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문제 정의
- 이와 같이 다릅나무는 예로부터 약용으로 이용되어왔고, 과학적으로 다양한 생리활성(항산화, 항암, 부인병)등의 효과가 알려져 있는 것3)으로 사료되지만 관련 연구는 아직 부족한 실정이다. 따라서 본연구는 항산화 활성을 중심으로 다릅나무 수피를 음건 후 분쇄하여 hexane, chloroform, ethyl acetate 및 butyl alcohol 등의 용매를 이용하여 분획한 후 각 분획물에 대한 항산화 활성 확인하여 기초 자료로 활용하고자 하였다.
- 따라서 생체 부작용이 없고 활성 산소를 제거하여 질병예방 및 노화 억제에 효과가 있으며, 항산화력이 강한 천연 항산화제를 동 ․식물로부터 찾으려는 연구가 활발히 이루어지고 있다1, 19). 본 연구에서는 다릅나무 수피의 Methanol 농도별 조건을 탐색 한 후 hexane, CHCl3, EtOAc, BuOH, water로 분획하여 각 분획물 중에 어떤 분획물의 항산화 효능이 가장 뛰어난지를 검증하였다.
제안 방법
- 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free 라디칼 소거법 Blois11)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 50 μL에 0.
- 70% 메탄올 조추출물의 분획 제조 : 조 추출물에 증류수를 가하여 현탁 시킨 후 동일한 부피의 hexane, chloroform, ethyl acetate, butyl alcohol로 3회씩 반복하여 Fig. 1과 같이 순차적으로 분획하고 남은 수용액 층(Water)을 감압 농축하여 분획물을 얻었다(Fig. 1).
- ABTS 라디칼을 이용한 항산화력 측정은 Re 등12)의 방법을 변형하여 측정하였다.
- 다릅나무 수피 용매 분획물의 항산화활성을 평가하기 위해 유리 라디칼 소거능을 평가하는 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능을 측정하였고, 라디칼 소거능을 IC50 값으로 나타냈다. DPPH 라디칼 소거능을 평가한 결과 분획물 IC50값은 각각 hexane(447.
- 다릅나무 수피에서 가장 우수한 70% methanol 추출물을 이용하여 극성별 유기용매을 이용한 분획물을 얻어 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정하였다.
- 15 mM DPPH 용액 200 μL를 가한 후, 암소에서 30분간 반응시킨 후 Multimicroplate reader-SpectraMax M5(Molecular Devices, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도 값을 측정하였다. 대조구로는 BHA와 ascorbic acid를 사용하였고, 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 라디칼 소거능(IC50)으로 표시하였으며, 분획물의 소거활성은 다음 식으로 %를 구하였다.
- 15 mM DPPH 용액 200 μL를 가한 후, 암소에서 30분간 반응시킨 후 Multimicroplate reader-SpectraMax M5(Molecular Devices, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도 값을 측정하였다. 대조구로는 BHA와 ascorbic acid를 사용하였고, 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 라디칼 소거능(IC50)으로 표시하였으며, 분획물의 소거활성은 다음 식으로 %를 구하였다.
- 실온교반 추출하였다. 모든 추출은 충분한 시료확보를 위하여 각각 24시간씩 3회 추출하였다.
- 생리활성 검증을 위한 최적 추출 조건을 검색하기 위해 시료를 methanol을 사용하여 0%, 30%, 50%, 70%, 99% 의 농도별로 실온교반 추출하였다. 모든 추출은 충분한 시료확보를 위하여 각각 24시간씩 3회 추출하였다.
- 시료의 최적 추출조건 도출을 위해 다릅나무 수피를 Methanol의 농도를 0%, 30%, 50%, 70%, 99%로 구분하여 추출한 다음 총 폴리페놀 함량을 기초로 대표적으로 쓰이는 DPPH (1, 1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)을 기질로 이용하여 다릅나무 수피 추출조건을 검토하였다. 다릅나무 수피에 methanol 농도별 추출물의 폴리페놀 함량을 분석한 결과 0%는 14.
-
3. 추출물 및 분획 제조
조추출물 제조 : 건조된 다릅나무의 수피 467.2 g를 70% 메탄올로 24시간 3회 교반 추출하여 얻은 추출액을 감압 여과한 후 여과액을 감압 농축 하여 46.98 g의 조추출물을 얻었다.
- 즉, 시료 추출물 10 μL에 2% Na2CO3 용액 180 μL를 첨가한 후 3분간 방치시키고 1 N Folin-Ciocalteau reagent 10 μL를 첨가하여 37℃ 암실에서 30분간 방치하였으며 Multimicroplate reader-SpectraMax M5(Molecular Devices, USA)를 사용하여 750 nm에서 흡광도 값을 측정하였다. Gallic acid를 표준물질로 하여 표준 검량선을 작성하였으며 추출물의 총 폴리페놀 함량은 시료 100 g당 ㎎의 gallic acid로 나타냈다.
- . 총 폴리페놀 함량은 폴리페놀의 산화 환원반응을 응용한 것으로 페놀성 물질인 phospho molybdic acid와 반응하여 청색을 나타내는 원리를 이용하였다21). 다릅나무 수피 용매별 분획물의 폴리페놀 함량을 조사한 결과, 각 용매 분획물의 총 폴리페놀 함량은 CHCl3 > EtOAc > BuOH > Hexane > Water 순으로 CHCl3 분획물에서 가장 높게 나타내었다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 다릅나무(Maackia amurensis Rupr. et. Maxim)는 2014년 4월경에 경북 영천지역에서 채취한 것을 구입한 후 중부대학교 한방제약과학과에서 감정하였다. 이용하기 전에 불순물을 제거하고, 코르크층을 분리한 수피를 음건한 후 분쇄하여 4℃에서 냉장 보관한 후 추출용 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 분석결과는 측정치의 평균±표준편차로 표시하였고, 통계처리는 SAS package program(1996)의 General Linear Model(GLM) procedure에 따라 처리하였으며, 각 처리구간의 유의성 검증은 분산분석을 실시 후, Duncan's multiple range tests (Duncan, 1955)로 5% 수준(p<0.05)에서 실시하였다.
이론/모형
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 법9)을 응용하여 측정하였다. 즉, 시료 추출물 10 μL에 2% Na2CO3 용액 180 μL를 첨가한 후 3분간 방치시키고 1 N Folin-Ciocalteau reagent 10 μL를 첨가하여 37℃ 암실에서 30분간 방치하였으며 Multimicroplate reader-SpectraMax M5(Molecular Devices, USA)를 사용하여 750 nm에서 흡광도 값을 측정하였다.
- 총 플라보노이드 함량은 Dewanto 등10)의 방법을 이용하여 측정하였다. 추출액 25 μL를 증류수 100 μL에 희석한 다음 5% NaNO2 용액 7.
성능/효과
- 1. 다릅나무 수피의 70% methanol 추출물에서 폴리페놀 15.44 mg/g로 가장 높은 함량을 나타내었고, DPPH 라디칼 소거능은 194.15 ㎍/mL로 가장 낮은 IC50 값을 나타내었다.
- 2. 다릅나무 수피의 70% methanol 추출물로부터 hexane, CHCl3, EtOAc, BuOH, water로 분획하여 생리활성 검증을 실시한 결과, 총 폴리페놀 함량(201.98 mg/g) 및 총 플라보노이드 함량(13.55 mg/g)은 CHCl3 분획물에서 가장 높은 함량을 나타내었다.
- 3. 다릅나무 수피의 70% methanol 추출물로부터 DPPH와 ABTS 라디칼 소거능 활성결과 CHCl3 분획물에서 각각 183.95 ㎍/mL와 10.00 ㎍/mL로 가장 낮은 IC50 값을 나타내었다.
- 42 ㎍ /mL으로 분획물 중에는 CHCl3 분획물이 가장 낮은 농도에서 50%의 라디칼 소거능을 보였지만 ascorbic acid와 합성 항산화제인 BHA보다는 높은 농도에서 50%의 라디칼 소거능을 나타냈다. ABTS 라디칼 소거능을 평가한 결과 분획물들의 IC50값은 각각 hexane(55.51±4.39 ㎍/mL), CHCl3 (10.00±0.33 ㎍/mL), EtOAc(12.36±0.64 ㎍/mL), BuOH (69.36±0.52 ㎍/mL) 및 water(73.83 ±5.07 ㎍/mL)이며, 대조구인 ascorbic acid와 BHA는 각각 3.52±0.02 ㎍/mL, 3.33±0.20 ㎍/mL로 CHCl3 분획물이 가장 낮은 농도에서 50%의 라디칼 소거능을 보였지만 유의성 검증 결과 EtOAc 분획물과 유의차는 없었다. ABTS 및 DPPH 라디칼 소거 활성 결과에서 모두 CHCl3 분획물에서 항산화활성이 가장 우수한 것으로 나타냈다.
- 20 ㎍/mL로 CHCl3 분획물이 가장 낮은 농도에서 50%의 라디칼 소거능을 보였지만 유의성 검증 결과 EtOAc 분획물과 유의차는 없었다. ABTS 및 DPPH 라디칼 소거 활성 결과에서 모두 CHCl3 분획물에서 항산화활성이 가장 우수한 것으로 나타냈다.
- 나타냈다. DPPH 라디칼 소거능을 평가한 결과 분획물 IC50값은 각각 hexane(447.88±5.70 ㎍/mL), CHCl3(183.95±2.67 ㎍/mL), EtOAc(287.18±1.45 ㎍/mL), BuOH(2030.59±776.63 ㎍ /mL) 및 water(480.90±9.30 ㎍/mL)이며, 대조구인 ascorbic acid와 BHA는 각각 5.64±0.25 ㎍/mL, 6.57±0.42 ㎍ /mL으로 분획물 중에는 CHCl3 분획물이 가장 낮은 농도에서 50%의 라디칼 소거능을 보였지만 ascorbic acid와 합성 항산화제인 BHA보다는 높은 농도에서 50%의 라디칼 소거능을 나타냈다. ABTS 라디칼 소거능을 평가한 결과 분획물들의 IC50값은 각각 hexane(55.
- . 다릅나무 70% 메탄올 추출물에 대한 용매별 분획물의 총 플라보노이드 함량은 다릅나무의 용매 분획별 플라보노이드 함량은 CHCl3 > EtOAc > Hexane > BuOH > Water 순으로 CHCl3 분획물에서 가장 높은 함량을 나타냈다. 또한 Lee 등24)은 천년 초 줄기의 분획별 플라보노이드 함량이 EtOAc (118.
- . 다릅나무 70% 메탄올 추출물을 각 용매로 분획한 분획물의 전자공여능을 조사한 결과 IC50값은 각각 CHCl3 > EtOAc > Hexane > Water > BuOH 순으로 CHCl3층이 가장 낮은 농도에서 50% 의 라디칼 소거능을 보였다. 대조구인 ascorbic acid와 합성항산화제인 BHA보다는 높은 농도에서 50%의 라디칼 소거능을 나타냈다.
- 다릅나무 수피 70% 메탄올 추출물에 대한 분획물의 따른 ABTS 라디칼을 50% 억제하는데 요구되는 농도(IC50)로써 비교한 결과 CHCl3 > EtOAc > Hexane > BuOH > Water 순으로 CHCl3 분획물에서 가장 높은 라디칼 소거활성을 나타내었다. 대조구인 Ascorbic acid와 BHA과 비교하였을 때 분획물 중에는 CHCl3 분획물이 가장 낮은 농도에서 50%의 라디칼 소거능을 보였지만 유의성 검증 결과 EtOAc 층과 유의차는 없었다.
- 다릅나무 수피 70% 메탄올 추출물에 대한 용매별 분획물을 표준물질인 garilc acid를 기준물질로 하여 표준곡선을 그린 후 분리된 분획물의 폴리페놀 함량을 측정한 결과 hexane (71.96±0.80 ㎎/g), CHCl3(201.98±10.31 ㎎/g), EtOAc (185.23±2.89 ㎎/g), BuOH(83.45±0.9 4㎎/g) 및 water (37.45±1.53 ㎎/g)로 CHCl3 분획물에서 가장 높은 폴리페놀이 함유되어 있음을 확인할 수 있었다. 총 플라보노이드 함량은 (+)-catechin hydrate를 표준물질로 하여 측정한 결과 Hexane(6.
- 총 폴리페놀 함량은 폴리페놀의 산화 환원반응을 응용한 것으로 페놀성 물질인 phospho molybdic acid와 반응하여 청색을 나타내는 원리를 이용하였다21). 다릅나무 수피 용매별 분획물의 폴리페놀 함량을 조사한 결과, 각 용매 분획물의 총 폴리페놀 함량은 CHCl3 > EtOAc > BuOH > Hexane > Water 순으로 CHCl3 분획물에서 가장 높게 나타내었다. 이 등22)은 콩과에 속하는 싸리나무 수피의 CHCl3 분획물(206.
- 다릅나무 수피 추출조건을 검토하였다. 다릅나무 수피에 methanol 농도별 추출물의 폴리페놀 함량을 분석한 결과 0%는 14.91±0.49 mg/g, 30%는 12.71±0.18 mg/g, 50%는 13.61±0.47 mg/g, 70%는 15.44±0.44 mg/g, 99% 14.98±0.21 mg/g로 나타나 70% 농도로 추출한 경우가 함량이 높았으나 농도별 간의 유의성 검정 결과 0%, 70%, 99% 간에는 함량의 유의차가 나타나지 않았다. Methanol 농도별 다릅나무 수피 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성 0%는 1013.
- 42 ㎍/mL의 IC50 값을 나타냈다. 다섯가지의 추출조건 중 모두 총 폴리페놀 및 DPPH 라디칼 소거 활성능에서 70% methanol 추출물이 가장 높은 활성을 가지고 있음을 확인하였다.
- 다릅나무 수피 70% 메탄올 추출물에 대한 분획물의 따른 ABTS 라디칼을 50% 억제하는데 요구되는 농도(IC50)로써 비교한 결과 CHCl3 > EtOAc > Hexane > BuOH > Water 순으로 CHCl3 분획물에서 가장 높은 라디칼 소거활성을 나타내었다. 대조구인 Ascorbic acid와 BHA과 비교하였을 때 분획물 중에는 CHCl3 분획물이 가장 낮은 농도에서 50%의 라디칼 소거능을 보였지만 유의성 검증 결과 EtOAc 층과 유의차는 없었다. 이는 같은 콩과인 싸리나무의 CHCl3층보다도 낮은 농도에서 IC50값을 나타냈고22), 천년초 줄기의 CHCl3층에서는 다릅나무 수피보다 약 75배 높은 농도인 750 ㎍/mL에서 약 50%의 라디칼 소거능24)으로 다릅나무 수피 CHCl3 분획물에서 비교적 우수한 항산화능을 가지는 것을 확인하였다.
- 다릅나무 70% 메탄올 추출물을 각 용매로 분획한 분획물의 전자공여능을 조사한 결과 IC50값은 각각 CHCl3 > EtOAc > Hexane > Water > BuOH 순으로 CHCl3층이 가장 낮은 농도에서 50% 의 라디칼 소거능을 보였다. 대조구인 ascorbic acid와 합성항산화제인 BHA보다는 높은 농도에서 50%의 라디칼 소거능을 나타냈다. 이 등22)은 같은 콩과인 싸리나무의 CHCl3 (96.
- 27 ㎎/mL)에서 폴리페놀 함량이 높다고 보고하였으며, 본 실험결과와 유사한 수준을 나타냈다. 또한 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능의 결과를 미루어보아 다릅나무 수피 부위에 함유되어 있는 페놀성 화합물이 항산화 활성에 영향을 미치는 것으로 유추할 수 있다.
- 한편 Kim 등25)은 작약이나 목단 등 20여종의 약용식물의 메탄올 추출물의 폴리페놀 및 플라보노이드함량을 측정한 결과, 대부분의 식물에서 폴리페놀이 플라보노이드 보다 높으며, 폴리페놀 함량이 플라보노이드 함량보다 월등히 많은 시료의 경우 높은 항산화 활성을 나타내는 것으로 보아 플라보노이드 외에 다른 폴리페놀 화합물들도 항산화 활성에 기여한다고 보고하였다. 본 실험에서의 폴리페놀에서는 BuOH > Hexane 순으로 나타내었지만, 플라보노이드에서는 Hexane > BuOH 순으로 다른 양상을 나타내었다. 이러한 차이 용매별로 용출되는 성분과 양이 달라서 나타나는 결과라고 사료된다.
- 또한 Kim 등25)은 작약이나 목단 등 20여종의 약용식물의 메탄올 추출물의 폴리페놀 및 플라보노이드함량을 측정한 결과, 대부분의 식물에서 폴리페놀 함량이 플라보노이드 보다 높으며, 폴리페놀 함량이 플라보노이드 보다 월등히 높은 시료에서 높은 것으로 보아 플라보노이드 이외에 phenolic acids나 hydroxycinnamic acids 등에 속하는 다른 폴리페놀 화합물들이 전자공여능에 상당히 기여한다고 한 바 있다. 본 연구결과는 전자공여능이 플라보노이드 성분보다는 폴리페놀성분에 의해 발휘되는 것이 아닌가 하는 점을 시사한다.
- 이상의 in vitro 항산화능 결과(폴리페놀, 플라보노이드, DPPH와 ABTS 소거능)에서는 강력한 항산화제로 알려진 BHA 이나 ascorbic acid의 항산화능에는 미치지 못했지만 다릅나무 수피 CHCl3 분획물에서 큰 항산화능을 나타내었다. 앞으로 항산화 효능을 갖는 분리 및 확인을 이루어질 경우 항산화 소재로서 응용 가능성이 있을 것으로 사료된다.
- 53 ㎎/g)로 CHCl3 분획물에서 가장 높은 폴리페놀이 함유되어 있음을 확인할 수 있었다. 총 플라보노이드 함량은 (+)-catechin hydrate를 표준물질로 하여 측정한 결과 Hexane(6.48±1.13 ㎎/g), CHCl3(13.55±1.33 ㎎/g), EtOAc (12.71±0.73 ㎎/g), BuOH(2.48±0.74 ㎎/g) 및 Water (1.71±0.45 ㎎/g)로 CHCl3 분획물에서 가장 높게 나타났지만, 유의성 검증 결과 EtOAc층과 유의한 차를 보이지 않았다.
후속연구
- 페놀화합물과 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거활성과 높은 연관성을 보고한 연구27)에서와 같이 본 연구에서 또한 많은 양의 페놀화합물이 존재하는 CHCl3 분획물에서 높은 활성을 보였다. 따라서, 본 결과를 바탕으로 다릅나무 수피의 CHCl3 분획물을 이용하여 항산화 및 관련 분야에 대한 지속적인 연구의 필요성이 요구되는 바이다.
- 나타내었다. 앞으로 항산화 효능을 갖는 분리 및 확인을 이루어질 경우 항산화 소재로서 응용 가능성이 있을 것으로 사료된다.
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