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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 하등 척추동물의 연구를 위한 실험어종으로 널리 사용되어지는 나일 틸라피아(Nile tilapia, Oreochromis niloticus)를 이용하여 절식에 따른 시상하부 Kiss2와 GnRH I 유전자 발현 변화 그리고 혈중 성 스테로이드 호르몬의 변화를 함께 조사하였다.
제안 방법
- 암컷과 수컷을 각각 두 그룹으로 나누어 한 그룹은 먹이 공급 후 10일 동안 절식시켰다. 10일 동안 절식한 암컷 (6마리)과 수컷(5마리)에서 뇌하수체를 포함한 뇌 조직을적출하였다. 다른 한 그룹은 1일 2회 상업용 배합사료를 만복으로 10일 동안 공급하고, 먹이 공급 10일째 암컷과 수컷 각각 6마리씩 뇌하수체를 포함한 뇌 조직을 적출하여 절식한 개체와 비교하였다.
- E2는 어류 E2 ELISA kit(CUSABIO, China)를 사용하여 경쟁적 ELISA법(competitive inhibition technique)으로 측정 하였고, 11-KT는 어류 11-KT ELISA kit(MyBioSource, USA)를 사용하여 이중항체 샌드위치 ELISA법(double antibody sandwich technique)으로 측정하였다. E2와 11- KT 실험은 각 제조회사에서 제공한 실험방법에 따라 진행하였으며, E2와 11-KT 모두 EMax Endpoint ELISA Microplate Reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 파장 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이렇게 측정된 흡광도 값과 SOFTmax Pro 4.
- qRT-PCR 반응은 ToprealTM qPCR 2X PreMIX SYBR Green(Enzynomics, Korea)을 이용하여 분석하였다. 반응 액은 5 µL의 cDNA(1:50 dilution)를 주형으로 사용하고, 7.
- W(Nuclease-free water)를 혼합하여 총 15 µL의 volume으로 실시하였다. qRT-PCR의 수행은 CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA)을 이용하여 95oC에서 15분간 initial denaturation하였으며, 95oC에서 15초 denaturation, 60oC에서 15초 annealing, 72oC에서 30초 elongation하여 45 cycles을 반응시켜 주었다. 반응이 끝난 후에는 melting curve를 분석하였다.
- 뇌 조직에서 GnRH I과 Kiss2 유전자 발현량을 알아보기 위해 quantitative real-time PCR(qRT-PCR)을 실시하였다. 실험에 사용된 Kiss2, GnRH I, GAPDH (Glyceraldehyde3-Phosphate Dehydrogenase) 유전자 primer는 Beacon Designer software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용해 제작하였다(Table 1).
- 10일 동안 절식한 암컷 (6마리)과 수컷(5마리)에서 뇌하수체를 포함한 뇌 조직을적출하였다. 다른 한 그룹은 1일 2회 상업용 배합사료를 만복으로 10일 동안 공급하고, 먹이 공급 10일째 암컷과 수컷 각각 6마리씩 뇌하수체를 포함한 뇌 조직을 적출하여 절식한 개체와 비교하였다.
- 또한 암컷의 혈장 내 estradiol-17β(E2)와 수컷의 혈장 내 11-ketotestosterone(11- KT)를 조사하기 위해 뇌 조직 적출 전에 heparin sodium 처리 주사기(1 mL)를 사용하여 미부혈관에서 혈액을 채 취하였다.
- 반응 액은 5 µL의 cDNA(1:50 dilution)를 주형으로 사용하고, 7.5 µL ToprealTM qPCR 2X PreMIX SYBR Green, 250 nM primer sets 그리고 N.F.W(Nuclease-free water)를 혼합하여 총 15 µL의 volume으로 실시하였다.
- qRT-PCR의 수행은 CFX96 TouchTM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA)을 이용하여 95oC에서 15분간 initial denaturation하였으며, 95oC에서 15초 denaturation, 60oC에서 15초 annealing, 72oC에서 30초 elongation하여 45 cycles을 반응시켜 주었다. 반응이 끝난 후에는 melting curve를 분석하였다.
- 암컷과 수컷을 각각 두 그룹으로 나누어 한 그룹은 먹이 공급 후 10일 동안 절식시켰다. 10일 동안 절식한 암컷 (6마리)과 수컷(5마리)에서 뇌하수체를 포함한 뇌 조직을적출하였다.
- E2와 11- KT 실험은 각 제조회사에서 제공한 실험방법에 따라 진행하였으며, E2와 11-KT 모두 EMax Endpoint ELISA Microplate Reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 파장 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이렇게 측정된 흡광도 값과 SOFTmax Pro 4.0 software(Molecular Devices)에서 만들어진 logistic(log-log) curve-fit standard curve를 사용하여 E2와 11-KT의 농도를 계산하였다.
- 절식에 따른 성어 암컷(6마리) 혈장 내 E2와 수컷(5−6마리) 혈장 내 11-KT 변화를 조사하기 위해 EnzymeLinked Immunosorbent Assay(ELISA)를 수행하였다.
- 채취한 혈액은 혈장을 얻기 위해 원심분리(4oC에서 1000 × g로 30분간) 하였다.
대상 데이터
- 실험어는 수온 27 ± 1oC, 광주기 14L:10D 조건의 순환여과시스템에서 사육된 나일 틸라피아 성어(암: 전장 14.1 ± 0.9 cm, 체중 56.7 ± 7.4 g, 수: 전장 14.4 ± 1.4 cm, 체중 55.4 ± 7.6 g)를 사용하였다.
- 뇌 조직에서 GnRH I과 Kiss2 유전자 발현량을 알아보기 위해 quantitative real-time PCR(qRT-PCR)을 실시하였다. 실험에 사용된 Kiss2, GnRH I, GAPDH (Glyceraldehyde3-Phosphate Dehydrogenase) 유전자 primer는 Beacon Designer software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용해 제작하였다(Table 1).
- 암·수 나일 틸라피아 모두 성적 성숙이 이루어진 개체들(암컷=20, 수컷= 20)을 사용하였다.
데이터처리
- 각 실험결과로부터 얻어진 자료 값(mean ± S.E.M.) 사이의 유의차 유무는 SPSS-통계패키지(version 18.0)을 이용하여 절식그룹과 먹이 섭취 그룹 간에 independent ttest(p < 0.05)로 검정하였다.
이론/모형
- 와 수컷(5−6마리) 혈장 내 11-KT 변화를 조사하기 위해 EnzymeLinked Immunosorbent Assay(ELISA)를 수행하였다. E2는 어류 E2 ELISA kit(CUSABIO, China)를 사용하여 경쟁적 ELISA법(competitive inhibition technique)으로 측정 하였고, 11-KT는 어류 11-KT ELISA kit(MyBioSource, USA)를 사용하여 이중항체 샌드위치 ELISA법(double antibody sandwich technique)으로 측정하였다. E2와 11- KT 실험은 각 제조회사에서 제공한 실험방법에 따라 진행하였으며, E2와 11-KT 모두 EMax Endpoint ELISA Microplate Reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 파장 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- GAPDH를 대조유전자로 사용하였으며, 2-ΔΔCt 방법 (Livak and Schmittgen 2001)을 이용하여 상대 정량하였다.
- Effects of fasting on the expression levels of GnRH I and Kiss2 mRNA in the brain of male Nile tilapia. Relative abundance of the mRNAs was normalized to the amount of GAPDH by the comparative threshold cycle method using qRT-PCR. Results are means ± S.
- Effects of fasting on the expression levels of GnRH I and Kiss2 mRNA in the brain of male Nile tilapia. Relative abundance of the mRNAs was normalized to the amount of GAPDH by the comparative threshold cycle method using qRT-PCR. Results are means ± S.
성능/효과
- 2). 두 유전자 모두 앞선 수컷과는 반대로 먹이를 섭취한 그룹보다 절식한 그룹에서 약간 높은 발현양상을 나타내었지만 두 그룹 간의 유의한 차이는 없었다. 또한 암컷의 혈장 내 E2의 농도도 절식한 그룹에서 136.
- 또한 수컷의 혈중 11-KT도 절식한 그룹(5.6 ±0.6 pg/mL)이 먹이를 섭취한 그룹(9.8 ± 1.1 pg/mL)에 비해 농도가 유의하게 낮았다(Fig. 3).
- 또한 암컷의 혈장 내 E2의 농도도 절식한 그룹에서 136.9 ± 23.27 pg/mL, 먹이를 섭취한 그룹에서는 142 ± 13.1 pg/mL로 비슷한 수준을 나타내 면서 10일 동안의 절식에 영향을 받지 않았음을 확인하였다(Fig. 4).
- 본 연구 결과에서는 절식이 일부 나일 틸라피아의 번식 관련 인자들에게 영향을 줄 수 있음을 나타내었다. 수컷의 경우 GnRH 및 Kiss2 유전자 모두 절식한 그룹이 먹이를 섭취한 그룹에 비해 유의하게 낮은 발현량을 나타내 었으며, 두 그룹 간 발현량의 차이는 약 5배 정도였다 (Fig.
- 앞선 결과들을 종합해 볼 때 비록 암컷에서는 절식에 의한 영향을 확인하지 못하였지만, 수컷의 경우 절식이 kisspeptin을 포함한 번식관련 인자들에게 영향을 줄 수 있음을 확인하였다. 또한 절식에 의해 동반 감소된 수컷의 kisspeptin과 GnRH 유전자 발현양상으로 미루어 볼 때, kisspeptin이 나일 틸라피아 수컷의 먹이 섭취와 GnRH를 매개할 가능성이 있다.
- 그 다음 4oC에서 12,000 × g로 8분간 원심분리하여 RNA pellet을 얻어내고 상층액을 제거 후 wash과정을 거쳐 total RNA를 얻었다. 추출한 total RNA는 RQ1 RNase-free DNase(Promega, USA)로 처리하여 genomic DNA에 의한 오염가능성을 최소화하였다. 이 total RNA (1 µg)와 M-MLV(Moloney Murine Leukemia Virus) reverse transcriptase(Promega, USA), oligo (dT)15 primer(Promega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
후속연구
- 그러나 두 유전자는 ghrelin, leptin, insulin 등 먹이 섭취와 관련한 인자들에게 각각 영향을 받을 가능성이 존재한다. 따라서 절식 → 시상하부(kisspeptin →GnRH)→생식소(sex steroid)로 이어지는 연결 과정을 보다 명확히 밝히기 위해서는 먹이 섭취와 관련한 인자들과의 관련성을 조사하는 추가적인 연구가 요구된다.
- 그러나 지금까지 연구결과들은 절식이 번식활성에 미치는 영향이나 또는 절식이 kisspeptin 유전자 발현에 미치는 영향들을 따로 따로 연구한 것들이어서, 절식→ kisspeptin → GnRH → sex steroid로 이어지는 연결 과정을 한 번에 설명하지 못하였다. 또한 어류의 경우에는 번식 활동에 주요한 역할을 하는 kisspeptin과 먹이 활동의 연관성은 명확히 밝혀지지 않아 연구의 필요성이 제기된다.
- 2012). 이는 암컷 나일 틸라피아도 절식이 번식관련 인자들에 영향을 줄 수 있음을 간접적으로 나타내는 결과이며, 절식기간을 늘리는 등의 추가적인 실험을 통해 조사해 볼 필요가 있다.
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