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문제 정의
- 이처럼 도라지도 인삼과 같이 함유한 사포닌 종류가 다양하며, 가공 및 발효 처리에 의하여 결합하고 있는 당 물질이 분해하는 정도에 따라 구성하고 있는 사포닌 물질이 달라지고 있으나 변환된 사포닌 물질 각각의 기능성 효과에 대한 연구는 도라지의 대표적 사포닌인 platycodin D 및 platycoside E의 기능성에 대한 연구발표만 있으므로 이에 대한 연구가 더 필요할 것으로 생각된다. 따라서 본 연구에서는 도라지에 각종 젖산균을 접종 배양해본 결과 젖산균의 종류에 따라 도라지 사포닌 조성의 변화를 볼 수 있었으며, 호흡기질환유발세균에 대한 항균력도 증가하는 것을 볼 수 있었기에 젖산발효에 의한 기능성이 증진된 제품개발에 기초자료로 제공하고자 하였다.
제안 방법
- pH의 변화는 발효도라지물을 일정량 취하여 pH meter(Mettler Toledo 225, Mettler Toledo Instruments Ltd., Langacher, Switzerland)로 측정하였고, 미생물의 생육도는 MRS agar 배지에 발효기간에 따라 발효된 도라지의 일정량을 멸균수로 100배 희석한 발효액을 100μL씩 분주하여 균일하게 도말한 후 48시간 배양한 다음 형성된 colony 수를 측정하여 colony forming unit으로 비교표현하였다.
- 도라지 시료는 젖산발효 하지 않은 도라지와 젖산균 종류별로 발효한 시료를 원심분리 하여 발효물의 상등액을 TSB 배지에 100 mg/mL가 되도록 양을 조절하여 주입한 후 121℃에서 20분간 멸균한 다음 106 CFU/mL농도로 조절한 호흡기질환 유발세균을 100 μL씩 주입하여37℃에서 50 rpm으로 진탕 배양하였다.
- 배양하는 동안 균종별에 따라 시간대별로 균의 성장을 spectrophotometer를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하고 도라지를 젖산발효 하지 않은 것과 항균력을 조사 비교하였다. 또 항균력이 우수한 도라지 발효추출물의 호흡기질환 유발세균들에 대한 최소생육저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 알아보기 위해 TSA 배지에 대하여 최종농도가 5~250 mg/mL의 범위에서 5 mg/mL 간격으로 발효도라지 추출물을 배지에 각각 첨가하여 plate에 분주 후 응고시켰다. 여기에 균주배양액(106 CFU/mL)을 100 μL씩 각각분주한 후 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 미생물이 증식되지 않은 첨가물 농도를 확인하여 최소생육저해농도로 결정하였다.
- 도라지 시료는 젖산발효 하지 않은 도라지와 젖산균 종류별로 발효한 시료를 원심분리 하여 발효물의 상등액을 TSB 배지에 100 mg/mL가 되도록 양을 조절하여 주입한 후 121℃에서 20분간 멸균한 다음 106 CFU/mL농도로 조절한 호흡기질환 유발세균을 100 μL씩 주입하여37℃에서 50 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양하는 동안 균종별에 따라 시간대별로 균의 성장을 spectrophotometer를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하고 도라지를 젖산발효 하지 않은 것과 항균력을 조사 비교하였다. 또 항균력이 우수한 도라지 발효추출물의 호흡기질환 유발세균들에 대한 최소생육저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 알아보기 위해 TSA 배지에 대하여 최종농도가 5~250 mg/mL의 범위에서 5 mg/mL 간격으로 발효도라지 추출물을 배지에 각각 첨가하여 plate에 분주 후 응고시켰다.
- , Kent, UK)로 여과, HPLC에 10 μL씩 주입하여 분석하였다. 사용한 칼럼은 Agilent ZORBAX SB-C18(Agilent, Santa Clara, CA, USA)을 장착한 HPLC system(Agilent 1200 series system with DAD detector at 203nm 및 210 nm)을 이용하였고, 이동상의 조건은 용매 A(water)와 용매 B(acetonitrile)를 이용하여 용매 B를 0분(20%), 22분(31%), 28분(38%), 32분(40%), 50분(50%),post time 5분의 조건하에 칼럼온도 35℃, 유속 0.8 mL/min으로 흘려주었다. 도라지 사포닌의 표준시약으로는 platycodin D와 D2는 Chengdu Biopurify PhytochemicalsLtd.
- 여기에 균주배양액(106 CFU/mL)을 100 μL씩 각각분주한 후 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 미생물이 증식되지 않은 첨가물 농도를 확인하여 최소생육저해농도로 결정하였다.
- 젖산균주의 종류에 따라 도라지에 대한 발효특성 조사는 발효시간에 따른 발효물의 pH 변화 및 미생물의 생육도 변화를 조사하였다. pH의 변화는 발효도라지물을 일정량 취하여 pH meter(Mettler Toledo 225, Mettler Toledo Instruments Ltd.
- 젖산발효를 위한 도라지의 처리는 도라지 분말 50 g에 도라지 중량의 10배량의 물을 가하여 충분히 혼합한 후 121℃에서 20분간 멸균 처리하였다. 젖산균 접종은 MRS broth배지에서 배양시킨 균주액을 106 CFU/mL 농도가 되도록 멸균수로 희석한 후 멸균된 도라지 시료액에 대하여 3%(W/W)가 되도록 접종한 다음 37℃에서 4일간 발효시켰다.
- 즉 발효 처리를 24, 48, 72 및 96시간에 따라 발효되는 시료 10 g에 20배의 70% 메탄올 용매를 가한 후 70℃의 온도에서 5시간씩 환류 추출하고 그 여액을 원심분리 한 다음 상등액을 membrane filter(0.20 μM pore size, Whatman Co., Kent, UK)로 여과, HPLC에 10 μL씩 주입하여 분석하였다.
대상 데이터
- Ltd.(Wuhan, China), platycodin A는 Quality Phytochemicals LLC(Metuchen, NJ, USA), platycodin D3, platycoside E 및 polygalacin D는 한국한방산업진흥원(Gyeongsan, Korea), polygalacin D2는 PubChem(Bethesda, MD, USA) 등에서 분양받아 9종의 표준품을 사용하였다.
- 호흡기질환 유발세균에 대한 도라지 젖산발효물의 항균 활성을 조사하기 위하여 사용된 균은 Corynebacterium diphtheriae KCTC 3075, Klebsiella pneumoniae KCTC2246, Staphylococcus aureus KCTC 1621 및 Streptococcus pyogenes ATCC 19615로 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Daejeon, Korea)에서 분양받았다. 미생물 배양은 Trypic soy broth(TSB, Difco Co.) 배지와 Trypicsoy broth agar(TSA, Difco Co.)를 사용하여 37℃ incubator에서 균주에 따라 24~39시간 배양하여 항균력 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 도라지(Platycodon grandiflorum)는 충남 금산군 포장에서 재배된 3년근 도라지를 2014년 10월 중순에 수확한 것으로 한 뿌리당 길이 20±2 cm, 중량 15±1g 정도의 중 뿌리를 선별하여 세척하고 탈수한 후 한약재의 표준 건조방법대로 40±1℃에서 온풍 건조하여 70 mesh로 분쇄한 다음 -20℃의 냉동고에 보관한 후 시료로 사용하였다.
- 젖산발효를 하기 위하여 사용한 젖산균은 농촌진흥청 국립농업과학원 발효식품과에서 젖산발효균으로 우수하다고 분리된 젖산균인 Leuconostoc mesenteroides N12-4, Leuconostoc mesenteroides N58-5, Lactobacillus plantarum N76-10, Lactobacillus plantarum N56-12, Lactobacillus brevis N70-9 및 Lactobacillus brevis E3-8등 6종을 농촌진흥청 발효식품과에서 분양받았으며, 균주배양은 MRS broth(Difco Co., Detroit, MI, USA) 배지를 이용하여 37℃ incubator에서 24~36시간 배양하여 사용하였다. 호흡기질환 유발세균에 대한 도라지 젖산발효물의 항균 활성을 조사하기 위하여 사용된 균은 Corynebacterium diphtheriae KCTC 3075, Klebsiella pneumoniae KCTC2246, Staphylococcus aureus KCTC 1621 및 Streptococcus pyogenes ATCC 19615로 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Daejeon, Korea)에서 분양받았다.
- , Detroit, MI, USA) 배지를 이용하여 37℃ incubator에서 24~36시간 배양하여 사용하였다. 호흡기질환 유발세균에 대한 도라지 젖산발효물의 항균 활성을 조사하기 위하여 사용된 균은 Corynebacterium diphtheriae KCTC 3075, Klebsiella pneumoniae KCTC2246, Staphylococcus aureus KCTC 1621 및 Streptococcus pyogenes ATCC 19615로 한국생명공학연구원 미생물자원센터(Daejeon, Korea)에서 분양받았다. 미생물 배양은 Trypic soy broth(TSB, Difco Co.
데이터처리
- Means with different letters (a-c) in the same fermented time indicate significant differences (P<0.05) by Duncan's multiple range test.
- Means with different letters (a-d) in the same fermented time indicate significant differences (P<0.05) by Duncan's multiple range test.
- Means with different letters (a-e) in the same bacteria culture time indicate significant differences (P<0.05) by Duncan's multiple range test.
- 모든 자료의 통계분석은 SAS(Statistical Analysis System) software package(SAS 9.1.3, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 각 데이터 간의 유의성을 다중범위 검정(Duncan's multiple range test)으로 5% 및1% 수준에서 검정하였다.
- 본 연구의 실험 결과들은 각 처리구 시료에 대하여 3회 반복 측정하여 이루어졌으며 모두 평균±표준편차로 나타내었다.
성능/효과
- pneumonia,S. aureus 및 S. pyogenes 각각 균에 대하여 도라지 무발효추출물과 비교한 결과(Table 1) 무발효추출물은 각 균에 대하여 200, 180, 210 및 90 mg/mL였고, L. plantarum N56- 12균으로 발효된 도라지 추출액은 45, 10, 50, 그리고 25mg/mL로 나타나 항균 효과에 유의적 차이가 인정됨을 볼 수 있었다.
- 도라지 내에 가장 많이 함유된 platycoside E의 경우는 발효 시작 후 48시간까지는 감소하는 경향이다가 그 이후 증가하는 경향을 보였고 일반적으로 도라지의 대표적인 사포닌으로 많이 알고 있는 platycodin D는 발효 72시간까지 꾸준히 미량 증가하다가 감소하는 경향을 보였는데 Leuc. mesenteroidesN12-4와 L. brevis N70-9균은 급격히 감소하는 경향이었다. 또 젖산균 발효 때문에 발효 72시간 이후 96시간 발효 시 deapioplatycoside E가 급격히 증가하였다.
- 배양 9시간째 무발효도라지 추출물과 젖산발효 추출물 간의 유의적인 차이로 항균성을 보여주었지만 배양 27시간 이후부터는 Leuc. mesenteroidesN58-5균에서는 MRS 배지로 배양한 균보다 OD값이 훨씬 더 높아 오히려 기관지질환 유발세균의 생육이 촉진되는 것을 볼 수 있었다. 그러나 L.
- 그러나 Leuc. mesenteroides균들로 발효한 도라지 상등액은 오히려 도라지 무발효물보다 항균력이 감소하는 것을 볼 수 있었고, L. brevis균으로 발효시킨 도라지 상등액에서는 항균력이 2배 정도 더 증가하는 것을 볼 수 있었으며, 특히 L. plantarum N56-12균으로 발효시킨 도라지 상등액에서는 배양 24시간까지 거의 OD값이 증가하지 않아 항균력이 상당히 높음을 볼 수 있었다. K.
- plantarum균보다는 생육도가 낮았으나 Leuc. mesenteroides균보다는 생육도가 높은 편으로 나타나 발효 72시간 이후는 L. plantarum균이 가장 높은 생육도를 보였다. 그러나 Lee 등(27)이 연근 및 도라지를 당침한 후 그 당액으로 젖산발효를 했을 경우발효시간이 길어짐에 따라 젖산균이 감소하였다고 보고한 것과는 다른 결과를 보여주어 도라지를 발효시킬 때 시료의 처리에 따라서도 젖산균의 생육이 달라짐을 볼 수 있었다.
- aureus균(C)에 대한 항균 활성은 배양 9시간째 무발효도라지 추출물이나 Leuc. mesenteroides균으로 발효시킨 추출물과 유의적인 차이를 보였으며 L. plantarum N56-12균으로 발효시킨 도라지 상등액에서는 발효 24시간 이후까지 세균 생육이 저지되어 항균 활성이 우수함을 볼 수 있었다. 또 S.
- brevis균으로 발효시킨 도라지 상등액에서 강한 항균 효과를 보여 균 배양 36시간까지 OD값이 거의 변화하지 않았으며, 무발효도라지 추출물과 Leuc. mesenteroides균으로 발효시킨 추출물과는 유의적인 차이를 보여주었고 발효 40시간에는 OD값이 약간 상승하였으며, L. plantarum균은 발효 40시간까지 OD값이 거의 변하지 않아 도라지 무발효물보다 항균성이 우수함을 보여주었다. S.
- mesenteroidesN58-5균에서는 MRS 배지로 배양한 균보다 OD값이 훨씬 더 높아 오히려 기관지질환 유발세균의 생육이 촉진되는 것을 볼 수 있었다. 그러나 L. plantarum균과 L. brevis균은 배양시간이 진행되어도 OD값의 변화가 거의 없어 항균 효과가 도라지 무발효물보다 상승하는 효과를 보여주었다. 이상과 같이 호흡기질환 유발세균에 대한 항균 활성이 증대된 발효물은 L.
- plantarum N56-12균으로 발효시킨 도라지 상등액에서 본 연구에 사용된 호흡기질환 유발세균 4종 모두에 강한 항균 활성이 나타나 도라지의 항균 활성에 대한 기능성을 더 높여주는 결과를 보여주었다. 따라서 가장 항균성이 뛰어난 L. plantarum N56-12균으로 발효시킨 도라지 추출물에 대하여 각 기관지질환 유발세균에 대한 MIC를 조사한 결과 C. diphtheriae, K. pneumonia,S. aureus 및 S.
- plantarum N56-12균으로 발효시킨 도라지 상등액에서는 발효 24시간 이후까지 세균 생육이 저지되어 항균 활성이 우수함을 볼 수 있었다. 또 S. pyogenes균(D)에 대한 항균 활성을 실험한 결과 이 균은 다른 호흡기질환 유발세균보다 생육속도가 느린편으로 세균 배양에 따른 배지의 혼탁도가 낮아 상대적으로 흡광도 값이 낮게 나타났다. 배양 9시간째 무발효도라지 추출물과 젖산발효 추출물 간의 유의적인 차이로 항균성을 보여주었지만 배양 27시간 이후부터는 Leuc.
- 339분대에 검출되어 9종을 모두 분리할 수 있었다(data not shown). 또 본 실험에 사용한 도라지에서 검출된 사포닌은 9종 모두 검출되었으며, Fig. 4에서 보는 바와 같이 platycoside E가 3.29 mg/g으로 사포닌이 가장 많이 함유되어 있었고 그 다음은 polygalacin D가 2.04 mg/g, platycodin D가 1.93 mg/g으로 많이 함유되어 있었다. 이는 Kim 등(29)이 한국산 3년생과 21년생 및 중국산 도라지를 분석한 결과 중국산은 platycodin D의 함량이 높았고 한국산에서는 3년생에 비하여 21년생 도라지에서 platycodin D와 D2를 제외하고는 platycoside E와 diapioplatycoside E 등을 포함한 기타 사포닌류가 더 많이 함유되어 있었다고 보고한 것과 비슷한 결과를 보여주었다.
- 본 실험에 사용한 도라지 사포닌은 platycoside류 표준품9종을 가지고 상기 분석조건에 의하여 분리한 결과 검출시간이 platycoside E는 12.017분, platycodin D3는 16.131분, platycodin A는 21.096분, platycodin D2는 21.533분, platycodin D는 22.026분, polygalacin D2는 22.521분, polygalacin D는 22.876분, deapioplatycoside E는 23.379분 및 deapioplatycodin D3는 30.339분대에 검출되어 9종을 모두 분리할 수 있었다(data not shown).
- brevis균은 배양시간이 진행되어도 OD값의 변화가 거의 없어 항균 효과가 도라지 무발효물보다 상승하는 효과를 보여주었다. 이상과 같이 호흡기질환 유발세균에 대한 항균 활성이 증대된 발효물은 L. plantarum균, 특히 L. plantarum N56-12균으로 발효시킨 도라지 상등액에서 본 연구에 사용된 호흡기질환 유발세균 4종 모두에 강한 항균 활성이 나타나 도라지의 항균 활성에 대한 기능성을 더 높여주는 결과를 보여주었다. 따라서 가장 항균성이 뛰어난 L.
- 1 및 2와 같다. 젖산균별에 따라 도라지를 발효시키면서 pH의 변화를 본 결과 L. plantarum균이 발효 때문에 pH의 변화가 가장 큰 것을 볼 수 있었다. 즉 L.
- 5와 같다. 젖산균의 생육도, pH의 변화 및 도라지 사포닌함량 등을 고려하여 도라지를 젖산균별로 96시간 발효시킨 도라지 상등액을 TSB 배지에 첨가하여 멸균 처리한 후 항균활성을 본 결과 C. diphtheriae균(A)에서는 도라지 무발효물에서 균 배양 3시간 처리 시 시료를 첨가하지 않은 대조구에 비하여 균배양이 약간 더 촉진되는 듯 하였으나 그 이후배양시간이 길어짐에 따라 균의 생육이 저지되는 것을 볼 수 있었으며 배양 5시간째 L. plantarum균으로 발효시킨 도라지 추출물은 무발효도라지뿐만이 아니라 다른 젖산균으로 발효시킨 추출물보다 생육저지가 우수하여 유의적인차이를 보여주었다. 그러나 Leuc.
후속연구
- 또한, platycodin A가 발효 72시간 이후 96시간째 L. brevis균만 제외하고는 거의 증가한 경향이었는데 platycodin A는 platycodin D의 구조에서 C20과 C27번 탄소에 OH기 대신에 CH3기가 붙어있는 구조인데 젖산발효 때문에 platycodin D의 구조에서 일부 반응기가 methylation 되는 것이 아닌지 연구를 더 해볼 필요가 있을 것으로 검토된다.
- 또한, 최근 발효에 의한 기능성 증가에 관한 연구들이 활발히 이루어지고 있는바 도라지도 국균발효에 의하여 항비만 효과가 증가하였고(28), 젖산발효 한 도라지당액의 항산화 활성이 증가하였다(27)고 보고된 바 있지만 이러한 발효 때문에 도라지 사포닌의 조성 변화에 대한 보고는 없는 바이다. 이처럼 도라지도 인삼과 같이 함유한 사포닌 종류가 다양하며, 가공 및 발효 처리에 의하여 결합하고 있는 당 물질이 분해하는 정도에 따라 구성하고 있는 사포닌 물질이 달라지고 있으나 변환된 사포닌 물질 각각의 기능성 효과에 대한 연구는 도라지의 대표적 사포닌인 platycodin D 및 platycoside E의 기능성에 대한 연구발표만 있으므로 이에 대한 연구가 더 필요할 것으로 생각된다. 따라서 본 연구에서는 도라지에 각종 젖산균을 접종 배양해본 결과 젖산균의 종류에 따라 도라지 사포닌 조성의 변화를 볼 수 있었으며, 호흡기질환유발세균에 대한 항균력도 증가하는 것을 볼 수 있었기에 젖산발효에 의한 기능성이 증진된 제품개발에 기초자료로 제공하고자 하였다.
- 또 Choi 등(35)에 의하면 도라지의 주된 사포닌이 변환 때문에 생성된 platyconic acidB lactone, deapioplatyconic acid B lactone 그리고 deapioplatycodin D2가 인간의 종양세포 증식을 억제하는 효과가 있었다고 보고한 것 등을 고려하면 도라지 사포닌도 인삼사포닌과 마찬가지로 사포닌 구조의 변화로 기능성이 더 우수한 결과를 얻을 수 있을 것으로 생각된다. 이처럼 도라지사포닌은 본 연구에서 거두된 사포닌 9종 이외에도 더 있으므로 쉽게 판단할 수 있는 것은 아니고 또 젖산균 발효에 의하여 각각의 사포닌의 증감이 발생이 일어나는 것이므로 도라지 사포닌 구조상 배당체결합의 분해능과 분해 속도에 대한 검토가 더 필요할 것으로 생각된다. 그러나 총사포닌 함량은 젖산발효 96시간째 함량이 증가하였으므로 발효 시본 실험 조건과 같이 도라지 분말을 물을 첨가하여 발효할 경우는 적어도 발효를 96시간 정도 실시하는 것이 바람직할 것으로 생각된다.
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