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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 청미래 덩굴 뿌리 추출물의 미백에 대한 효소 및 세포 실험을 실시하여 그 효능을 입증하고 기능성화장품 소재로서의 가능성을 검토하고자 하였다.
제안 방법
- 1차 항체를 희석하여 4oC에서 over night 한 다음, 다시 10분 간격으로 tris-buffered saline and tween 20(TBST)로 3회 세척하고 2차 항체를 1:1,000으로 희석하여 실온에서 2시간 배양하였다. 3회 세척한 후 LAS 4,000 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량하였다.
- DEPC를 50 μl씩 분주하여 녹인 후 96 well plate에 RNA 5 μl와 멸균수 195 μl를 첨가 하여 260, 280 nm에서 각각 흡광도를 측정하여 total RNA 양을 측정하였다.
- PCR tube에 Go Flexi DNA polymerase, primer 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)는 94oC 에서 30초, 55oC에서 45초, 72oC에서 45초(35 cycles), tyrosinase는 94oC에서 30초, 60oC에서 45초, 72oC 45초(40 cycles), TRP-1, TRP-2, MITF는 94oC에서 30초, 58oC에서 45초, 72oC에서 45초(40 cycles)을 하였다. PCR로 합성시킨 후 0.
- Oligo(dT) 15 primer(500 μg/ml) 1 μl, 추출한 RNA(2 μg)와 nuclease free water로 10 μl를 맞추고 75oC에서 5분간 반응시킨 후 5X reaction buffer, MgCl2 , PCR necleotide mix, rnasin inhibitor, reverse transcriptase, nuclease free water를 첨가하여 25oC에서 5분, 42oC에서 60분, 70oC에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다.
- Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)는 94oC 에서 30초, 55oC에서 45초, 72oC에서 45초(35 cycles), tyrosinase는 94oC에서 30초, 60oC에서 45초, 72oC 45초(40 cycles), TRP-1, TRP-2, MITF는 94oC에서 30초, 58oC에서 45초, 72oC에서 45초(40 cycles)을 하였다. PCR로 합성시킨 후 0.002% ethidium bromide를 첨가한 1.5% agarose gel에 100 V에서 40분간 전기영동 후 LAS 4,000을 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.
- 따라서 이하의 멜라노마 세포의 미백관련 신호전달 인자 측정은 생존율이 100%에 가까운 농도인 5, 25, 50 μg/ml의 농도로 확인하였다.
- 멜라노마 세포(B16F10)을 96 well plate에 5 × 104cells/well이 되게 0.18 ml 분주하고, 시료를 농도 별로 조제하여 0.02 ml 첨가한 후 37°C, 5% CO2 세포배양기에서 24시간 배양하였다.
- 미백인자인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 polymerase chain reaction(PCR)을실시하였다. 실험에 사용한 primer sequences는 Table 1과같다.
- 미백인자인 Microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase related protein 1(TRP-1), tyrosinase related protein 2(TRP-2), tyrosinase의 활성을 보기 위하여 멜라노마 세포를 100 mm tissue culture dish에 cell seeding 후 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화 시켰다. 배지를 제거한 후 추출물을 농도별로 처리한 배지로 24-48시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 phosphate buffered saline(PBS)로 2번 세척해 주었다.
- 본 연구에서는 청미래 덩굴 뿌리 추출물의 미백효과를 확인하기 위해서 tyrosinase 저해활성 및 미백관련 인자인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의 단백질 및 유전자 발현 억제 효과를 western blot, reverse transcription-PCR 및 real time-PCR을 측정하였다. 그 결과 우수한 tyrosinase 저해활성을 확인하였고, 미백관련 인자 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 단백질 및 유전자 발현측정에서도 4가지 인자 모두 발현이 억제됨으로써 미백 효능이 있음을 확인할 수 있었다.
- 1의 절차에 따라 에탄올과 열수 추출을 실시하였다. 시료의 에탄올 추출물은 70% 에탄올 10배의 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였고, 열수 추출물은 증류수 10배의 양을 가하여 80oC에서 3시간 가량 환류 냉각 추출해 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 시료 추출물은 여과지(Whatman No.
- 청미래 덩굴 뿌리 에탄올 추출물이 멜라닌 합성에 관계된 효소인 tyrosinase에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma cell에 농도별로 5, 25, 50 μg/ml 처리한 후 24시간 뒤에 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 단백질 발현을 western blotting으로 확인하였다. 이때 세포의 여러 조건에서도 그 발현 정도의 차이가 거의 없는 house keeping gene인 GAPDH를 positive control로 사용하였다. Fig.
- 청미래 덩굴 뿌리 에탄올 추출물이 멜라닌 합성에 관계된 key enzyme인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase mRNA에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma cell에 농도별로 5, 25, 50 μg/ml 처리한 후 24시간 뒤에 reverse transcription-polymerase chain reaction(PCR)으로 mRNA 발현량을 측정하였다.
- 청미래 덩굴 뿌리 에탄올 추출물이 멜라닌 합성에 관계된 효소인 tyrosinase에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10 mouse melanoma cell에 농도별로 5, 25, 50 μg/ml 처리한 후 24시간 뒤에 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 단백질 발현을 western blotting으로 확인하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 청미래 덩굴 뿌리는 ㈜청명약초에서 구입하여 Fig. 1의 절차에 따라 에탄올과 열수 추출을 실시하였다. 시료의 에탄올 추출물은 70% 에탄올 10배의 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였고, 열수 추출물은 증류수 10배의 양을 가하여 80oC에서 3시간 가량 환류 냉각 추출해 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다.
- 본 실험에 이용한 세포의 배양은 10% FBS와 1% penicillin/streptomycin(100 U/ml)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였으며, 37oC, 5% CO2 세포배양기에 적응시켜 계대 배양하였다.
데이터처리
- 추출한 RNA(2 μg)와 Oligo (dT) 15primer(500 μg/ml) 1 μl, nuclease free water와 혼합한 뒤 75oC에서 5분, 얼음에서 5분 반응시킨 후 5X reaction buffer, MgCl2 , PCR necleotide mix, rnasin inhibitor, reverse transcriptase, nuclease free water를 첨가하여 25oC에서 5분, 42oC에서 60분, 70oC에서 15분간 반응시켜 cDNA를 합성시켰다. 합성한 cDNA와 2X SYBR green mix, primer, ROX를 각각 넣어 ABI step one pluse(Applied biosystem, USA) 기기를 이용하여 실시간 정량 분석을 한 뒤 analysis program을 이용하여 결과를 분석하였다.
이론/모형
- Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법[21]에 따라 측정하였다. 반응구는 67 mM sodium phosphate buffer (pH 6.
- 세포 생존율 측정은 Carmichael의 방법[2]에 따라 측정하였다. 멜라노마 세포(B16F10)을 96 well plate에 5 × 104cells/well이 되게 0.
성능/효과
- Fig. 4-7과 같이 청미래 덩굴 뿌리 에탄올 추출물을 농도별로 5, 25, 50 μg/ml을 처리한 B16F10군에서 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 단백질 발현이 추출물을 처리하지 않은 군보다 감소하였고 대조군인 kojic acid와 비교적 비슷한 발현을 나타내었음을 확인할 수 있었다.
- Fig. 8-11에서 보는 바와 같이 청미래 덩굴 뿌리 에탄올 추출물을 농도별로 5, 25, 50 μg/ml을 처리한 B16F10군에서는 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase mRNA 발현이 처리하지 않은 군보다 억제되었음을 확인하였다.
- 본 연구에서는 청미래 덩굴 뿌리 추출물의 미백효과를 확인하기 위해서 tyrosinase 저해활성 및 미백관련 인자인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의 단백질 및 유전자 발현 억제 효과를 western blot, reverse transcription-PCR 및 real time-PCR을 측정하였다. 그 결과 우수한 tyrosinase 저해활성을 확인하였고, 미백관련 인자 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 단백질 및 유전자 발현측정에서도 4가지 인자 모두 발현이 억제됨으로써 미백 효능이 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 청미래 덩굴 뿌리 추출물이 미백 효능을 가짐으로써 화장품 소재로 응용이 가능할 것으로 판단된다.
- 이러한 방법으로 청미래 덩굴 뿌리 에탄올 추출물과 열수 추출물의 tyrosinase 저해효과를 측정한 결과 Fig. 2와 같이 청미래 덩굴 뿌리 에탄올 추출물과 열수 추출물은 각각 1,000 μl/ml에서 77.6%, 40.2%의 활성을 나타내었다.
- 청미래 덩굴 뿌리 에탄올 추출물은 100 μg/ml에서 89% 이상의 세포 생존율을 확인할 수 있었다.
- 12-15와 같이 나타 내었다. 청미래 덩굴 뿌리 에탄올 추출에서 모두 농도 의존적으로 감소 되었음을 확인할 수 있었다. 특히 MITF, TRP-1, tyrosinase의 mRNA 발현이 현저하게 억제되었으며 mRNA 역전사 반응, 실시간 정량 분석을 시행한 결과, 청미래 덩굴 뿌리 에탄올 추출물이 멜라닌 생성 억제에 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 청미래 덩굴 뿌리 에탄올 추출에서 모두 농도 의존적으로 감소 되었음을 확인할 수 있었다. 특히 MITF, TRP-1, tyrosinase의 mRNA 발현이 현저하게 억제되었으며 mRNA 역전사 반응, 실시간 정량 분석을 시행한 결과, 청미래 덩굴 뿌리 에탄올 추출물이 멜라닌 생성 억제에 효과가 있는 것으로 사료된다.
후속연구
- 그 결과 우수한 tyrosinase 저해활성을 확인하였고, 미백관련 인자 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 단백질 및 유전자 발현측정에서도 4가지 인자 모두 발현이 억제됨으로써 미백 효능이 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 청미래 덩굴 뿌리 추출물이 미백 효능을 가짐으로써 화장품 소재로 응용이 가능할 것으로 판단된다.
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