[논문]HepG2 및 PC12 세포에서 혼합 한약재 발효물의 산화적 스트레스 억제 활성 평가

이윤정; 김난슬; 손명수; 김교남; 황용일; 박은주

doi:10.3746/jkfn.2016.45.7.1057

HepG2 및 PC12 세포에서 혼합 한약재 발효물의 산화적 스트레스 억제 활성 평가
Effect of Fermented Herbal Mixture against Oxidative Stress in HepG2 and PC12 Cells 원문보기

한국식품영양과학회지 = Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, v.45 no.7, 2016년, pp.1057 - 1064

이윤정 (경남대학교 식품영양학과) , 김난슬 (경남대학교 식품생명학과) , 손명수 (경남대학교 식품생명학과) , 김교남 (경남대학교 식품생명학과) , 황용일 (경남대학교 식품생명학과) , 박은주 (경남대학교 식품영양학과)

초록
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생체 내에서 발생하는 활성산소종(ROS)은 정상적인 상태에서 체내의 항산화 효소와 물질에 의해서 소거되지만, ROS가 과도하게 생성되면 산화적 스트레스를 유발한다. 천연물을 이용하여 이러한 ROS를 경감시켜 산화적 스트레스를 감소시키는 것은 만성 질병을 예방하고 각종 질병의 합병증을 예방할 수 있는 식이 전략의 하나이다. 본 연구에서는 국화, 영지, 가시오가피, 오미자, 지구자, 구기자, 그리고 산수유를 공통으로 한 혼합 한약재 발효액을 제조하였으며, 조성에 따라 하고초와 쇠비름이 추가된 FHM-A 및 석창포와 산해박이 추가된 FHM-B로 구분하였으며, 혼합 한약재 발효물을 활용하여 차 및 음료 개발에 있어 기초자료로 활용하고자 하였다. FHM-A 및 FHM-B의 총페놀 함량을 분석한 결과 FHM-B에서 유의적으로 높은 총페놀 함량이 나타났다. ORAC value는 FHM-A가 FHM-B보다 유의적으로 높은 활성을 나타냈고, ROS 생성 억제 활성은 FHM-A와 FHM-B 간에 차이가 나타나지 않았다. 간세포인 HepG2 세포에서 에탄올로 유도된 산화적 스트레스에 대한 발효액 FHM-A 및 FHM-B는 $10{\sim}100{\mu}g/mL$에서 모두 세포독성을 나타내지 않았으며, FHM-A와 FHM-B 모두 에탄올로 유도된 세포독성에 대한 보호 효과를 나타냈다. 또한, FHM-A와 FHM-B 모두 에탄올로 유도된 산화적 스트레스로 인해 증가한 지방축적을 억제하는 효과를 나타냈다. 신경세포인 PC12 세포에서 $H_2O_2$로 유도된 산화적 스트레스에 대한 발효액 FHM-A 및 FHM-B의 분석 결과 $1{\sim}50{\mu}g/mL$에서 FHM-A와 FHM-B 모두 세포독성을 나타내지 않았으며, FHM-A와 FHM-B 모두 농도 의존적으로 $H_2O_2$로 유도된 세포독성에 대한 보호효과를 나타냈다. FHM-B는 항산화제로 잘 알려진 비타민 C와 같은 수준의 높은 세포보호 효과를 확인하였다. 이상의 연구 결과는 발효액 FHM-A와 FHM-B가 간 기능 및 신경 스트레스와 관련된 질병 예방을 위한 식품개발에 있어 기초 자료로 활용될 수 있음을 보여준다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study was carried out to investigate the effect of fermented herbal mixtures (FHMs) in HepG2 and PC12 cells. Two different types of fermented herbal mixtures consisted of Chrysanthemum morifolium, Ganoderma lucidum, Acanthopanax senticosus, Schisandra chinensis, Hovenia dulcis thumb, and Lycii fructus. FHM-A and FHM-B were separately fermented with Prunellae Spica, Portulaca oleracea (FHM-A) and Acorus gramineus, Pycnostelma paniculatum (FHM-B). Total phenolic content of FHM-B was higher than that of FHM-A. ORAC values in both FHM-A and FHM-B increased in a dose-dependent manner, and antioxidant activities against peroxyl radicals were higher in FHM-A than FHM-B. Both FHM-A and FHM-B effectively ameliorated AAPH- and ethanol-induced oxidative stress in HepG2 cells. They also suppressed lipid formation induced by ethanol treatment. In addition, FHM-A and FHM-B prevented $H_2O_2$-induced PC12 cell death. FHM-B showed a relatively stronger protective effect than that of FMB-A. Taken together, these findings show that a fermented herbal mixture could be used in healthy and functional food design for oxidative stress-related diseases.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

24시간 동안 침지시킨 한약재를 증류수로 세척한 후 Table 1과 같이 FHM-A와 FHM-B는 국화, 영지, 가시오가피, 오미자, 지구자, 구기자, 그리고 산수유를 공통으로 포함하였으며, FHM-A는 ursolic acid 등의 생리활성 성분으로 간세포 보호 활성 등의 활성이 보고된 하고초와 쇠비름을 추가로 첨가하였다(12). FHM-B에는 신경세포 보호 활성과 관련하여 항치매 활성이 보고된 석창포와 산해박을 추가로 첨가하여 혼합 한약재 발효물의 차 및 음료 개발에 있어 각 그룹의 특성을 달리하여 평가하고자 하였다(13). 각각의 혼합 한약재 중량에 50%(w/v)의 살균수를 가하여 섞고 1.
유럽식품안전청 EFSA (European Food Safety Authority)와 미국 농무성 USDA(United States Department of Agriculture)에서 대표적인 항산화 지표로 ORAC value를 제시하고 있으며, 현재 AAPH를 peroxyl radical generator로 사용하는 ORAC_ROO･ 방법이 가장 널리 사용되고 있다. Peroxyl radical의 생성은 특히 지방 산화를 촉진하는 ROS로 잘 알려져 FHM-A와 FHM-B의 peroxyl radical 소거 활성을 ORAC 분석법을 통해 알아보고자 하였다. 그 결과 혼합 한약재 발효물 FHM-A 및 FHM-B는 10~500 μg/mL의 범위에서 모두 농도 의존적인 peroxyl radical 소거 활성을 나타냈다(Fig.
이미 보고된 다수의 연구에 따르면 천연물을 비롯한 한약재의 항산화 활성은 총페놀 화합물의 함량과 높은 상관관계를 보였다(17). 따라서 본 연구에서는 혼합 한약재 발효물 FHM-A와 FHM-B의 총페놀 함량을 알아보기 위하여 Folin-Ciocalteu 실험법을 통하여 분석하였다. 그 결과 FHM-A의 총페놀 함량은 962.
따라서 본 연구에서는 항산화 활성이 보고된 국화, 영지, 가시오가피, 오미자, 지구자, 구기자, 산수유에 하고초와 쇠비름 그리고 석창포와 산해박을 각각 혼합하여 한약재 발효물을 제조하고 이들 두 가지 혼합 한약재 발효물의 총페놀 함량, 산화적 스트레스 억제 활성, 신경세포 보호 활성 등의 생리활성을 HepG2 및 PC12 세포모델에서 평가하였다. 또한, 본 연구를 통해 차 및 음료의 개발에 있어 혼합 한약재 발효물의 이용 가능성을 고찰하고자 하였다.
천연물을 이용하여 이러한 ROS를 경감시켜 산화적 스트레스를 감소시키는 것은 만성 질병을 예방하고 각종 질병의 합병증을 예방할 수 있는 식이 전략의 하나이다. 본 연구에서는 국화, 영지, 가시오가피, 오미자, 지구자, 구기자, 그리고 산수유를 공통으로 한 혼합 한약재 발효액을 제조하였으며, 조성에 따라 하고초와 쇠비름이 추가된 FHM-A 및 석창포와 산해박이 추가된 FHM-B로 구분하였으며, 혼합 한약재 발효물을 활용하여 차 및 음료 개발에 있어 기초자료로 활용하고자 하였다. FHM-A 및 FHM-B의 총페놀 함량을 분석한 결과 FHM-B에서 유의적으로 높은 총페놀 함량이 나타났다.
이전 연구에서는 호두 추출물이 amyloid β에 의해 유도된 세포사멸 및 산화적 스트레스로부터 보호 효과를 나타내었고, tert-butyl hydroperoxide(tBHP)에 의해 산화적 스트레스가 유도된 PC12 신경세포에서 당귀 추출물이 ROS의 억제를 통해 항산화 활성 및 세포 보호 효과를 나타내었다고 보고하였다(27,28). 이는 H₂O₂에 의해 유도된 산화적 스트레스를 가지는 PC12 신경세포에서 FHM-A 및 FHM-B 발효물이 항산화적 세포보호 효과를 통한 퇴행성 신경질환 예방을 위한 식품소재로서의 사용 가능성을 제시한다.

제안 방법

1, 10, 그리고 50 μg/mL의 FHM-A 및 FHM-B 발효물을 처리한 후 추가로 1 mM H2O2를 2시간 처리하여 산화적 스트레스를 유도하였을 때 혼합 한약재 발효물의 억제 활성을 평가하였다(Fig. 5B).
10, 50, 그리고 100 μg/mL의 FHM-A와 FHM-B를 HepG2 세포에 처리한 후 100 mM 에탄올을 24시간 처리하여 지방축적을 유도하였다.
1%(v/v) 생리식염수에 24시간 동안 침지시켰다. 24시간 동안 침지시킨 한약재를 증류수로 세척한 후 Table 1과 같이 FHM-A와 FHM-B는 국화, 영지, 가시오가피, 오미자, 지구자, 구기자, 그리고 산수유를 공통으로 포함하였으며, FHM-A는 ursolic acid 등의 생리활성 성분으로 간세포 보호 활성 등의 활성이 보고된 하고초와 쇠비름을 추가로 첨가하였다(12). FHM-B에는 신경세포 보호 활성과 관련하여 항치매 활성이 보고된 석창포와 산해박을 추가로 첨가하여 혼합 한약재 발효물의 차 및 음료 개발에 있어 각 그룹의 특성을 달리하여 평가하고자 하였다(13).
75 mM potassium phosphate buffer(pH 7.4)에 녹인 100 μL의 40 nM fluorescein을 plate에 넣은 뒤 동일한 buffer에 녹인 10, 50, 100 그리고 500 μg/mL 농도의 시료를 준비하였다.
FHM-A 및 FHM-B 발효물이 세포 생존율에 미치는 영향을 측정하고자 PC12 신경세포에서 MTT assay를 실시하였다. 실험의 비교군으로는 항산화제로 잘 알려진 비타민 C를 사용하였다.
HepG2 세포의 염색된 지방구는 4% Nonidet^TM P 40으로 5분간 용해하고 microplate reader(Bio-Tek)를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하여 지방축적 정도를 정량 분석하였다. FHM-A와 FHM-B를 처리하지 않은 HepG2 세포를 대조군으로 하여 lipid accumulation(% of control)을 계산하였다.
HepG2 세포를 96-well plate에 1×105 cells/well이 되도록 100 μL씩 분주하여 37°C, 5% CO2 환경에서 24시간 동안 전배양하여 세포를 부착시킨 후, 10, 50, 그리고 100 μg/mL의 FHM-A와 FHM-B를 농도별로 처리하여 30분간 배양하였다.
6%(w/v) Oil Red O 시약으로 15분간 염색하고, 70% 에탄올과 증류수로 각각 1회씩 세척하였다. HepG2 세포의 염색된 지방구는 4% Nonidet^TM P 40으로 5분간 용해하고 microplate reader(Bio-Tek)를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하여 지방축적 정도를 정량 분석하였다. FHM-A와 FHM-B를 처리하지 않은 HepG2 세포를 대조군으로 하여 lipid accumulation(% of control)을 계산하였다.
PC12 신경세포를 96-well plate에 5×104 cells/mL의 농도로 100 mL씩 분주하여 24시간 동안 37°C, 5% CO2 incubator에서 배양한 후 FHM-A와 FHM-B를 1, 10, 그리고 50 μg/mL의 농도로 30분간 처리하였고, 이후 1 mM의 H2O2를 처리하여 PC12의 세포사멸을 유도하였다.
4)으로 세척하고 10%(v/v) formalin으로 1시간 동안 고정했다. 고정된 HepG2 세포를 0.6%(w/v) Oil Red O 시약으로 15분간 염색하고, 70% 에탄올과 증류수로 각각 1회씩 세척하였다. HepG2 세포의 염색된 지방구는 4% Nonidet^TM P 40으로 5분간 용해하고 microplate reader(Bio-Tek)를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하여 지방축적 정도를 정량 분석하였다.
FHM-A와 FHM-B 처리 후 HBSS로 1회 세척하고, HBSS 200 μL에 peroxyl radical 생성을 위해 80 mM AAPH를 가하여 30분 동안 배양하였다. 그 후 40 mM DCFH-DA를 가하여 빛이 통하지 않는 조건에서 30분 동안 반응시킨 후 GENios fluorescence plate reader(Tecan Trading AG)를 이용하여 excitation wavelength 485 nm, emission wavelength 535 nm에서 형광의 강도를 측정하였다. 대조군의 형광값을 100%로 하여 혼합 한약재 발효물 FHM-A와 FHM-B 처리군의 상대적인 형광 강도를 비교하여 HepG2 세포에서 혼합 한약재 발효물의 산화적 스트레스 억제 활성을 평가하였다.
그 후 형광에 안정한 HBSS(Hank's balanced salt solution)를 각 well에 200 μL씩 분주한 후 최종 농도가 100 μg/mL가 되도록 FHM-A와 FHM-B 시료를 30분 동안 처리하였다.
이후 세포 내 형성된 formazan은 100 μL의 DMSO를 이용해 용해하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군 세포를 100%로 하였을 때 상대적인 세포 성장 억제율을 구하였다.
이후 배양액을 모두 제거하고 100 μL dimethyl sulfoxide(DMSO)를 첨가한 후 실온에서 15분간 정치하여 formazan crystal을 용해한 뒤 ELISA microplate reader(Tecan Trading AG)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군의 세포수를 100%로 하였을 때 상대적인 세포 생존율을 계산하여 FHM-A와 FHM-B의 세포독성을 평가하였다.
그 후 40 mM DCFH-DA를 가하여 빛이 통하지 않는 조건에서 30분 동안 반응시킨 후 GENios fluorescence plate reader(Tecan Trading AG)를 이용하여 excitation wavelength 485 nm, emission wavelength 535 nm에서 형광의 강도를 측정하였다. 대조군의 형광값을 100%로 하여 혼합 한약재 발효물 FHM-A와 FHM-B 처리군의 상대적인 형광 강도를 비교하여 HepG2 세포에서 혼합 한약재 발효물의 산화적 스트레스 억제 활성을 평가하였다.
따라서 본 연구에서는 세포 생존율 결과를 바탕으로 FHM-A 및 FHM-B 발효물의 농도를 100 μg/mL 이하로 이후 실험에 적용하였다.
따라서 본 연구에서는 항산화 활성이 보고된 국화, 영지, 가시오가피, 오미자, 지구자, 구기자, 산수유에 하고초와 쇠비름 그리고 석창포와 산해박을 각각 혼합하여 한약재 발효물을 제조하고 이들 두 가지 혼합 한약재 발효물의 총페놀 함량, 산화적 스트레스 억제 활성, 신경세포 보호 활성 등의 생리활성을 HepG2 및 PC12 세포모델에서 평가하였다. 또한, 본 연구를 통해 차 및 음료의 개발에 있어 혼합 한약재 발효물의 이용 가능성을 고찰하고자 하였다.
발효액 FHM-A 및 FHM-B 발효물을 농도별로 10, 50, 그리고 100 μg/mL로 30분간 처리한 후 100 mM의 에탄올을 24시간 처리하여 산화적 스트레스를 유도하고 발효액 FHM-A 및 FHM-B 발효물 처리가 HepG2 간세포의 생존에 미치는 영향을 분석하였다.
이에 HepG2 세포에 FHM-A 및 FHM-B 발효액을 10, 50, 그리고 100 μg/mL의 농도로 30분간 처리한 후 100 mM 에탄올을 24시간 처리하여 산화적 스트레스를 유도한 다음 HepG2 세포의 지방축적에 FHM-A 및 FHM-B 발효물이 미치는 영향을 분석하였다.
발생한 형광은 형광현미경 및 형광분석기를 통해 DCF의 형광강도 측정으로 항산화 활성의 정성 및 정량 분석이 가능하다. 인간유래 HepG2 세포에서 AAPH에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 FHM-A와 FHM-B 한약재 발효물의 산화적 스트레스 억제 활성을 평가하였다. HepG2 세포에 FHM-A와 FHM-B 발효물을 각각 처리하고 AAPH로 유도된 산화적 스트레스에 대한 ROS 생성 억제 효능을 측정한 결과 모두 5, 10, 50, 그리고 100 μg/mL의 FHM-A 및 FHM-B 발효물 처리는 농도 의존적으로 AAPH로 유도된 산화적 스트레스를 억제하였으며, 50 그리고 100 μg/mL의 FHM-A 및 FHM-B 발효물 처리에서 유의적으로 높은 억제 활성을 나타냈다(Fig.
혼합 한약재 발효물 FHM-A와 FHM-B의 세포독성을 평가하고자 HepG2 세포에서 MTT assay를 실시하였다. HepG2 세포를 96-well plate에 1×10⁵ cells/well이 되도록 100 μL씩 분주하여 37°C, 5% CO₂환경에서 24시간 동안 전배양하여 세포를 부착시킨 후, 10, 50, 그리고 100 μg/mL의 FHM-A와 FHM-B를 농도별로 처리하여 30분간 배양하였다.

대상 데이터

50μL의 FHM-A와 FHM-B 혼합 한약재 발효물 시료를 plate에 넣은 뒤 바로 peroxyl radical을 생성하는 50 μL의 20 mM AAPH를 넣어 혼합해주었다. AAPH와 대조군으로 사용된 수용성 비타민 E 유도체인 Trolox는 매 실험에서 새로 만들어 사용하였다. 형광분석기는 측정 전 reaction mixture가 담긴 96-well plate를 10초 동안 shaking 한 후 5초 동안 안정화하도록 설정하였다.
Fluorescein 및 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid(Trolox), cupric sulfate, hydrogen peroxide, potassium phosphate, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT), Folin-Ciocalteu, 그리고 gallic acid는 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)로부터, acetic acid 및 acetone, sodium hydroxide은 Junsei Chemical사(Tokyo, Japan)로부터 구입하였으며 2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride(AAPH)는 Wako Pure Chemical(Osaka, Japan)로부터 구입하여 사용하였다.
HepG2 세포는 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin을 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 배지를 이용하여 37°C, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
Peroxy radical의 소거 활성은 Kurihara 등(15)의 방법을 일부 변형한 ORAC 분석법을 이용하여 평가하였다. ORAC 분석에는 well 간의 fluorescein 형광의 간섭을 최소화하기 위하여 96-well black microplate를 사용하였다. 75 mM potassium phosphate buffer(pH 7.
따라서 PC12 신경세포 생존율의 결과를 바탕으로 이후 실험에서는 50 μg/mL 이하의 FHM-A, FHM-B 발효물, 그리고 비타민 C를 사용하였다.
본 실험에 사용된 국화, 영지, 가시오가피, 오미자, 지구자, 구기자, 산수유, 하고초, 쇠비름, 석창포, 산해박은 강원약초(Wonju, Korea)에서 구입하여 사용하였다. Fluorescein 및 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid(Trolox), cupric sulfate, hydrogen peroxide, potassium phosphate, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT), Folin-Ciocalteu, 그리고 gallic acid는 Sigma-Aldrich사(St.
본 실험에 사용한 한약재는 이물질을 제거하고 수세한 후 0.1%(v/v) 생리식염수에 24시간 동안 침지시켰다. 24시간 동안 침지시킨 한약재를 증류수로 세척한 후 Table 1과 같이 FHM-A와 FHM-B는 국화, 영지, 가시오가피, 오미자, 지구자, 구기자, 그리고 산수유를 공통으로 포함하였으며, FHM-A는 ursolic acid 등의 생리활성 성분으로 간세포 보호 활성 등의 활성이 보고된 하고초와 쇠비름을 추가로 첨가하였다(12).
PC12 신경세포를 96-well plate에 5×10⁴ cells/mL의 농도로 100 mL씩 분주하여 24시간 동안 37°C, 5% CO₂ incubator에서 배양한 후 FHM-A와 FHM-B를 1, 10, 그리고 50 μg/mL의 농도로 30분간 처리하였고, 이후 1 mM의 H₂O₂를 처리하여 PC12의 세포사멸을 유도하였다. 수용성 항산화제로 잘 알려진 비타민 C(ascorbic acid)를 대조군으로 사용하였다. MTT 시약을 처리하여 formazan 형성을 확인한 후 배지를 완전히 제거하였다.
FHM-A 및 FHM-B 발효물이 세포 생존율에 미치는 영향을 측정하고자 PC12 신경세포에서 MTT assay를 실시하였다. 실험의 비교군으로는 항산화제로 잘 알려진 비타민 C를 사용하였다. FHM-A, FHM-B 발효물, 그리고 비타민 C를 1, 10, 그리고 50 μg/mL의 농도별로 30분간 처리하였을 때 모든 처리군에서 세포독성은 발견되지 않았다(Fig.

데이터처리

각 시료군에 대한 유의성 검정은 신뢰 수준 95%(P<0.05)에서 Student's t-test 또는 oneway 분산분석(ANOVA)을 시행하여 F값을 구하고 Duncan's multiple range test를 실시하였다.
모든 데이터의 통계처리는 각 항목에 따라 SPSS for Windows를 이용하여 분석하였고 각각의 시료에 대해 평균과 표준편차로 나타내었다. 각 시료군에 대한 유의성 검정은 신뢰 수준 95%(P<0.
최종 결과는 측정 시료의 형광값과 blank의 형광값 간의 넓이 차이로 계산하였으며, 모든 결과는 Trolox 당량(TE, Trolox equivalents, μM)으로 환산하여 나타내었다.

이론/모형

HepG2 세포에서 FHM-A 및 FHM-B의 세포독성은 MTT 실험법을 통해 평가하였다. FHM-A와 FHM-B 한약재 발효물을 10, 50, 그리고 100 μg/mL의 농도별로 30분간 처리한 결과 대조군(NC)과 비교하였을 때 유의적으로 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다(Fig.
HepG2 세포에서 혼합 한약재 발효물 FHM-A와 FHM-B의 산화적 스트레스 억제 활성은 DCFH-DA 분석법을 이용하여 분석하였다(16). HepG2 세포는 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin을 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 배지를 이용하여 37°C, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다.
Peroxy radical의 소거 활성은 Kurihara 등(15)의 방법을 일부 변형한 ORAC 분석법을 이용하여 평가하였다. ORAC 분석에는 well 간의 fluorescein 형광의 간섭을 최소화하기 위하여 96-well black microplate를 사용하였다.
총페놀 함량은 널리 사용되고 있는 Folins-Denis 분석법을 이용하여 측정하였다(14). 혼합 한약재 발효물(FHM-A, FHM-B)을 1 mL 취하여 증류수 1 mL를 가하여 희석하고 1 N Folin-Ciocalteu 시약 2 mL를 가하여 실온에서 3분간 반응시키며, 10%(w/v) Na₂CO₃ 용액 2 mL를 가하여 혼합액을 1시간 동안 상온에서 추가로 반응시켰다.
혼합 한약재 발효물의 PC12 신경세포 보호 활성을 평가하기 위하여 MTT assay를 실시하였다. PC12 신경세포를 96-well plate에 5×10⁴ cells/mL의 농도로 100 mL씩 분주하여 24시간 동안 37°C, 5% CO₂ incubator에서 배양한 후 FHM-A와 FHM-B를 1, 10, 그리고 50 μg/mL의 농도로 30분간 처리하였고, 이후 1 mM의 H₂O₂를 처리하여 PC12의 세포사멸을 유도하였다.

성능/효과

5B). 1 mM의 H₂O₂ 처리로 PC12 세포의 생존율은 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군(NC) 대비 73.8% 감소하였으며, FHM-A 및 FHM -B 처리군에서는 모두 농도 의존적인 PC12 세포보호 효과를 나타냈다. 1 mM의 H₂O₂만 처리한 양성 대조군 대비(PC) 50 μg/mL의 FHM-A는 51.
1 mM의 H2O2만 처리한 양성 대조군 대비(PC) 50 μg/mL의 FHM-A는 51.1%, 50 μg/mL의 FHM-B는 128.5%의 H2O2로 유도된 산화적 손상을 억제하였다.
발효액 FHM-A 및 FHM-B 발효물을 농도별로 10, 50, 그리고 100 μg/mL로 30분간 처리한 후 100 mM의 에탄올을 24시간 처리하여 산화적 스트레스를 유도하고 발효액 FHM-A 및 FHM-B 발효물 처리가 HepG2 간세포의 생존에 미치는 영향을 분석하였다. 100 mM 에탄올 처리로 대조군보다 세포 생존율이 30.1% 감소하였으며, FHM-A와 FHM-B 발효물 처리로 세포 생존율이 각각 11.5~17.5%, 11.5~13.2% 증가하였다(Fig. 3). 그러므로 FHM-A 및 FHM-B 발효물이 에탄올로 유도된 산화적 손상을 효과적으로 감소시킨다는 것을 보여준다.
본 연구에서는 국화, 영지, 가시오가피, 오미자, 지구자, 구기자, 그리고 산수유를 공통으로 한 혼합 한약재 발효액을 제조하였으며, 조성에 따라 하고초와 쇠비름이 추가된 FHM-A 및 석창포와 산해박이 추가된 FHM-B로 구분하였으며, 혼합 한약재 발효물을 활용하여 차 및 음료 개발에 있어 기초자료로 활용하고자 하였다. FHM-A 및 FHM-B의 총페놀 함량을 분석한 결과 FHM-B에서 유의적으로 높은 총페놀 함량이 나타났다. ORAC value는 FHM-A가 FHM-B보다 유의적으로 높은 활성을 나타냈고, ROS 생성 억제 활성은 FHM-A와 FHM-B 간에 차이가 나타나지 않았다.
신경세포인 PC12 세포에서 H₂O₂로 유도된 산화적 스트레스에 대한 발효액 FHM-A 및 FHM-B의 분석 결과 1~50 μg/mL에서 FHM-A와 FHM-B 모두 세포독성을 나타내지 않았으며, FHM-A와 FHM-B 모두 농도 의존적으로 H₂O₂로 유도된 세포독성에 대한 보호 효과를 나타냈다. FHM-B는 항산화제로 잘 알려진 비타민 C와 같은 수준의 높은 세포보호 효과를 확인하였다. 이상의 연구 결과는 발효액 FHM-A와 FHM-B가 간 기능 및 신경 스트레스와 관련된 질병 예방을 위한 식품개발에 있어 기초 자료로 활용될 수 있음을 보여준다.
최종 반응액에서 200 μL를 취하여 분광광도계(UV-1601, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid를 표준물질로 사용하여 검량선을 작성하고, 총페놀 함량은 mg/100g gallic acid equivalents(GAE)로 결과를 나타냈다.
HepG2 세포에 FHM-A와 FHM-B 발효물을 각각 처리하고 AAPH로 유도된 산화적 스트레스에 대한 ROS 생성 억제 효능을 측정한 결과 모두 5, 10, 50, 그리고 100 μg/mL의 FHM-A 및 FHM-B 발효물 처리는 농도 의존적으로 AAPH로 유도된 산화적 스트레스를 억제하였으며, 50 그리고 100 μg/mL의 FHM-A 및 FHM-B 발효물 처리에서 유의적으로 높은 억제 활성을 나타냈다(Fig. 2B).
FHM-A 및 FHM-B의 총페놀 함량을 분석한 결과 FHM-B에서 유의적으로 높은 총페놀 함량이 나타났다. ORAC value는 FHM-A가 FHM-B보다 유의적으로 높은 활성을 나타냈고, ROS 생성 억제 활성은 FHM-A와 FHM-B 간에 차이가 나타나지 않았다. 간세포인 HepG2 세포에서 에탄올로 유도된 산화적 스트레스에 대한 발효액 FHM-A 및 FHM-B는 10~100 μg/mL에서 모두 세포독성을 나타내지 않았으며, FHM-A와 FHM-B 모두 에탄올로 유도된 세포독성에 대한 보호 효과를 나타냈다.
간세포인 HepG2 세포에서 에탄올로 유도된 산화적 스트레스에 대한 발효액 FHM-A 및 FHM-B는 10~100 μg/mL에서 모두 세포독성을 나타내지 않았으며, FHM-A와 FHM-B 모두 에탄올로 유도된 세포독성에 대한 보호 효과를 나타냈다.
그 결과 FHM-A의 총페놀 함량은 962.76±1.97 μg/mL(GAE), FHM-B는 1,473.46±6.77 μg/mL(GAE)로 FHM-B가 약 1.53배 유의적으로(P<0.001) 높은 총페놀 함량을 나타냈다(Table 2).
그 결과 혼합 한약재 발효물 FHM-A 및 FHM-B는 10~500 μg/mL의 범위에서 모두 농도 의존적인 peroxyl radical 소거 활성을 나타냈다(Fig. 1).
이는 높은 페놀 함량을 통해 세포 내 AAPH에 의해 유도된 산화적 스트레스의 개선에 기여할 것으로 생각한다. 따라서 본 결과는 FHM-A 및 FHM-B 발효물 처리가 세포내 지질과산화를 효과적으로 억제할 수 있음을 보여주는 결과라 할 수 있다.
ORAC_ROO･ 분석법은 시료의 수소이온 전이 활성에 기반을 둔 항산화 분석법으로 AAPH에 의해 생성된 peroxyl radical은 항산화 활성을 지닌 시료(AH)의 수소이온 전이로 안정화된다(1st reaction: ROO･+AH → ROOH+ A･; 2nd reaction: ROO･+A･ → ROOA). 따라서 본 결과를 통해 FHM-A 및 FHM-B 발효물이 수소이온의 전이 활성을 기반으로 peroxyl radical 소거 활성을 증가시키는 것으로 나타났으며, FHM-A에 있는 하고초와 쇠비름이 FHM-B의 석창포와 산해박보다 높은 수소이온 전이 활성을 지닌 것으로 생각된다.
간세포인 HepG2 세포에서 에탄올로 유도된 산화적 스트레스에 대한 발효액 FHM-A 및 FHM-B는 10~100 μg/mL에서 모두 세포독성을 나타내지 않았으며, FHM-A와 FHM-B 모두 에탄올로 유도된 세포독성에 대한 보호 효과를 나타냈다. 또한, FHM-A와 FHM-B 모두 에탄올로 유도된 산화적 스트레스로 인해 증가한 지방축적을 억제하는 효과를 나타냈다. 신경세포인 PC12 세포에서 H₂O₂로 유도된 산화적 스트레스에 대한 발효액 FHM-A 및 FHM-B의 분석 결과 1~50 μg/mL에서 FHM-A와 FHM-B 모두 세포독성을 나타내지 않았으며, FHM-A와 FHM-B 모두 농도 의존적으로 H₂O₂로 유도된 세포독성에 대한 보호 효과를 나타냈다.
본 실험 결과를 바탕으로 환산하였을 때 13.36 μg/mL의 FHM-A와 22.82 μg/mL의 FHM-B가 대조군으로 사용된 수용성 비타민 E 유도체인 1 μM의 Trolox와 유사한 활성을 나타냈다(데이터 미제시).
신경세포인 PC12 세포에서 H2O2로 유도된 산화적 스트레스에 대한 발효액 FHM-A 및 FHM-B의 분석 결과 1~50 μg/mL에서 FHM-A와 FHM-B 모두 세포독성을 나타내지 않았으며, FHM-A와 FHM-B 모두 농도 의존적으로 H2O2로 유도된 세포독성에 대한 보호 효과를 나타냈다.
이에 HepG2 세포에 FHM-A 및 FHM-B 발효액을 10, 50, 그리고 100 μg/mL의 농도로 30분간 처리한 후 100 mM 에탄올을 24시간 처리하여 산화적 스트레스를 유도한 다음 HepG2 세포의 지방축적에 FHM-A 및 FHM-B 발효물이 미치는 영향을 분석하였다. 에탄올 처리군에서 대조군보다 유의적으로 지방 함량이 증가하였으며(8%), FHM-A와 FHM-B 모두 에탄올에 의한 지방축적을 17.1~19.6% 억제하였다(Fig. 4). 그러나 FHM-A와 FHM-B 발효물의 농도별 처리는 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
특히 100 μg/mL의 FHM-A는 대조군 대비 61.3%의 산화적 스트레스를 억제하였으며, FHM-B는 68.35%의 산화적 스트레스를 억제한 것으로 나타났다.

후속연구

이는 간세포 내 지방축적이 AMPK의 활성을 통해 조절될 수 있다는 것을 의미하며, 추가로 FHM-A와 FHM-B 발효물 처리를 통한 HepG2 세포 내에서 분자학적 작용기전이 필요하다. 따라서 본 실험 결과는 FHM-A와 FHM-B 발효물이 알코올성 지방간을 예방할 수 있는 식품소재로 충분히 활용될 수 있음을 보여준다.
이전 연구를 통해 국화(Chrysanthenum morifolium), 영지(Ganoderma lucidum), 가시오가피(Acanthopanax senticosus), 오미자(Schisandra chinensis), 지구자(Hovenia dulcis Thumb), 구기자(Lycii fructus), 산수유(Corni fructus), 하고초(Prunellae Spica), 쇠비름(Portulaca oleracea), 석창포(Acorus gramineus), 그리고 산해박(Pycnostelma paniculatum) 각각의 항산화 활성에 대한 가능성이 보고된 바 있지만(10,11), 이들의 혼합 발효에 대한 항산화 활성 및 산화적 스트레스 억제 활성에 관한 연구는 미비한 실정이다. 또한, 복합소재로의 활용 가능성을 평가하기 위해 한약재의 조합에 따른 생리활성 평가 및 기초자료 마련이 요구된다.
FHM-B는 항산화제로 잘 알려진 비타민 C와 같은 수준의 높은 세포보호 효과를 확인하였다. 이상의 연구 결과는 발효액 FHM-A와 FHM-B가 간 기능 및 신경 스트레스와 관련된 질병 예방을 위한 식품개발에 있어 기초 자료로 활용될 수 있음을 보여준다.
이전의 연구에서 석창포, 산해박, 하고초, 쇠비름의 페놀 화합물 조성에 대한 연구는 찾아볼 수 없었으며, 본 결과를 통해 석창포와 산해박이 하고초와 쇠비름에 비해 높은 페놀 함량을 가지고 있음을 유추할 수 있다. 추후 연구를 통해 FHM-A와 FHM-B의 총페놀 물질의 조성 및 주요 생리활성물질에 대한 규명이 필요할 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	활성산소종이 다량으로 발생하여 체내 항산화 방어 체계의 균형이 깨지면 어떤 질병들이 발생하기 쉬운가?	활성산소종은 호기성 대사 동물에서 생명유지에 필수불가결한 요소이지만 대사 과정에서 과량으로 발생한 활성산소종은 에너지를 받아들여 unpaired electron의 회전방향이 변하여 singlet oxygen(1 O2)이 되거나 전자를 받아들여 수퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical, ･O2- ), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical, ･OH), 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2), alkoxy radical(RO･), peroxyl radical(ROO･) 등과 같은 반응성이 강한 라디칼을 형성하고 산화적 스트레스를 유발하여 세포 구성성분인 지질, 단백질, 핵산, 당, 그리고 DNA 등의 손상을 유발하며 세포의 정상적인 대사를 저해한다. 이들 활성산소종이 다량으로 발생하여 체내 항산화 방어 체계의 균형이 깨지면 노화, 동맥경화, 그리고 암 등의 다양한 만성질환 발병과 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되어 왔다(1-3).
	대사 과정에서 과량으로 발생한 활성산소종은 에너지나 전자를 받아들여 어떤 형태로 되는가?	생체 내 대사과정에서 호기적 대사의 부산물로써 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 자연적으로 발생한다. 활성산소종은 호기성 대사 동물에서 생명유지에 필수불가결한 요소이지만 대사 과정에서 과량으로 발생한 활성산소종은 에너지를 받아들여 unpaired electron의 회전방향이 변하여 singlet oxygen(1 O2)이 되거나 전자를 받아들여 수퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical, ･O2- ), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical, ･OH), 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2), alkoxy radical(RO･), peroxyl radical(ROO･) 등과 같은 반응성이 강한 라디칼을 형성하고 산화적 스트레스를 유발하여 세포 구성성분인 지질, 단백질, 핵산, 당, 그리고 DNA 등의 손상을 유발하며 세포의 정상적인 대사를 저해한다. 이들 활성산소종이 다량으로 발생하여 체내 항산화 방어 체계의 균형이 깨지면 노화, 동맥경화, 그리고 암 등의 다양한 만성질환 발병과 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되어 왔다(1-3).
	생체계의 항산화 시스템 3가지는 무엇인가?	생체계의 항산화 시스템은 크게 3가지로 구분된다. 첫째는 catalase, glutathione peroxidase(Gpx), phospholipid hydroperoxide, peroxidase, superoxide dismutase(SOD) 그리고 glutathione-S-transferase 등 프리라디칼 생성의 억제 시스템이 있으며, 둘째는 비타민 C, 비타민 E, uric acid, bilirubin, flavonoids 등을 통해 생성된 프리라디칼의 소거 시스템 그리고 마지막으로 DNA repair enzymes, transferase 등의 복원(repair) 시스템이다(4). 일반적인 생체계는 프리라디칼의 생성과 소거가 균형 있게 이뤄지지만, 과도 하게 프리라디칼이 생성되었을 경우 생체의 기능과 활성을 잃게 하여 조직의 손상 및 세포사멸을 유도한다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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