[논문]극지해양 Pseudoalteromonas 유래의 소형 플라스미드에 기반한 Pseudoalteromonas - Escherichia coli 셔틀벡터 제작

김덕규; 박하주; 박현

doi:10.7845/kjm.2016.5054

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남극 해양세균 Pseudoalteromonas sp. PAMC 21150에서 분리한 소형 플라스미드(small plasmid, pDK4)의 크기는 3,480bp이고 G+C 함량은 41.64%이며, 3개의 open reading frames(ORFs)을 포함하고 있다. 3개의 ORF는 replication initiation protein (RepA), conjugative mobilization protein (Mob), 그리고 기능이 밝혀지지 않은 단백질을 코팅하고 있다. PCR 반응으로 증폭한 pDK4를 Escherichia coli high-copy pUC19 클로닝 벡터에 삽입하여 fusion vector (pDOC153)를 제작하였고, pDOC 153에 chloramphenicol 저항성 유전자를 삽입하여 ampicillin/chloramphenicol 저항성 Pseudoalteromonas - Escherichia coli 셔틀 벡터(shuttle vector; 7,216 bp 크기; pDOC155)를 제작하였다. 북극 해양세균 P. issachenkonii PAMC 22718이 보유한 2개의 유전자(TonB-dependent receptor gene, chi22718_IV, and exochitinase gene, chi22718_III)를 pDOC155에 삽입하여 두 개의 pDOC155 변형체(pDOC158, pDOC165)를 제작하였다. pDOC158 혹은 pDOC165을 이용하여 triparental mating 방법에 의해 플리스미드 미보유 해양세균인 Pseudoalteromonas sp. PAMC 22137를 형질전환하였다. PCR을 이용한 유전자 증폭실험을 통해서, pDOC158와 pDOC165에 삽입된 유전자들은 Pseudoalteromonas sp. PAMC 22137와 E. coli $DH5{\alpha}$ 내에서 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다. 위의 결과는 셔틀 벡터 pDOC155는 Pseudoalteromonas spp. 유래 유전자들을 다른 Pseudoalteromonas spp. 세포 안으로 전달할 수 있는 새로운 유전자 전달시스템으로 이용될 수 있음을 보여주었다.

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A small plasmid (pDK4) from the Antarctic marine organism Pseudoalteromonas sp. PAMC 21150, was purified, sequenced and analyzed. pDK4 was determined to be 3,480 bp in length with a G+C content of 41.64% and contains three open reading frames encoding a replication initiation protein (RepA), a conju...

A small plasmid (pDK4) from the Antarctic marine organism Pseudoalteromonas sp. PAMC 21150, was purified, sequenced and analyzed. pDK4 was determined to be 3,480 bp in length with a G+C content of 41.64% and contains three open reading frames encoding a replication initiation protein (RepA), a conjugative mobilization protein (Mob) and a hypothetical protein. PCR-amplified pDK4 was cloned in high-copy pUC19 to yield the fusion vector pDOC153. The chloramphenicol resistance gene was inserted into pDOC153 to give an ampicillin and chloramphenicol-resistant, Pseudoalteromonas - Escherichia coli shuttle vector (7,216 bp; pDOC155). The TonB-dependent receptor (chi22718_IV ) and exochitinase (chi22718_III ) genes from Arctic marine P. issachenkonii PAMC 22718 were cloned into pDOC155 to produce pDOC158 and pDOC165, respectively. Both vector derivatives were transferred into plasmid-free Pseudoalteromonas sp. PAMC 22137 by the triparental mating method. PCR experiments showed that the genes were stably maintained both in Pseudoalteromonas sp. PAMC 22137 and E. coli $DH5{\alpha}$ cells, indicating the potential use of pDOC155 as a new gene transfer system into marine Pseudoalteromonas spp.

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b Detection of a small plasmid: +, detected; -, not detected.

제안 방법

PCR 반응으로 증폭한 pDK4를 Escherichia coli high-copy pUC19 클로닝 벡터에 삽입하여 fusion vector (pDOC153)를 제작하였고, pDOC 153에 chloramphenicol 저항성 유전자를 삽입하여 ampicillin/chloramphenicol 저항성 Pseudoalteromonas – Escherichia coli 셔틀 벡터(shuttle vector; 7,216 bp 크기; pDOC155)를 제작하였다.

대상 데이터

남극 해양세균 Pseudoalteromonas sp. PAMC 21150에서 분리한 소형 플라스미드(small plasmid, pDK4)의 크기는 3,480bp이고 G+C 함량은 41.64%이며, 3개의 open reading frames(ORFs)을 포함하고 있다. 3개의 ORF는 replication initiation protein (RepA), conjugative mobilization protein (Mob), 그리고 기능이 밝혀지지 않은 단백질을 코팅하고 있다.
Agarose gel electrophoresis of PCR amplicons from Pseudoalteromonas sp. PAMC 22137 transformants. Lanes: M, DNA ladder; 1, 3 and 5, transformant tf01 (shuttle vector pDOC155); 2, transformant tf24 (pDOC159, pDOC155 derivative containing catA); 4, transformant tf26 (pDOC158, pDOC155 derivative containing chi22718_IV); 6, transformant tf31 (pDOC165, pDOC155 derivative containing chi22718_III).
pDOC158 혹은 pDOC165을 이용하여 triparental mating 방법에 의해 플리스미드 미보유 해양세균인 Pseudoalteromonas sp. PAMC 22137를 형질전환하였다. PCR을 이용한 유전자 증폭실험을 통해서, pDOC158와 pDOC165에 삽입된 유전자들은 Pseudoalteromonas sp.
PCR 반응으로 증폭한 pDK4를 Escherichia coli high-copy pUC19 클로닝 벡터에 삽입하여 fusion vector (pDOC153)를 제작하였고, pDOC 153에 chloramphenicol 저항성 유전자를 삽입하여 ampicillin/chloramphenicol 저항성 Pseudoalteromonas – Escherichia coli 셔틀 벡터(shuttle vector; 7,216 bp 크기; pDOC155)를 제작하였다. 북극 해양세균 P. issachenkonii PAMC 22718이 보유한 2개의 유전자(TonB-dependent receptor gene, chi22718_IV, and exochitinase gene, chi22718_III)를 pDOC155에 삽입하여 두 개의 pDOC155 변형체(pDOC158, pDOC165)를 제작하였다. pDOC158 혹은 pDOC165을 이용하여 triparental mating 방법에 의해 플리스미드 미보유 해양세균인 Pseudoalteromonas sp.

이론/모형

The insert DNA fragments from ~100 white colonies were sequenced on both strands (Cosmo Genetech). The nucleotide sequences were assembled with the SeqMan program, which is part of the Lasergene software suite (DNASTAR). Sequence gaps between contigs were filled by primer walking.

성능/효과

PCR을 이용한 유전자 증폭실험을 통해서, pDOC158와 pDOC165에 삽입된 유전자들은 Pseudoalteromonas sp. PAMC 22137와 E. coli DH5α 내에서 안정적으로 유지되는 것을 확인하였다. 위의 결과는 셔틀 벡터 pDOC155는 Pseudoalteromonas spp.
유래 유전자들을 다른 Pseudoalteromonas spp. 세포 안으로 전달할 수 있는 새로운 유전자 전달시스템으로 이용될 수 있음을 보여주었다.

참고문헌 (10)

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Feller, G., d'Amico, D., and Gerday, C. 1999. Thermodynamic stability of a cold-active alpha-amylase from the Antarctic bacterium Alteromonas haloplanctis. Biochemistry 38, 4613-4619.

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Zhao, D.L., Yu, Z.C., Li, P.Y., Wu, Z.Y., Chen, X.L., Shi, M., Yu, Y., Chen, B., Zhou, B.C., and Zhang, Y.Z. 2011. Characterization of a cryptic plasmid pSM429 and its application for heterologous expression in psychrophilic Pseudoalteromonas. Microb. Cell Fact. 10, 30.

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