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문제 정의
- 따라서 본 논문에서는 개인용 PC 환경에서도 이미지 분석이 가능한 소프트웨어를 개발하여 장비 독점 문제를 해결하고 고가의 HCS 소프트웨어의 대체 가능성을 확인하고자 한다. 상용화 소프트웨어인 LabWindows CVI 툴에 Open Source를 적용하여 HCS 소프트웨어의 구현이 가능하다는 것을 보여주는 것이 본 연구의 목적이다.
- 본 연구에서는 공초점 레이저 현미경으로부터 획득한 세포 이미지를 분석하기 위해 세 가지 모듈을 탑재한 소프트웨어를 구현하였다. 현미경으로 촬영된 원본 이미지는 전처리 과정을 거쳐 영상의 질을 개선시켰으며, 이후 개선된 체인코드 알고리즘을 적용하여 각 세포의 크기와 밝기, 위치정보 그리고 세포 개수 정보를 획득하였다.
- 따라서 본 논문에서는 개인용 PC 환경에서도 이미지 분석이 가능한 소프트웨어를 개발하여 장비 독점 문제를 해결하고 고가의 HCS 소프트웨어의 대체 가능성을 확인하고자 한다. 상용화 소프트웨어인 LabWindows CVI 툴에 Open Source를 적용하여 HCS 소프트웨어의 구현이 가능하다는 것을 보여주는 것이 본 연구의 목적이다. 소프트웨어는 공초점 레이저 현미경으로 촬영된 세포 이미지의 특징 정보를 자동으로 추출하여 세 가지 모듈인 Cell Cycle, Cell Counting, Mitotic Index 기능을 구현하였다.
- 3-3 블록은 잡음이 제거된 그레이 영상을 이진 영상으로 변환하는 Binarization 과정에 해당한다. 영상 이진화 과정에서 단일 임계값을 사용할 경우 영상 내의 많은 정보를 손실할 수 있으므로 본 연구에서는 주변 화소들의 정보를 이용해 적응적으로 임계값을 결정하는 Niblack 이진화를 수행하였다[11]. 이진화 된 결과는 Fig.
제안 방법
- 공초점 레이저 현미경으로부터 얻은 이미지는 본 연구에서 제안한 영상 전처리, 세포의 특징 정보 추출 방법을 거쳐 세 가지의 모듈을 구현하였다. 다음 Fig.
- 또한 개선된 체인코드를 적용한 알고리즘이 기존의 프리만 체인코드 알고리즘에 비해 연산 량이 적고 수행 속도가 더 빠르게 나타났음을 확인하였다. 따라서 본 논문에서 사용하는 MKN-28세포 이미지에 프리만 체인코드와, 개선된 체인코드 알고리즘을 적용해 보았다. 두 알고리즘의 연산량 비교 결과 기존의 프리만 체인코드의 이웃 픽셀 탐색 횟수는 25,833번이며, 속도는 25초인 반면, 개선된 체인코드를 사용한 결과 탐색 횟수가 13,584번, 속도가 21초로 프리만 체인코드에 비해 연산 량과 소요시간이 적음을 확인하였다.
- 연구자들은 형광 이미지에서 세포의 형광 강도가 높을수록, 세포 주기가 간기에서 분열기 단계로 진행하고 있다고 분석한다. 따라서 본 소프트웨어에서는 세포 주기 판단을 위해 이미지에서 세포를 이루는 픽셀들의 평균값을 계산하였으며, 이를 기준으로 네 단계의 주기를 구분하기 위해 세 개의 밝기 임계값을 설정하였다.
- 따라서 본 연구에서는 객체에 해당하는 픽셀 주변 8방향의 탐색 우선순위를 적응적으로 계산하여 탐색 횟수 및 시간을 최소화 할 수 있는 개선된 체인코드 알고리즘을 사용하였다. 해당 논문[16]에서는 비교적 타원 형태를 가진 세포의 경계선을 추적하는 데에 있어, 기존의 프리만 체인코드와 개선된 체인코드를 적용하여 같은 수행 결과가 나타나는 것을 확인함으로써 정확성을 입증하였다.
- 본 연구에서 개발한 소프트웨어 세 가지 모듈 중 가장 핵심 지표로서 세포 개수 측정 결과를 연구원의 수작업에 의한 결과와 비교하였다. 무료 분석 소프트웨어인 ImageJ의 결과 또한 연구원의 수작업에 의한 결과를 기준으로 비교하였다. Image J 프로그램은 NIH(National Institute of Health)에서 개발한 프로그램으로, JAVA를 기본 언어로 각종 프로그램과의 상호 호환성 및 적합성을 제공한다[17, 18].
- 먼저 세포 개수 측정은 모든 세포 분석 시스템의 가장 기본적인 모듈로서, 영상에서 군집으로 모여 있는 세포들을 단일세포로 분할하는 것이 중요하다. 본 논문에서는 이미지 전처리를 거친 결과로 획득한 이진 이미지에 개선된 체인코드 알고리즘을 적용하여 세포 개수를 카운트 하였다. 세포 개수를 세기 위해서 먼저 이진화 된 영상을 왼쪽에서 오른쪽, 위에서 아래로 스캔하여 객체에 해당하는 픽셀을 찾고, 가장 처음으로 탐지된 픽셀 좌표를 저장하였다.
- 본 논문에서는 전처리 과정의 결과 값인 분할된 세포 이미지에 개선된 체인코드 방법을 사용하여 세포 영상 내 각 세포의 크기, 밝기, 위치 정보를 획득하였다.
- 본 연구에서 개발한 세포 분석 소프트웨어는 크게 영상 획득 과정, 이미지 전처리 및 주요 특징 추출 과정, 분석 모듈 구현으로 나누어져있다. 본 소프트웨어의 세 가지 모듈은 현미경 이미지에서 얻은 세포의 특징 정보를 기반으로 구현하였으며, 세포 특징 추출은 이미지 전처리 단계를 거쳐 수행되었다.
- 본 연구에서 개발한 세포 분석 소프트웨어는 크게 영상 획득 과정, 이미지 전처리 및 주요 특징 추출 과정, 분석 모듈 구현으로 나누어져있다. 본 소프트웨어의 세 가지 모듈은 현미경 이미지에서 얻은 세포의 특징 정보를 기반으로 구현하였으며, 세포 특징 추출은 이미지 전처리 단계를 거쳐 수행되었다.
- 본 연구에서 개발한 소프트웨어 세 가지 모듈 중 가장 핵심 지표로서 세포 개수 측정 결과를 연구원의 수작업에 의한 결과와 비교하였다. 무료 분석 소프트웨어인 ImageJ의 결과 또한 연구원의 수작업에 의한 결과를 기준으로 비교하였다.
- 본 논문에서는 이미지 전처리를 거친 결과로 획득한 이진 이미지에 개선된 체인코드 알고리즘을 적용하여 세포 개수를 카운트 하였다. 세포 개수를 세기 위해서 먼저 이진화 된 영상을 왼쪽에서 오른쪽, 위에서 아래로 스캔하여 객체에 해당하는 픽셀을 찾고, 가장 처음으로 탐지된 픽셀 좌표를 저장하였다. 탐지된 픽셀 주변 8방향의 픽셀을 검색 및 이동하여 경계선을 추적해 나가다가 가장 처음 탐지된 픽셀 좌표를 만나면 경계선 추적이 종료된다.
- 6(b)에 나타낸 세포의 밝기 그래프를 기반으로 두 개의 적절한 임계값 설정에 따라 분류된다. 세포 주기는 G0/G1기, S기, G2/M기 세 가지로 묶어서 나타내었으며, G0/G1기의 표현 색상은 적색, S기는 파란색, G2/M기는 녹색으로 디스 플레이 하였다. Fig.
- 상용화 소프트웨어인 LabWindows CVI 툴에 Open Source를 적용하여 HCS 소프트웨어의 구현이 가능하다는 것을 보여주는 것이 본 연구의 목적이다. 소프트웨어는 공초점 레이저 현미경으로 촬영된 세포 이미지의 특징 정보를 자동으로 추출하여 세 가지 모듈인 Cell Cycle, Cell Counting, Mitotic Index 기능을 구현하였다.
- 특징 정보는 3가지 분석 모듈인 Cell counting과 Cell cycle, Mitotic index를 산출하는 데에 사용되었다. 소프트웨어에 사용된 이미지 전처리 함수는 오픈소스로 개발되고 있는 컴퓨터 비전 라이브러리인 OpenCV를 이용하여 빠르고 안정적으로 동작할수 있도록 하였다. 본 논문에서는 제안한 소프트웨어의 세가지 모듈 중 가장 핵심 지표로서 사용되는 세포 개수 측정만을 가지고 무료 세포 분석 소프트웨어와 비교 분석한 결과 99.
- 실험 원리는 전체 세포의 핵을 염색하는 PI와 같은 형광 염료로 세포를 염색하여 전체 세포의 수를 분석하고, M phase의 염색체는 히스톤 단백질인 H2 28Ser의 인산화가특이적으로 나타나는 점에 착안하여 p-H2 28Ser을 검출할수 있는 형광 항체를 이용하여 M phase에 있는 세포의 수를 확인함으로써 mitotic index를 산출할 수 있다.
- 2절에서 얻은 세포의 주요 특징 값 중 밝기 정보를 활용한다. 연구자들은 형광 이미지에서 세포의 형광 강도가 높을수록, 세포 주기가 간기에서 분열기 단계로 진행하고 있다고 분석한다. 따라서 본 소프트웨어에서는 세포 주기 판단을 위해 이미지에서 세포를 이루는 픽셀들의 평균값을 계산하였으며, 이를 기준으로 네 단계의 주기를 구분하기 위해 세 개의 밝기 임계값을 설정하였다.
- MKN-28 샘플 세포는 Confocal Dish의 위치에 따라 30장을 촬영하였으며, 촬영된 영상은 512 × 512 크기의 16bit 칼라 영상이다. 영상 포맷 유형은 화질 저하를 막기 위해 Tiff 파일로 변환하여 저장하였고 이를 USB로 획득하였다.
- 위 세 가지의 특징 값을 도출하기 위해 본 연구에서는 Flood Fill 알고리즘[14]과 프리만 체인코드[15], 그리고 개선된 체인코드 알고리즘[16]의 세 가지 알고리즘을 Fig. 5(a) 원본 이미지에 비교 적용해보았다.
- 따라서 경계선 추적 과정이 한 번 종료되면, 하나의 세포를 카운트하였다. 이러한 과정을 반복하여 이미지 내 모든 세포의 경계선 추적을 하였으며 동시에 세포의 개수를 카운트 하였다.
- 분석된 결과는 세포 주기별로 차이가 나게 되는데, 세포의 주기는 M기 (염색체수 2N -> 4N), G0/G1기 (염색체수 2N), S기 (2N -> 4N), 그리고 G2기 (4N)을 가지고 있으며, 염색체의 양이 2N -> 4N -> 2N으로 바뀌게 된다. 이를 핵만을 특이적으로 염색하는 시약을 이용하여 세포내 염색체 수를 핵의 형광 강도로 비교하여 세포 주기를 나누게 된다.
- 본 연구에서는 공초점 레이저 현미경으로부터 획득한 세포 이미지를 분석하기 위해 세 가지 모듈을 탑재한 소프트웨어를 구현하였다. 현미경으로 촬영된 원본 이미지는 전처리 과정을 거쳐 영상의 질을 개선시켰으며, 이후 개선된 체인코드 알고리즘을 적용하여 각 세포의 크기와 밝기, 위치정보 그리고 세포 개수 정보를 획득하였다. 특징 정보는 3가지 분석 모듈인 Cell counting과 Cell cycle, Mitotic index를 산출하는 데에 사용되었다.
대상 데이터
- MKN-28 샘플 세포는 Confocal Dish의 위치에 따라 30장을 촬영하였으며, 촬영된 영상은 512 × 512 크기의 16bit 칼라 영상이다.
- 또한 4개의 파장 대역(358nm, 488nm, 555nm, 639nm)의 빛을 조사하여 여러 개의 형광 염색처리된 샘플을 촬영 및 저장할 수 있다. 본 논문에서 사용한 공초점 레이저 현미경은 Carl Zeiss사의 LSM-700 모델이며 200배율로 샘플 세포를 촬영하여 72dpi의 해상도로 export하였다. MKN-28 샘플 세포는 Confocal Dish의 위치에 따라 30장을 촬영하였으며, 촬영된 영상은 512 × 512 크기의 16bit 칼라 영상이다.
- 본 연구에서는 Fig. 1에 보이는 공초점 레이저 현미경을 사용해 실제 70대 여자 노인의 위암세포인 MKN-28 세포 영상을 Fig. 2와 같이 획득하였다.
- 현미경으로 촬영된 원본 이미지는 전처리 과정을 거쳐 영상의 질을 개선시켰으며, 이후 개선된 체인코드 알고리즘을 적용하여 각 세포의 크기와 밝기, 위치정보 그리고 세포 개수 정보를 획득하였다. 특징 정보는 3가지 분석 모듈인 Cell counting과 Cell cycle, Mitotic index를 산출하는 데에 사용되었다. 소프트웨어에 사용된 이미지 전처리 함수는 오픈소스로 개발되고 있는 컴퓨터 비전 라이브러리인 OpenCV를 이용하여 빠르고 안정적으로 동작할수 있도록 하였다.
성능/효과
- 6(d)에서는 G0/G1기가 전체 69개의 세포 중 30개, S기에 해당하는 세포는 17개, G2/M기에 해당하는 세포는 22개로 나타났다. Mitotic Index는 G2/M기에 해당하는 세포 22개를 전체 세포 개수인 69로 나눈 값으로, 최종적으로 증식 세포율이 32%로 나타났다.
- 23%로 나타났다. 결과에서와 같이 제안한 소프트웨어로 세포 계수를 판단한 결과는 전문가가 육안으로 수행한 것과 평균 99.7% 일치한다는 것을 보여준다.
- 따라서 본 논문에서 사용하는 MKN-28세포 이미지에 프리만 체인코드와, 개선된 체인코드 알고리즘을 적용해 보았다. 두 알고리즘의 연산량 비교 결과 기존의 프리만 체인코드의 이웃 픽셀 탐색 횟수는 25,833번이며, 속도는 25초인 반면, 개선된 체인코드를 사용한 결과 탐색 횟수가 13,584번, 속도가 21초로 프리만 체인코드에 비해 연산 량과 소요시간이 적음을 확인하였다.
- 해당 논문[16]에서는 비교적 타원 형태를 가진 세포의 경계선을 추적하는 데에 있어, 기존의 프리만 체인코드와 개선된 체인코드를 적용하여 같은 수행 결과가 나타나는 것을 확인함으로써 정확성을 입증하였다. 또한 개선된 체인코드를 적용한 알고리즘이 기존의 프리만 체인코드 알고리즘에 비해 연산 량이 적고 수행 속도가 더 빠르게 나타났음을 확인하였다. 따라서 본 논문에서 사용하는 MKN-28세포 이미지에 프리만 체인코드와, 개선된 체인코드 알고리즘을 적용해 보았다.
- 소프트웨어에 사용된 이미지 전처리 함수는 오픈소스로 개발되고 있는 컴퓨터 비전 라이브러리인 OpenCV를 이용하여 빠르고 안정적으로 동작할수 있도록 하였다. 본 논문에서는 제안한 소프트웨어의 세가지 모듈 중 가장 핵심 지표로서 사용되는 세포 개수 측정만을 가지고 무료 세포 분석 소프트웨어와 비교 분석한 결과 99.7%의 정확도를 보여주었다. 이에 따라 공용 Open Source를 활용하여 HCS 구현이 가능함을 확인하였다.
- 74%로 나타났다. 본 연구에서 개발한 소프트웨어가 자동으로 세포 개수를 측정한 결과 오류율은 평균 0.23%로 나타났다. 결과에서와 같이 제안한 소프트웨어로 세포 계수를 판단한 결과는 전문가가 육안으로 수행한 것과 평균 99.
- 분석된 결과는 세포 주기별로 차이가 나게 되는데, 세포의 주기는 M기 (염색체수 2N -> 4N), G0/G1기 (염색체수 2N), S기 (2N -> 4N), 그리고 G2기 (4N)을 가지고 있으며, 염색체의 양이 2N -> 4N -> 2N으로 바뀌게 된다.
- Table 1에 나타낸 오류율은 전문가가 육안으로 판단한 세포 개수를 기준으로 두 가지 비교 대상 소프트웨어가 잘못 인식한 개수를 나타낸 것으로, 전체 개수에서 오차가 발생한 개수를 비율로 나타낸 것이다. 샘플 영상에서 ImgeJ 프로그램에 의해 세포를 정량한 결과, 오류율이 평균 1.74%로 나타났다. 본 연구에서 개발한 소프트웨어가 자동으로 세포 개수를 측정한 결과 오류율은 평균 0.
- 7%의 정확도를 보여주었다. 이에 따라 공용 Open Source를 활용하여 HCS 구현이 가능함을 확인하였다.
후속연구
- 개발된 소프트웨어는 개인용 PC에서도 분석이 가능하여, 기존 HCS의 문제인 장비 독점을 방지할 뿐만 아니라 연구자의 수동 업무를 자동화하여 다수의 샘플 분석을 동시에 진행해 실험 효율을 향상시킬 수 있을 것이라 기대된다. 제안된 세포 영상 분석 소프트웨어는 나머지 두 모듈에 대한 성능 검증과 추가 적인 모듈 개발이 진행된다면, 생물학적 연구 결과 도출 및 실험 진행에 보조적 프로그램으로서 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 개발된 소프트웨어는 개인용 PC에서도 분석이 가능하여, 기존 HCS의 문제인 장비 독점을 방지할 뿐만 아니라 연구자의 수동 업무를 자동화하여 다수의 샘플 분석을 동시에 진행해 실험 효율을 향상시킬 수 있을 것이라 기대된다. 제안된 세포 영상 분석 소프트웨어는 나머지 두 모듈에 대한 성능 검증과 추가 적인 모듈 개발이 진행된다면, 생물학적 연구 결과 도출 및 실험 진행에 보조적 프로그램으로서 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
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