선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 그러므로 본 연구에서는 천연기념물 제 265호 연산오계의 다리육을 이용하여 효소 가수분해를 통해 펩타이드를 분리하고자 하였으며, 펩타이드 제조 시 최적반응조건(pH, 온도, 분해시간)을 확립하고 여러 원료로 사용할 수 있도록 특성을 규명하고자 하였으며, 품질특성(일반성분, 기능성 및 아미노산 분석을 통한 분해율 및 수율, 분자량 확인 등) 및 품질지표를 선정하고자 분석실험을 하였다.
- 연산오계는 오래전부터 건강기능 증진 및 치료 효능이 높은 것으로 알려져 왔다. 최근 건강 기능식품 소재로 기능성 펩타이드 효능이 알려짐에 따라, 오계 다리육을 사용하여 올리고 펩타이드 최적 생산 공정 및 생성물 특성에 대하여 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 1. 오계 다리육의 펩타이드를 분리하기 위하여 효소가수분해 최적 공정을 개발하기 위하여 온도 (40, 50, 60℃), pH (pH 6.0, 7.0, 8.0), 효소 (1, 2, 3%) 별로 가수분해율을 분석하였다.
- BM1200 효소를 이용하여 오계 다리육으로부 효소 가수분해하여 최적 조건요인들인 온도, pH, 효소의 양의 3개의 실험변수에 대하여 Box- Benken 디자인으로 실험을 설계하여 얻어진 실험결과 즉 가수분해도를 Table 3에 나타내었다.
- 깨끗한 plate위에 1 ml 정도 떨어뜨려 열풍건조 시켰다. 건조 후에 노란색을 띄는 샘플을 취해 질량분석기로(MALDI-TOF, Voyager DE-STR, Applide biosystems, USA) 레이저를 사용하여 분석하였다 (Laser : Nitrogen, 337 nm, 3ns pulse).
- 냉동상태로 공급된 오계육은 다리육을 분리하기 위하여 냉동된 오계를 40°C 항온수조에서 20분 동안 해동을 하였다.
- 방치가 끝난 시료는 0.2 μm membrane filter로 여과하고 이중 1 ml 을 lithium citrate buffer(0.12 N, pH 2.2)와 혼합하여 적절한 농도로 희석한 후 그중 1 ml을 취하여 Table 2과 같이 아미노산 자동분석기 automated amino acid analyzer(Sykam GmbH, Germany)를 이용하여 정량분석 하였다.
- Box-Benken design은 세 가지의 중요한 절차에 따라 진행이 되는데, 첫째는 계획된 실험 (designed experiment)에 따라 통계적으로 실험을 수행하고, 둘째는 수식 모델의 계수 (coefficients of model)를 구하고, 셋째는 모델의 적합성을 판정하는 것으로 진행이 된다. 본 실험에서의 반응 변수들은 TCA 용해 펩타이드 양과 단백질 가수분해율(DH, degree of hydrolysis)로 하였다.
- 본 연구에서 오계 다리육 단백질 가수분해물의 여러 종류의 펩타이드 분자량 분포에 대한 분석을 시행하였는데 MALDI-TOF의 그래프에서 x 축은 mass(m/z)를 나타내고 Y축은 이온화된 물질의 강도를 나타낸다. 불순물이 어느 정도 포함이 되어있지만 대부분의 펩타이드들은 m/z 500 에서 1,400 이하 분자량 분포를 보여 주었다.
- 해동이 된 오계육은 칼과 가위를 이용하여 다리뼈와 육을 분리하였다. 분리된 다리육은 고기갈개(Kenwood, Seoul, Korea)를 이용하여 갈개 재료쟁반에 넣고 분쇄 칼날로 육을 잘게 자른 다음 스크린을 통하여 둥글고 가는 형태로 균질된 다리육을 제조하였다. 균질화된 다리육은 지퍼백에 넣고 샘플이름, 제조날짜를 기입을 한 후에 실험 전까지 -20°C에 냉동보관을 하였다.
- 통계적인 계산을 원활히 하기 위하여 독립 변수를 다음과 같이 표준화 (code)하여 사용을 하였다. 세 개의 변수들을 각각 X1 (온도), X2 (pH), X3 (효소농도)로 하였다. 표준화의 값들은 다음과 같은 공식에 의하여 구할 수 있고 그 값을 Z로 하였다.
- 오계 다리육 펩타이드 분자량 측정을 위해 alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid 사용하였고, 70% ACN 과 0.1% formic acid 로 하여 10 m / ml의 matrix 시료를 만들었다. Sample을 50-100 ppm 정도 준비하였다.
- 오계 다리육을 단백질 가수분해 효소를 이용하여 분해한 생성물들의 분자량 분포 특성을 분석하고자 MALDI-TOF를 사용하였다. MALDITOF는, PMF(Peptide Mass Fingerprint) 분석법으로 특정 enzyme을 처리하여 잘라진 peptide fragment들의 mass 값을 측정하고 이를 사용하여 database search를 하여 동정한다.
- 오계 다리육의 단백질 가수분해 생산 최적 조건을 구하기 위하여 모든 실험 계획은 3개의 독립변수 즉, 효소반응온도, 반응 pH, 효소의 농도 (%)를 각각 50℃, pH 6.0, 2%로 하는 center run을 5번 반복을 포함하여 총 17개의 처리조합으로 구성을 하였다[15]. Box-Benken design은 세 가지의 중요한 절차에 따라 진행이 되는데, 첫째는 계획된 실험 (designed experiment)에 따라 통계적으로 실험을 수행하고, 둘째는 수식 모델의 계수 (coefficients of model)를 구하고, 셋째는 모델의 적합성을 판정하는 것으로 진행이 된다.
- 여과된 용액을 578 nm 흡광도를 측정한다. 프로테아제가 수분해 양은 L-Tyrosine 표준곡선을 이용하여 측정하였고 표준곡선을을 사용하여 Y=0.0078X + 0.0182 절편의 값을 구하여 계산하였고, 가수분 해도는 다음 식을 이용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 Folin ciocalteu`s phenol(FCP)과 tri-chloro-acetic(TCA)산 시약은 Sigma Company(Seoul, Korea)사로부터 구입하여 사용하였다. 단백질 분해효소 bromelain 1200 GDU(BM1200)은 대종상사(Seoul, Korea)로부터 구입을 하였다. BM1200 효소는 pineapple로부터 얻어진 식물성프로테아제이다.
- 본 실험에 사용된 Folin ciocalteu`s phenol(FCP)과 tri-chloro-acetic(TCA)산 시약은 Sigma Company(Seoul, Korea)사로부터 구입하여 사용하였다. 단백질 분해효소 bromelain 1200 GDU(BM1200)은 대종상사(Seoul, Korea)로부터 구입을 하였다.
- 효소의 역가를 측정하기 위한 단백질은 카제인으로 대정화금(Daejon, Korea)에서 구입을 하였다. 실험에 사용된 오계육은 (주)지산농원(Nonsan, Chungnam, Korea)에서 제공을 하였다.
- 효소의 역가를 측정하기 위한 단백질은 카제인으로 대정화금(Daejon, Korea)에서 구입을 하였다. 실험에 사용된 오계육은 (주)지산농원(Nonsan, Chungnam, Korea)에서 제공을 하였다.
데이터처리
- 실험 후에 확정된 결과들의 통계분석은 Design Expert (Couresy: Stat-ease Inc., Statistics Made Easy, Minneapolis, USA)를 사용하였다. 독립변수들의 값의 선택은 예비 실험에 서 얻은 결과로부터 선택을 하여 X1 (온도)는 4 0℃ (-1), 50℃ (0), 60℃ (+1) 로 정하고, X2 (pH)는 5.
이론/모형
- ∆X는 1 단위만큼의 증가 또는 감소하는 값의 크기이다. 실험결과에 대한 분석은 표면 반응 분석법으로 사용을 하였으며 최적 공정 조건을 나타내는 다중 회귀식은 다음과 같다.
성능/효과
- 2. 가수분해도는 온도, pH 그리고 효소의 양에 영향을 받는다는 것이 95% 수준 이내에서 인정되었으며, 오계 다리육의 효소가수분해에 따른 펩타이드 함량은 효소의 값이 3%로 높아질수록 온도의 경우 58℃로 높아질수록 가수분해도는 높아졌다. 하지만 pH 변화에 따른 펩타이드의 생산량은 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
- 3. 유리아미노산은 총 28종류의 유리아미노산이 분석되었으며, Leucine 이 12.5% (21.014 mg/100 g)로 가장 높게 나타났다. Lysine (11.
- 4. 오계 다리육 가수분해물 펩타이드들은 아미노산 염기 4에서 12개 정도의 분포를 보여 주었다. 그리고 대부분의 펩타이드들이 염기서열 10개 이하로 이루어져 있었다.
- 가수분해도는 펩타이드 생산효율을 평가하는데 지표가 된다. pH 6-8 사이에서 크게 변화가 없었던 반면 온도의 경우 40℃에서 서서히 증가하다가 약 58℃ 근처에서 최고생산량 72.52%까지 펩타이드 생산량이 높아지는 것으로 확인되었다. 즉 펩타이드 생산에 있어 pH보다 온도에 더 큰 영향을 주는 것으로 나타났다(Fig.
- 따라서 연구 결과 연산오계 다리육을 이용하여 기능성 소재의 생산체계 확보를 위한 제조 공정을 표준화, 추출물 및 분말 등 대량 생산 공정을 매뉴얼, 소비자 맞춤형 가공식품 생산 체계 및 실용화에 필요한 기초자료를 확보할 수 있었다.
- 반응표면 분석 실험의 결과를 종합해 보면 오 계 다리육의 효소가수분해에 따른 펩타이드 생산량에 가장 영향을 미치는 것은 온도이고, 효소의 양과 pH 순으로 나타났으며, pH의 영향은 아주 미미한 것으로 판단되었다(Fig. 4).
- 05). 본 실험결과 반응온도, pH, 효소의 농도에 대한 영향은 1차, 2차, 교호항(cross product term)에서 유의성이 나타나 요인들의 단독 또는 교호적으로 영향을 미침을 알 수 있다. 이들에 대한 회귀식은 Table 6 에 있다.
- 이들의 결과에 따르면 가수분해도, 총 수율. 생산속도들은 온도, pH, 효소의 양에 영향을 받는다는 것이 95% 수준 이내에서 유의성이 인정되었다.
- 가수분해 효율성을 나타내는 중요한 요인들인가 수분해도를 보여준다. 실험 결과 가수분해도의 값은 15.07-94.38 범위에서 측정값이 얻어졌으며, 수율은 16.439-102.915 %, 생산속도는 0.822-4.311 g/h-L의 범위에서 측정되었다. 실험결과를 이용한 회귀식에 대한 분산분석의 결과는 반응표면분석 법에 의해 수립된 모델의 적합성 여부를 알려준다.
- 오계 다리육을 분리하여 효소가수분해 처리한 가수분해물의 유리 아미노산 함량은 다음과 같다 (Table 7). 오계 다리육 효소가수분해물에서 26 종류의 유리아미노산이 검출되었으며, 총 양은 168.131 mg/100 g으로 확인되었다. 쓴맛에 관여하는 Leucine 이 12.
- 49%였으나 약 58℃로 높아질수록 펩타이드 생산량의 정상점이 나타났다. 이 결과 효소는 약 3%가 되었을 때 그리고 온도는 약 58℃로 반응을 주었을 때 정상점이 나타났으며, 이곳이 최대 펩타이드 양이 생산되는 것으로 보이며, 그 값은 약 78.82%로 나타났다.
- 96 이므로 이 모델은 10% 범위에서 설명되지 않는다는 것을 보여준다. 적합결여 (lack of fit) 테스트 검정에서는 유의성이 나타나지 않아 본 실험에 사용한 모델이 매우 적절함을 알 수 있다. Table 5 에서는 모델의 회귀계수를 나타내는 것으로 가수분해도, 가수분해 수율, 생산속도들이 3가지의 요인들에 대하여 크게 영향을 받는 것으로 나타났다.
- 52%까지 펩타이드 생산량이 높아지는 것으로 확인되었다. 즉 펩타이드 생산에 있어 pH보다 온도에 더 큰 영향을 주는 것으로 나타났다(Fig. 1).
- 그리고 대부분의 펩타이드들이 염기서열 10 개 이하로 이루어져 있었다. 평균 분자량으로 환산을 한다면 다수를 차지하는 펩타이드의 분자량 들은 아미노산 잔기가 5, 6, 8, 10개로 이루어져 있었다(Fig. 5).
- 그리고 대부분의 펩타이드들이 염기서열 10개 이하로 이루어져 있었다. 평균 분자량으로 환산을 한다면 다수를 차지하는 펩타이드의 분자량들은 아미노산 잔기가 5, 6, 8, 10개로 이루어져 있음을 확인하였다.
- 표면 반응의 분석결과 정상점(stationary point)이 최대적으로 판명되어 오계 부산물 중 오 계 다리육을 이용한 효소가수분해도 즉 펩타이드 생산량은 pH보다 온도에 더 큰 영향을 받는 것으로 나타났다. 가수분해도는 펩타이드 생산효율을 평가하는데 지표가 된다.
- 표면 반응의 분석결과 정상점(stationary point)이 최대점으로 판명되어 오계 다리육을 이용한 효소가수분해도는 Fig. 3 에서와 같이 효소의 양에 의해 생산되는 가수분해도의 변화보다는 온도의 변화에 상당히 민감하였다. 효소의 값이 높아질수록 펩타이드의 생산량은 미미하게 높아졌다.
- 2에서 보듯이 효소의 양에 따른 펩타이드 생산량 변화가 pH의 변화보다 민감한 것을 알 수 있다. 효소의 양 1.7% 부터 서서히 증가하여 3%로 올렸을 때 78.82%로 효소의 양을 점차 늘렸을 때 최고 생산량을 보여주었으나 이에 반해 pH의 경우 pH 7-7.5에서 약간의 증가함을 보였으나 pH의 변화에 따른 값이 크게 변화되지 않았음을 확인하였다. 그러므로 pH의 변화 보다는 효소의 양이 3%로 높아졌을 때 펩타이드의 생산량이 증가함을 알 수 있다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.