에서는 0.0626 ng 농도 이하에서 불검출 좌위가 관찰되었다. 하지만 표준 DNA는 농도가 낮을수록 검출률이 낮아지는 상관관계가 관찰되는 반면, 현장시료에서는 DNA의 농도와 검출률 사이의 상관관계를 보이지 않았다.
- 실험에 사용된 미량의 현장시료의 종류는 젖은 담배꽁초, 일회용 주사기, 안경을 닦은 면봉 등이고, 관련 사건의 유형은 절도, 재물손괴, 마약류관리법 위반 등으로 시료의 종류 및 사건유형에 다양성을 주었다 (Table 1).
- 게다가 Yfiler plus 키트의 마커가 27개로 Yfiler 키트보다 10개가 많다는 장점 때문에 검출된 Y-STR 유전자형의 개수는 모든 시료에서 증가하였다. 즉, No.7, No.12, No.15, No.16에서 검출된 전체 Y-STR 유전자형의 개수를 비교해보면 Yfiler 사용한 경우 각각 16개, 8개, 7개, 10개 검출되었고, Yfiler plus 키트를 사용한 경우 검출된 Y-STR 유전자형의 개수가 각각 25개, 13개, 15 개, 12개로 모두 증가하였다.
- 분석을 수행하였다. 표준 DNA를 사용한 두 키트 간의 비교 분석결과에서 Yfiler plus 키트는 0.0313 ng 이상의 농도에서 모든 좌위의 Y-STR 유전자형이 검출되어 Yfiler 키트보다 더 높은 민감도를 보였고 표준 DNA의 농도가 증가됨에 따라 검출률이 증가되는상관관계를 보였다. 현장시료를 사용한 비교 분석 결과에서는 현장시료가 다양한 요인으로 인해 영향을 받기 때문에 시료의 농도와 검출률의 상관관계는 보이지 않았으나, Yfiler plus 키트를 사용한 경우 평균 4.
- 검출된 Y-STR 유전자형의 개수를 비교하였을 때는 포함된 좌위의 개수가 많은 Yfiler plus 키트를 사용함으로써 전체의 시료로부터 더 많은 Y-STR 유전자형을 확보할 수 있었지만, 검출률을 비교했을 때는 일부 Yfiler 키트와 검출률이 차이가 나지 않거나 더 낮은 결과를 보인 경우도 관찰되었다. 하지만 각 현장시료마다 차이는 있지만 최대 29.4%의 검출률이 향상된 결과를 보인 시료가 관찰되었으며, 키트에 포함되어 있는 좌위가 27개로 확보할 수 있는 좌위가 증가한다는 장점과 더불어 현장 시료에서 분석된 민감도 향상은 DNA 농도가 낮은 현장 시료에서 Yfiler plus 키트의 적용이 기존의 Yfiler 키트보다 효율적인 분석기법이 될 수 있음을 보여주었다. 추후 여성과 남성이 혼합된 현장시료에서의 분석 및 최근 개발된 다른 분석 키트들 간의 상호비교 등 추가적인 연구가 요구되고, 법과학적 증거력과 신뢰성 향상을 위해서 한국인 집단에서의 집단유전학적 분석이 수행되어야 할 것이다.
- 16은 오히려 Yfiler plus의 검출률이 더 낮았다. 하지만 공통좌위의 검출률에 대한 평균을 비교하면 Yfiler plus의 사용으로 4.78% 검출률이 향상되었고, 최대 29.4% 검출률이 향상된 시료(No. 10, 일회용주사기)도 관찰되었다. 게다가 Yfiler plus 키트의 마커가 27개로 Yfiler 키트보다 10개가 많다는 장점 때문에 검출된 Y-STR 유전자형의 개수는 모든 시료에서 증가하였다.
- 0313 ng 이상의 농도에서 모든 좌위의 Y-STR 유전자형이 검출되어 Yfiler 키트보다 더 높은 민감도를 보였고 표준 DNA의 농도가 증가됨에 따라 검출률이 증가되는상관관계를 보였다. 현장시료를 사용한 비교 분석 결과에서는 현장시료가 다양한 요인으로 인해 영향을 받기 때문에 시료의 농도와 검출률의 상관관계는 보이지 않았으나, Yfiler plus 키트를 사용한 경우 평균 4.78% 검출률이 증가하였다. 검출된 Y-STR 유전자형의 개수를 비교하였을 때는 포함된 좌위의 개수가 많은 Yfiler plus 키트를 사용함으로써 전체의 시료로부터 더 많은 Y-STR 유전자형을 확보할 수 있었지만, 검출률을 비교했을 때는 일부 Yfiler 키트와 검출률이 차이가 나지 않거나 더 낮은 결과를 보인 경우도 관찰되었다.
후속연구
- 4%의 검출률이 향상된 결과를 보인 시료가 관찰되었으며, 키트에 포함되어 있는 좌위가 27개로 확보할 수 있는 좌위가 증가한다는 장점과 더불어 현장 시료에서 분석된 민감도 향상은 DNA 농도가 낮은 현장 시료에서 Yfiler plus 키트의 적용이 기존의 Yfiler 키트보다 효율적인 분석기법이 될 수 있음을 보여주었다. 추후 여성과 남성이 혼합된 현장시료에서의 분석 및 최근 개발된 다른 분석 키트들 간의 상호비교 등 추가적인 연구가 요구되고, 법과학적 증거력과 신뢰성 향상을 위해서 한국인 집단에서의 집단유전학적 분석이 수행되어야 할 것이다.
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