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문제 정의
- 본 연구에서는 김치로부터 protease 및 CPP의 생산 능력이 높은 유산균을 분리 동정하였고 CPP의 생산 조건과 특성을 조사하였다.
- 본 연구에서는 전국 가정집에서 제조한 김치로부터 분리한 유산균들 중에서 protease 활성 및 CPP 생산 능력이 가장 높은 균주인 strain 0301을 동정하였고 해당 균주의 특성과 CPP 생산 최적 조건을 조사하였다. 0301은 0.
제안 방법
- 1차 선별 균주에 대해서 2.0% skim milk가 첨가된 MRS 배지에서 protease 활성을 지녀 clear zone을 형성하는 균주를 2차로 선별한 후, azocasein(Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA)을 사용하여 단백질 분해 효소 활성을 측정하였다[2]. 2차 선별 균주를 MRS broth에 접종하여 37℃에서 48시간 정치 배양한 다음 원심 분리하여 그 상등액을 조효소액으로 사용하였다.
- CPP와 칼슘의 결합 능력을 통해 칼슘 함량을 측정하여 CPP 함량을 간접적으로 보았으며, 과망간산칼륨을 이용한 적정법과 ICP를 사용한 분석법을 통해 이를 확인하였다. Protease 활성은 Lactobacillus casei KCCM 12452 균주와 CPP를 생산한다고 밝혀진 Enterococcus faecalis KCCM 40450 균주를 대조군으로 하여 비교하였다.
- CPP와 칼슘의 결합 능력을 통해 칼슘 함량을 측정하여 CPP 함량을 간접적으로 보았으며, 과망간산칼륨을 이용한 적정법과 ICP를 사용한 분석법을 통해 이를 확인하였다. Protease 활성은 Lactobacillus casei KCCM 12452 균주와 CPP를 생산한다고 밝혀진 Enterococcus faecalis KCCM 40450 균주를 대조군으로 하여 비교하였다. 과망간산칼륨을 통한 적정법을 이용하여 유리 칼슘 함량을 측정한 결과, Fig.
- 고주파 유도 결함 플라스마(Inductively Coupled Plasma, ICP)를 이용한 발광 분석법을 이용해 동결 건조된 CPP의 칼슘 유리화 능력을 확인하였다.
- 균주의 염색체 DNA를 추출한 후 7F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'), 1492R(5'- GGATACCTTGTTACGACTT-3') primer를사용하여 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하였다[18].
- CPP 생산 활성 테스트를 통해 0301 균주가 다른 균주들과 비교하여 CPP의 생산 능력이 뛰어난 것을 확인할 수 있 었다. 따라서 0301 균주를 최종적으로 선별하여 형태학적 및 생화학적 특성을 분석하였다. 그 결과, 0301 균주는 Gram 양성 세균이며, KOH와 catalase test에서 각각 음성을 나타내었다.
- , Tokyo, Japan)하에서 형태학적 특성을 관찰하였다. 또한 Gram 염색, 3% KOH 실험, catalase 실험 및 API CHL 50 kit와 API 20 strep kit(bioMerieux Ltd, France)를 이용하여 균주의 생화학적 특성을 분석하였다.
-
16S rDNA 유전자 염기서열 분석
분리 균주의 분자생물학적인 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열 분석을 실시하였다. 균주의 염색체 DNA를 추출한 후 7F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'), 1492R(5'- GGATACCTTGTTACGACTT-3') primer를사용하여 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하였다[18].
- 여과된 용액을 60−80oC로 가열하여 0.02 N 과망간산칼륨 용액으로 색이 무색에서 적색이 될 때까지 적정하였다.
- 이후 원심분리(10,000 × g, 10 min, 4℃)하여 상등액 10 ml를 ICP(Optima 8300 ICO-OES Spectrometer, PerkinElmer, USA)로 2회 반복 측정하여 칼슘 함량의 평균값을 구하였다.
- 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM) [S-4300, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)하에서 형태학적 특성을 관찰하였다. 또한 Gram 염색, 3% KOH 실험, catalase 실험 및 API CHL 50 kit와 API 20 strep kit(bioMerieux Ltd, France)를 이용하여 균주의 생화학적 특성을 분석하였다.
- 균주의 염색체 DNA를 추출한 후 7F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'), 1492R(5'- GGATACCTTGTTACGACTT-3') primer를사용하여 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하였다[18]. 증폭된 DNA 염기서열은 DNA Analyzer(ABI PRISM 3730, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 분석하였다. 분석한 염기서열은 BLAST 프로그램을 통해서 GENEBANK의 ribosomal DNA sequence와 비교하였다[26].
- 최종적으로 선별된 Enterococcus faecails MG-379 균주의 CPP 생산 최적 조건을 설정하기 위해 배양 시간 및 온도, 배양 배지의 초기 pH, 탄소원 및 질소원 종류에 따른 균주의 생육도와 그에 따른 CPP 생산 능력을 알아보았다.
- 또한 탄소원 및 질소원 종류에 따른 CPP 생산 최적 조건을 확인하였다. 탄소원으로는 maltose, lactose, sucrose, fructose, xylose, galactose를 각각 2% 첨가하였으며, 질소원으로는 proteose peptone, beef extract, yeast extract를 각각 2% 첨가하였다.
데이터처리
- 증폭된 DNA 염기서열은 DNA Analyzer(ABI PRISM 3730, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 분석하였다. 분석한 염기서열은 BLAST 프로그램을 통해서 GENEBANK의 ribosomal DNA sequence와 비교하였다[26].
이론/모형
- 동결건조 된 CPP의 칼슘 유리화 능력 확인을 위해 식품공전[17]에 준하는 과망간산칼륨(potassium permanganate, KMnO4) 적정법을 통해 칼슘 함량을 측정하였다. 증류수 25 ml에 동결건조된 CPP를 녹인 후 10 mM calcium chloride solution 25 ml와 20 mM sodium-phosphate buffer(pH 7.
성능/효과
- 0301은 0.6−0.8 μm 크기의 gram 양성 구균이며, 16s rDNA 염기서열 분석 결과 Enterococcus faecalis MG-379로 동정 명명하였다.
- 3). API kit를 통해 당 이용성을 분석한 결과, CHL 50 kit에서는 glycerol, ribose, galactose, glucose, mannose 등의 당을 이용하는 것으로 확인되었다. 또한 20 strep kit 로 분석한 결과, sodium pyrubate, esculin ferric citrate, pyroglutamic acid β-naphtlylamide 등에 양성 반응을 나타냄으로써 Enterococcus sp.
- CPP 생산 활성 테스트를 통해 0301 균주가 다른 균주들과 비교하여 CPP의 생산 능력이 뛰어난 것을 확인할 수 있 었다. 따라서 0301 균주를 최종적으로 선별하여 형태학적 및 생화학적 특성을 분석하였다.
- 분리된 균주들을 2% skim milk가 첨가된 MRS 배지에서 배양한 결과 250주의 colony 주변에서 clear zone을 나타내었다. Clear zone을 형성한 균주들을 각각 배양하여 그 상등액의 protease 활성을 측정한 결과, 활성이 상대적으로 높은 9 균주를 선별할 수 있었다.
- 8 μm 크기의 gram 양성 구균이며, 16s rDNA 염기서열 분석 결과 Enterococcus faecalis MG-379로 동정 명명하였다. E. faecalis MG-379 균주를 2% fructose를 첨가하고 pH 6.0인 배지에서 37℃에서 36시간 배양하였을 때 CPP 생산 능력이 최대였으며, ICP를 이용하여 측정한 결과 2227.5 mg/kg으로, 비교 균주인 Enterococcus faecalis KCCM 40450에 비해 약 2배 가량 높은 CPP 생산 능력을 갖는 것으로 나타내었다.
- Protease 활성은 Lactobacillus casei KCCM 12452 균주와 CPP를 생산한다고 밝혀진 Enterococcus faecalis KCCM 40450 균주를 대조군으로 하여 비교하였다. 과망간산칼륨을 통한 적정법을 이용하여 유리 칼슘 함량을 측정한 결과, Fig. 1에서 보이는 것처럼 다른 균주들과 비교하였을 때 0301 균주가 유리 칼슘 함량이 약 2배 가량 높은 것으로 확인되었다. 또한 ICP를 이용해서 칼슘 함량을 비교한 결과, 대조군인 KCCM 40450 균주의 경우 칼슘 함량이 1151.
- 균체의 생육은 배양한 지 24시간이 지났을 때 최대 생육을 띄었으며, 배양 온도에 따른 생육 정도를 확인한 결과 25−40oC 사이에서는 차이가 나타나지 않았으나 40℃ 이상의 온도에서는 생육이 급격히 감소하기 시작하였다.
- 따라서 0301 균주를 최종적으로 선별하여 형태학적 및 생화학적 특성을 분석하였다. 그 결과, 0301 균주는 Gram 양성 세균이며, KOH와 catalase test에서 각각 음성을 나타내었다. 주사전자현미경(SEM)을 이용해 세포를 관찰한 결과, 구균의 형태를 나타내며 크기는 0.
- 4). 따라서 분석 결과를 토대로 0301 균주를 Enterococcus faecails MG-379로 동정 명명하였다.
- 1에서 보이는 것처럼 다른 균주들과 비교하였을 때 0301 균주가 유리 칼슘 함량이 약 2배 가량 높은 것으로 확인되었다. 또한 ICP를 이용해서 칼슘 함량을 비교한 결과, 대조군인 KCCM 40450 균주의 경우 칼슘 함량이 1151.6 mg/kg 인 것에 비해 0301 균주의 경우는 2227.5 mg/kg으로 측정된 것을 Fig. 2를 통해 확인할 수 있다.
- 0에서 배양 조건을 확인하였다. 또한 탄소원 및 질소원 종류에 따른 CPP 생산 최적 조건을 확인하였다. 탄소원으로는 maltose, lactose, sucrose, fructose, xylose, galactose를 각각 2% 첨가하였으며, 질소원으로는 proteose peptone, beef extract, yeast extract를 각각 2% 첨가하였다.
- 배양 배지의 초기 pH에 따른 영향을 확인한 결과, pH 5.0−9.0까지 pH가 높아짐에 따라 균체의 생육이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, CPP의 생산은 pH 6.0에서 가장 높은 것으로 나타내었다.
- 로 동정되었다. 보다 정확한 동정을 위해 16S rDNA sequence로 분석한 결과, Enterococcus faecails이 가장 유사성이 높은 것으로 확인되었다(Fig. 4). 따라서 분석 결과를 토대로 0301 균주를 Enterococcus faecails MG-379로 동정 명명하였다.
- 여러 배양조건을 달리하여 CPP 생산의 최적 조건을 확인하였다. 시간은 0−60시간, 온도는 25−50℃, 초기 pH는 3.
- 이상의 결과로부터 Enterococcus faecails MG-379를 탄소원으로 2% fructose를 첨가한 배양 배지의 pH를 6.0으로 하여 37℃에서 36시간 동안 균주를 배양하였을 때 CPP 생산에 최적인 조건이 되는 것으로 확립하였다.
- 주사전자현미경(SEM)을 이용해 세포를 관찰한 결과, 구균의 형태를 나타내며 크기는 0.6−0.8 μm로 측정되었다(Fig. 3).
- 5). 질소원에 따른 영향을 확인한 결과 beef extract 를 첨가하였을 때 가장 높은 생육과 CPP 생산 능력을 나타내었다(Fig. 6).
- 0에서 가장 높은 것으로 나타내었다. 탄소원으로 maltose를 첨가하였을때 생육이 가장 높은 것으로 보였으며 lacose나 xylose를 첨가하였을 때는 생육이 낮은 것으로 확인되었다. CPP 생산능력은 탄소원으로 fructose를 이용하였을 대 최대를 나타내었다(Fig.
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