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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 천연물 생리활성 탐색 및 기능성 연구의 일환으로써 통풍억제 효과가 있다고 보고(27)된 초미세 분쇄 감국 추출물을 이용하여 in vivo에서 통풍억제 효과를 검토하여 건강 기능성 식품 산업에 적용하고자 하였다.
제안 방법
- 13주 후에 급성독성실험과 마찬가지로 쥐를 희생하여 혈액을 모은 후에 간과 신장의 무게를 측정한 후 간과 혈장을 분석 전까지 -80°C에 저장하였다.
- RNA 농도는 Nanodrop(Thermo, Wilmington, DE, USA)을 이용하여 260 및 280 nm 파장에서 측정하였다.
- RNA 증폭은 분리한 RNA 1 μg을 High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)으로 cDNA로 제작한 후 real-time PCR을 시행하였다.
- Real-time PCR은 95°C에서 10분의 전 반응을 거친 다음, 변성(95°C, 15초), 어닐링(55°C, 20초) 및 연장 (72°C, 35초)의 과정을 45회 반복하여 Realtime PCR 7500 System과 Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)를 이용하여 측정하였다.
- 13주 후에 급성독성실험과 마찬가지로 쥐를 희생하여 혈액을 모은 후에 간과 신장의 무게를 측정한 후 간과 혈장을 분석 전까지 -80°C에 저장하였다. 간 독성 측정을 위하여 GOT와 GPT를 측정하였다.
- 간 독성을 측정하기 위하여 혈장에서 GOT와 GPT를 측정하였다. 측정 kit은 아산제약(Seoul, Korea)의 transaminase kit을 이용하여 측정하였다.
- 일주일 후에 마취제(tiletamine and zolazepam 25 mg/kg, xylazine 10 mg/kg)를 복강으로 주입하여 마취한 후 쥐를 희생하여 혈액을 채취하고 혈장을 분리하여 분석 전까지 -80°C에 보관하였다. 간과 신장은 절취하여 무게를 측정한 후 간 독성 측정을 위하여 glutamate oxaloacetate transaminase(GOT), glutamate pyruvate transaminase(GPT)를 측정하였다.
- 주입한 군으로 나누었다. 감국 추출건조물은 상기의 농도별로 7일간 경구 투여하였다. 경구 투여 6일째에 MSU 4 mg/50 μL를 양쪽 뒷발에 주입하고 7일째 오전에 감국 추출건조물을 경구 투여한 후 오후에 쥐에 마취제를 투여하여 희생하였다.
- 감국 추출건조물을 농도별로 제조(0, 0.5, 1, 2.5, 5, 10 g/kg)하여 그룹당 10마리씩 oral gavage를 한번 한 후 쥐의 행동양상을 관찰하고 생존율을 측정하였다. 일주일 후에 마취제(tiletamine and zolazepam 25 mg/kg, xylazine 10 mg/kg)를 복강으로 주입하여 마취한 후 쥐를 희생하여 혈액을 채취하고 혈장을 분리하여 분석 전까지 -80°C에 보관하였다.
- 감국 추출건조물을 생쥐가 섭취하는 물에 농도별(0, 0.25, 0.5, 1, 2 g/kg)로 희석하여 그룹당 10마리씩 13주간 자유롭게 섭취시켰다. 기간 중 식이 섭취량과 물 섭취량, 몸무게 변화, 행동양상을 관찰하였다.
- 감국의 통풍억제 효과를 측정하기 위하여 생쥐에 생리식염수를 주입한 대조군과 MSU를 주입한 실험군으로 나누고 MSU 주입군은 다시 감국 추출건조물을 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 10 g/kg B.W. 주입한 군으로 나누었다. 감국 추출건조물은 상기의 농도별로 7일간 경구 투여하였다.
- 결정 0.04 g을 500 μL saline 용액에 녹여서 쥐의 뒷발에 4 mg/50 μL를 주입하여 통풍을 유발했으며, 쥐에 마취제(tiletamine and zolazepam 25 mg/kg, xylazine 10 mg/kg)를 복강으로 주입하여 마취한 후 발의 부종을 확인하고 발의 두께를 디지털 캘리퍼스(Mitutoyo Corporation, Kawasaki, Japan)로 측정하였다.
- 경구 투여 6일째에 MSU 4 mg/50 μL를 양쪽 뒷발에 주입하고 7일째 오전에 감국 추출건조물을 경구 투여한 후 오후에 쥐에 마취제를 투여하여 희생하였다.
- 5, 1, 2 g/kg)로 희석하여 그룹당 10마리씩 13주간 자유롭게 섭취시켰다. 기간 중 식이 섭취량과 물 섭취량, 몸무게 변화, 행동양상을 관찰하였다. 13주 후에 급성독성실험과 마찬가지로 쥐를 희생하여 혈액을 모은 후에 간과 신장의 무게를 측정한 후 간과 혈장을 분석 전까지 -80°C에 저장하였다.
- 물은 일주일 2번 바꾸어 주었으며 하루 평균 물 섭취량을 측정하여 일주일간의 평균치로 표시하였다. 물 섭취량은 Fig.
- 혈액을 원심분리 하여 혈장을 분리하고 혈장과 간을 -80°C에 저장하였다. 발의 부종 정도는 디지털 캘리퍼스로 두께를 측정하였다.
- 생쥐를 각 그룹당 10마리씩 6개 그룹으로 나누고 각각 감국 추출물 0, 0.5, 1, 2.5, 5, 10 g/kg씩 경구로 1회 투여한 후 일주일간 관찰하였다. 일주일 경과 후 각 그룹 모두 한 마리의 생쥐도 죽지 않았으며 생쥐에서 특별한 행동양상도 관찰되지 않았다.
- 사육조건은 오전 7시에서 오후 7시까지 12시간을 전등으로 밝게 유지하고 이후 12시간은 소등하였다. 식이와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 식이와 물 섭취량을 측정하였다. 실험동물은 영남대학교 의과대학 동물사의 관리지침에 따라서 사육되었으며, 실험은 영남대학교 의과대학 동물윤리위원회의 승인 아래 시행하였다(승인번호: YUMC-AEC2010-007).
- 간 독성을 측정하기 위하여 혈장에서 GOT와 GPT를 측정하였다. 측정 kit은 아산제약(Seoul, Korea)의 transaminase kit을 이용하여 측정하였다. 혈장 TNF-α는 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 방법을 이용하여 측정하였다(Invitrogen, Camarillo, CA, USA).
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통풍유발
통풍실험을 위하여 생쥐 개체수를 그룹당 10마리씩 정하여 실험하였다. 통풍유발은 4 g의 uric acid를 0.
- 혈액을 원심분리 하여 혈장을 모으고 간을 적출하여 -80°C에 저장하였다. 통풍유발을 위한 적정시간을 확인하기 위하여 MSU를 주입한 후 48시간 동안 경과시간별로 염증성 사이토카인의 발현을 측정하였다.
- 통풍의 유발모델은 복강으로 MSU를 투여하는 방법과 동물의 발에 투여하는 방법이 있다. 통풍은 관절에서 발생하기 쉬우며, 염증에 의한 발의 부종을 직접 관찰하기 쉬운 장점이 있어 본 연구에서는 발 모델을 선택하여 실험을 진행하였다. 마우스에서 통풍의 유발을 위하여 MSU 4 mg/50 μL를 오른쪽 뒷발에 주입하고 왼쪽 뒷발에는 생리식염수를 주입한 후 발의 부종을 24시간 동안 시간별로 관찰하고 발에서의 염증성 사이토카인의 발현을 측정한 결과 Fig.
대상 데이터
- 내부 표준 품으로는 β-actin을 사용하였으며, primer 서열은 TNF-α 의 경우 5'-CTATCTCCAGGTTCTCTTCAA-3'(sense)과 5'-GCAGAGAGGAGGTTGACTTTC-3'(anti-sense)이었고 size는 71 bp였으며, interleukin(IL)-1β는 5'-GCCC ATCCTCTGTGACTC-3'(sense)과 5'-AGTGCAGCTGT CTAATGGGA-3'(anti-sense)이었고 size는 71 bp였다.
- 본 실험에서 사용된 감국은 시중 한약방에서 구입하여 45°C dry oven에서 건조한 후, 건조된 감국을 10 L 용량의 초미세 분쇄 장치(MKFS10-1, Koen 21 Co., Ansan, Korea)를 이용하여 시간당 20 kg의 grinding 속도로 ultrafine grinding(125 μm ISO mesh size, ASTM 140 mesh: 통과 사이즈)으로 분쇄하여 시료로 사용하였다.
- 실험동물은 7주된 C57BL/6J 생쥐 수컷을 사용하였으며 샘타코(Seoul, Korea)에서 구입하여 영남대학교 의과대학 동물사의 청정실에서 사육하였다. 사육조건은 오전 7시에서 오후 7시까지 12시간을 전등으로 밝게 유지하고 이후 12시간은 소등하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 평균±표준오차로 표기하였다. 각 군 간의 차이는 t-test를 사용하여 평가하였으며 95% 유의수준을 인정하였다.
- 실험 결과는 평균±표준오차로 표기하였다.
이론/모형
- 유전자 발현은 real-time PCR로 분석하였다. RNA 추출은 1 mL TRI-reagent(Sigma-Aldrich Co.
- 혈장 TNF-α는 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 방법을 이용하여 측정하였다(Invitrogen, Camarillo, CA, USA).
성능/효과
- 6에서와 같이 MSU 대신 생리식염수를 주입한 대조군(control)에 비하여 MSU 주입군에서 통계적으로 유의하게 발 부종이 증가하였다. 1 g/kg 미만의 저농도의 투여군에서는 Fig. 6A에서와 같이 투여농도 증가에 따른 발 부종 억제 효과는 거의 없었음을 알 수 있었다. 그러나 투여량이 2~10 g/kg의 고농도군에서는 Fig.
- 2B에서와 같이 4주째 전 그룹에서 약간 감소하는 경향을 나타내었으나 5주째에는 복귀되었으며 13주간 경과 시까지 큰 차이는 나타내지 않았다. 13주간의 하루 평균 식이 섭취량도 감국 추출물의 투여농도와는 무관한 것으로 나타났다.
- 이상의 결과에서 감국 추출물을 2 g/kg 이상 투여한 그룹에서는 통풍의 염증 및 부종 억제 효과가 있었으나, 10 g/kg 투여군에서는 오히려 염증이 증가하는 경향이 있었다. Cho (27)가 감국 추출물의 물 추출물이 43.45%의 xanthin oxidase에 대한 억제 효과를 나타내었다고 보고한 것과 본 연구 결과를 종합해보면, 감국 추출물은 XOase의 작용을 억제하며 통풍으로 인한 염증작용도 억제하므로 통풍예방물질로써 활용이 가능할 것으로 판단하였다.
- 감국 에탄올 추출물의 만성독성을 측정하기 위하여 생쥐를 10마리씩 5개 그룹으로 나눈 후 각 그룹에 감국 추출물을 0, 0.25, 0.5, 1, 2 g/kg 농도가 되게 제조한 물을 13주간 섭취시키며 1주일 간격으로 몸무게를 측정한 결과, Fig. 2A 에서와 같이 그룹 간에 큰 차이가 없었으며, 13주 경과 후 감국 추출물 투여농도별 체중 변화도 그룹 간에도 큰 차이는 나타나지 않았다. 일주일간의 하루 평균 식이 섭취량도 매주 13주간 측정한 결과, Fig.
- 일주일 경과 후 각 그룹 모두 한 마리의 생쥐도 죽지 않았으며 생쥐에서 특별한 행동양상도 관찰되지 않았다. 감국 추출물 투여 후 일주일간 생쥐의 식이 섭취량과 몸무게를 측정한 결과 Fig. 1A~D에서와 같이 식이섭취량과 몸무게는 각 그룹 간에 유의적인 차이가 없었으며, 신장과 간 무게도 그룹 간 차이는 발생하지 않았다. 감국 추출물에 의한 간 독성을 살펴보기 위하여 감국 에탄올 추출물 투여 후 생쥐의 혈장 GOT와 GPT를 측정한 결과 Fig.
- 1A~D에서와 같이 식이섭취량과 몸무게는 각 그룹 간에 유의적인 차이가 없었으며, 신장과 간 무게도 그룹 간 차이는 발생하지 않았다. 감국 추출물에 의한 간 독성을 살펴보기 위하여 감국 에탄올 추출물 투여 후 생쥐의 혈장 GOT와 GPT를 측정한 결과 Fig. 1E와 1F에서와 같이 혈장 GOT와 GPT도 그룹 간 유의적인 차이가 나타나지 않아 감국 추출물은 급성독성이 거의 없는 것으로 판단되었다.
- 감국 추출물 섭취 13주 후 측정한 신장, 간, 비장, 심장 등의 장기들의 무게도 Table 1에서와 같이 유의적인 차이가 없었다. 감국 추출물에 의한 만성 간 독성을 살펴보기 위하여 감국 추출물을 13주간 장기적으로 경구 투여 후 혈장 GOT와 GPT를 측정한 결과 Table 1에서와 같이 대조군과 비교하여 GOT와 GPT 농도가 감국 추출물의 투여 때문에 증가하는 양상은 나타나지 않았으며, 각 그룹 간에 유의적인 차이는 확인되지 않았다. 따라서 감국 추출물은 2 g/kg 정도의 투여량에 대해서 만성독성이 없는 것으로 확인되었다.
- 감국 추출물의 투여농도가 통풍에 의한 발 부종에 미치는 영향을 측정하기 위하여 발바닥의 돌기를 기준으로 일정 부분을 디지털 캘리퍼스로 발 두께를 측정한 결과 Fig. 6에서와 같이 MSU 대신 생리식염수를 주입한 대조군(control)에 비하여 MSU 주입군에서 통계적으로 유의하게 발 부종이 증가하였다. 1 g/kg 미만의 저농도의 투여군에서는 Fig.
- 감국 추출물의 투여농도가 통풍에 의한 생쥐 발에서의 염증성 사이토카인에 미치는 영향을 살펴본 결과 감국 0, 2, 4, 10 g/kg 투여 그룹에서 MSU에 의한 TNF-α, IL-1β, iNOS 등의 염증성 사이토카인은 Fig. 7A에서와 같이 iNOS 의 경우 감국 추출물의 투여농도가 높아질수록 모든 군에서 투여하지 않은 군보다 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 경향을 나타내었으며, 10 g/kg 투여군에서 제일 많이 감소 하였다.
- 따라서 간에서의 사이토카인의 발현과 혈장 TNF-α 농도는 MSU 주입군에서는 증가하는 경향을 나타내었고, 감국 추출물의 투여 때문에 통계적인 유의성을 가지며 감소하는 경향을 나타내었다.
- 감국 추출물에 의한 만성 간 독성을 살펴보기 위하여 감국 추출물을 13주간 장기적으로 경구 투여 후 혈장 GOT와 GPT를 측정한 결과 Table 1에서와 같이 대조군과 비교하여 GOT와 GPT 농도가 감국 추출물의 투여 때문에 증가하는 양상은 나타나지 않았으며, 각 그룹 간에 유의적인 차이는 확인되지 않았다. 따라서 감국 추출물은 2 g/kg 정도의 투여량에 대해서 만성독성이 없는 것으로 확인되었다.
- 7C에서와 같이 2와 4 g/kg 투여군에서는 감소하였으나 10 g/kg 투여군에서는 감소하지 않았다. 따라서 감국 추출물의 고농도 투여 시 투여농도가 높아질수록 MSU를 투여하지 않은 그룹에 비해 유의적인 염증억제 효과가 확인되었다. 간에서의 염증성 사이토카인의 발현은 Fig.
- 5에서와 같이 12시간 경과 시 TNF-α, IL-1β 등이 유의적으로 증가하는 경향을 나타내었다. 따라서 통풍유발 실험에서의 염증 사이토카인은 MSU 주입 후 24시간 경과 시 가장 높은 것으로 확인되었다.
- 또한, MSU에 의해 간에서 RNA를 추출한 후 real-time PCR로 염증성 사이토카인의 발현을 측정한 결과 Fig. 5에서와 같이 12시간 경과 시 TNF-α, IL-1β 등이 유의적으로 증가하는 경향을 나타내었다.
- 마우스에서 통풍의 유발을 위하여 MSU 4 mg/50 μL를 오른쪽 뒷발에 주입하고 왼쪽 뒷발에는 생리식염수를 주입한 후 발의 부종을 24시간 동안 시간별로 관찰하고 발에서의 염증성 사이토카인의 발현을 측정한 결과 Fig. 3에서와 같이 발의 부종은 MSU를 주입한 24시간 후부터 육안으로 식별이 가능할 정도로 부종의 차이가 발견되었으며 48시간에 가장 심하고 72시간 이후에도 정상 발에 비하여 부종이 유지되었다.
- 물은 일주일 2번 바꾸어 주었으며 하루 평균 물 섭취량을 측정하여 일주일간의 평균치로 표시하였다. 물 섭취량은 Fig. 2C에서와 같이 감국 추출물 섭취군에서 다소 높아지는 경향을 나타내었으나 큰 차이를 나타내지는 않았으며, 13주간의 하루 평균 물 섭취량에서도 감국을 섭취한 모든 군에서 물 섭취량이 다소 높아지는 경향을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 감국 추출물을 장기적으로 섭취한 그룹에서 물의 섭취가 증가하는 양상을 나타내었는데, 이러한 결과는 혈압강하효과 및 혈액순환의 증가작용과 연관된 것으로 추측되나 확실한 기전을 규명하기 위해서는 더 많은 연구가 필요하다고 판단되었다.
- 이는 감국 추출물의 단기독성 검정시 간의 GOP와 GPT 수치가 10 g/kg 투여군에서 약간 증가한 것과 연관하여 10 g/kg 투여군에서 약간의 단기간 독성을 나타내어 TNF-α와 IL-1β 등 사이토카인의 수치가 다소 높아진 것으로 추측하였다.
- 이상의 결과에서 감국 추출물을 2 g/kg 이상 투여한 그룹에서는 통풍의 염증 및 부종 억제 효과가 있었으나, 10 g/kg 투여군에서는 오히려 염증이 증가하는 경향이 있었다. Cho (27)가 감국 추출물의 물 추출물이 43.
- 5, 5, 10 g/kg씩 경구로 1회 투여한 후 일주일간 관찰하였다. 일주일 경과 후 각 그룹 모두 한 마리의 생쥐도 죽지 않았으며 생쥐에서 특별한 행동양상도 관찰되지 않았다. 감국 추출물 투여 후 일주일간 생쥐의 식이 섭취량과 몸무게를 측정한 결과 Fig.
- 2A 에서와 같이 그룹 간에 큰 차이가 없었으며, 13주 경과 후 감국 추출물 투여농도별 체중 변화도 그룹 간에도 큰 차이는 나타나지 않았다. 일주일간의 하루 평균 식이 섭취량도 매주 13주간 측정한 결과, Fig. 2B에서와 같이 4주째 전 그룹에서 약간 감소하는 경향을 나타내었으나 5주째에는 복귀되었으며 13주간 경과 시까지 큰 차이는 나타내지 않았다. 13주간의 하루 평균 식이 섭취량도 감국 추출물의 투여농도와는 무관한 것으로 나타났다.
- 통풍유발을 위하여 MSU를 주입 후 시간별로 생쥐를 희생하여 발의 RNA를 추출한 후 real-time PCR로 염증성 사이토카인의 발현을 측정한 결과 Fig. 4에서와 같이 24시간 경과 후부터 TNF-α, IL-1β 등의 염증성 사이토카인이 유의적으로 발현이 증가하였으며, iNOS의 발현은 24시간 경과 시 최고조에 달하는 것을 알 수 있었다.
- 혈중 IL-1β의 발현은 Fig. 8B에서와 같이 대조군에 비해 감국 처리군에서 농도 의존적으로 유의적인 발현 억제가 이루어짐을 알 수 있었다.
- 혈중 TNF-α의 발현은 Fig. 8A에서와 같이 감국을 2와 4 g/kg 투여한 그룹과 투여하지 않은 그룹 간에 통계적으로 유의한 차이가 없었으나 10 g/kg 투여군에서는 유의적인 감소가 관찰되었다.
후속연구
- 2C에서와 같이 감국 추출물 섭취군에서 다소 높아지는 경향을 나타내었으나 큰 차이를 나타내지는 않았으며, 13주간의 하루 평균 물 섭취량에서도 감국을 섭취한 모든 군에서 물 섭취량이 다소 높아지는 경향을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 감국 추출물을 장기적으로 섭취한 그룹에서 물의 섭취가 증가하는 양상을 나타내었는데, 이러한 결과는 혈압강하효과 및 혈액순환의 증가작용과 연관된 것으로 추측되나 확실한 기전을 규명하기 위해서는 더 많은 연구가 필요하다고 판단되었다. 감국 추출물 섭취 13주 후 측정한 신장, 간, 비장, 심장 등의 장기들의 무게도 Table 1에서와 같이 유의적인 차이가 없었다.
- 통풍의 치료는 의학 분야에서 긴 전통을 가지고 있으나, 최근 식이요법의 새로운 방향이 제시되고 기존에 쓰던 약물에 저항을 보이는 환자에게 사용될 수 있는 새로운 요산 강하제가 개발되어 기능성 식품 분야에 적용되는 등 변화를 보인다. 이러한 발전과 더불어 약용작물을 이용한 천연물을 이용하여 요산 저하 효과를 유발할 수 있다면 edible 백신의 개념을 가지는 제품의 개발이 가능하리라 판단된다.
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