Objectives : Gal-Geun-Tang (GT) has been described from SANGHAN in Korean traditional medicine and known to act against cold, fever, hypertension, and nasal catarrh. However, little has yet been learned about the effect of GT on immune function. In the current study, in vitro and in vivo immunomodul...
Objectives : Gal-Geun-Tang (GT) has been described from SANGHAN in Korean traditional medicine and known to act against cold, fever, hypertension, and nasal catarrh. However, little has yet been learned about the effect of GT on immune function. In the current study, in vitro and in vivo immunomodulatory activity of GT (water extract) was investigated.Methods : Water extract of GT induced in vitro proliferation of spleen cells and significantly increased their proliferative responses during anti-CD3 activation. Using purified splenic T and B cells, it was revealed that GT has a mitogenic activity to B cells and promotes their proliferation induced by lipopolysaccharide, whereas T cell proliferation was not triggered and GT was rather inhibitory to T cell activation caused by anti-CD3 antibody. In the presence of antigen presenting cells (APC), GT addition resulted in a significant increase of IFNγ and IL-4, but not IL-2, production. However, addition of high concentration (1,000㎍/㎖) of GT led to a marked reduction in T cell cytokine production and under such condition, GT facilitated apoptosis of T cells when examined by flow cytometry with propidium iodide staining.Results : In vivo immunomdulation of GT was also investigated using a mouse model. Following keyhole limpet hemocyanin (KLH) immunization, GT (1 ㎎/day) was orally administered for 9 days. Cell numbers in thymus, spleen and peripheral blood were not altered by GT administration, indicating that such dose is not immunotoxic. Cell numbers in draining lymph nodes (LN) and ex vivo Ag-specific proliferation of LN cells were significantly elevated by GT administration. However, any preferential stimulation of T or B and CD4+ or CD8+ T cell subpopulations was not observed in a flow cytometric analysis of LN cells. This result shows that GT does not promote in vivo B cell proliferation while GT enhances Ag-specific proliferation of LN cells, unlike what was observed in vitro.Conclusions : For a further understanding of in vivo immunomodulatory activity of GT, ex vivo cytokine production of LN cells obtained from KLH-immunized mice was evaluated. Ag-specific IFNγ production was significantly higher in GT-treated mice when compared to PBS-treated control mice. In contrast, IL-4 production in GT-treated group was comparable to control group unlike to in vitro data. In addition, GT administration did not result in any significant differences in serum levels of Ig (IgM, IgG1 and IgG2a) between GT-treated and control groups. Taken together, these data strongly support that GT promotes immune response, more profoundly type 1 helper T cell (Th1) activity and GT may be applicable for treatment of intracellular parasite infection such as viral diseases.
Objectives : Gal-Geun-Tang (GT) has been described from SANGHAN in Korean traditional medicine and known to act against cold, fever, hypertension, and nasal catarrh. However, little has yet been learned about the effect of GT on immune function. In the current study, in vitro and in vivo immunomodulatory activity of GT (water extract) was investigated.Methods : Water extract of GT induced in vitro proliferation of spleen cells and significantly increased their proliferative responses during anti-CD3 activation. Using purified splenic T and B cells, it was revealed that GT has a mitogenic activity to B cells and promotes their proliferation induced by lipopolysaccharide, whereas T cell proliferation was not triggered and GT was rather inhibitory to T cell activation caused by anti-CD3 antibody. In the presence of antigen presenting cells (APC), GT addition resulted in a significant increase of IFNγ and IL-4, but not IL-2, production. However, addition of high concentration (1,000㎍/㎖) of GT led to a marked reduction in T cell cytokine production and under such condition, GT facilitated apoptosis of T cells when examined by flow cytometry with propidium iodide staining.Results : In vivo immunomdulation of GT was also investigated using a mouse model. Following keyhole limpet hemocyanin (KLH) immunization, GT (1 ㎎/day) was orally administered for 9 days. Cell numbers in thymus, spleen and peripheral blood were not altered by GT administration, indicating that such dose is not immunotoxic. Cell numbers in draining lymph nodes (LN) and ex vivo Ag-specific proliferation of LN cells were significantly elevated by GT administration. However, any preferential stimulation of T or B and CD4+ or CD8+ T cell subpopulations was not observed in a flow cytometric analysis of LN cells. This result shows that GT does not promote in vivo B cell proliferation while GT enhances Ag-specific proliferation of LN cells, unlike what was observed in vitro.Conclusions : For a further understanding of in vivo immunomodulatory activity of GT, ex vivo cytokine production of LN cells obtained from KLH-immunized mice was evaluated. Ag-specific IFNγ production was significantly higher in GT-treated mice when compared to PBS-treated control mice. In contrast, IL-4 production in GT-treated group was comparable to control group unlike to in vitro data. In addition, GT administration did not result in any significant differences in serum levels of Ig (IgM, IgG1 and IgG2a) between GT-treated and control groups. Taken together, these data strongly support that GT promotes immune response, more profoundly type 1 helper T cell (Th1) activity and GT may be applicable for treatment of intracellular parasite infection such as viral diseases.
그러므로 葛根湯은 면역시스템에 영향을 미침으로써 치료효능을 발휘하는 방제임을 알 수 있으며, 이에 대한 보다 객관적인 검증이 필요하다고 생각하여, 葛根湯이 시험관내에서 B세포, T세포 증식과 IL-2, IFNγ 및 IL-4의 생산에 미치는 영향과 경구투여한 葛根湯이 생체 내에서 T 및 B 림프구의 항원특이적 반응에 미치는 영향을 조사하여 유의성이 있는 결과를 얻었기에 보고하고자 한다.
제안 방법
KLH (keyhole limpet hemocyanin, Sigma) 100 ㎍을 동량의 CFA (complete Freund's adjuvant, Sigma)와 혼합하여 마우스의 footpad에 피하로 주입하였다. 葛根湯 투여군에는 葛根湯(10 ㎎/㎖)을 매일 1회 0.1 ㎖씩 경구로 강제 투여하고, 대조군에는 동량의 PBS (phosphate-buffered saline, pH 7.4)를 투여하였으며, 항원 면역 후 다음 날부터 마우스를 희생시키기 전날까지 매일 1회 총 9일간 투여하였다.
葛根湯 투여에 의한 마우스 T세포 반응 증가를 더 자세히 이해하고자 티미딘 흡수법을 이용하여 세포의 증식과 사이토카인 생산을 조사하였다. 葛根湯을 투여한 마우스의 림프절 세포의 증식은 항원의 농도에 의존적으로 크게 증가하였다(Fig.
葛根湯이 비장세포의 증식을 유도하고, 활성화한 림프구의 증식을 증가시키는 상기 결과를 좀 더 자세히 알아보기 위하여 림프구 중 T 및 B 림프구에 각각 어떻게 작용하는지를 실험하였다. 림프절로부터 T세포를, 비장세포로부터 B세포를 순수 분리하여 실험을 반복하였다.
감기, 열, 고혈압, 비염 등에 효능이 있다고 알려진 葛根湯의 면역조절 기능을 확인하고자, 葛根湯이 시험관내에서 B세포와 T세포의 증식과 IL-2, IFNγ 및 IL-4의 생산에 미치는 영향을 실험하고 경구투여한 葛根湯이 생체내에서 T 및 B 림프구의 항원특이적 반응에 미치는 영향을 확인하였던 바, 다음과 같은 결과를 얻었다.
3). 따라서 in vivo에서 葛根湯의 투여가 B세포의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 혈청내의 KLH 항원에 특이적인 항체의 생산을 측정, 비교하였다. IgM은 면역반응 초기에 B세포가 생산하는 항체로 IgM의 생산을 비교한 결과, 葛根湯 투여군에서 다소 높았으나 통계적 유의차는 보이지 않았다(Fig.
항원의 유입시 B세포는 항원의 독성이나 감염력을 낮추기 위해 항원의 특이적인 항체를 생산한다25). 따라서 葛根湯을 투여한 마우스의 혈청내 KLH항원에 특이적인 항체의 양을 조사하였다. IgM은 면역반응 초기에 B세포가 생산하는 항체로 IgM의 생산을 비교한 결과, IgM의 생산이 葛根湯 투여군에서 다소 높은듯이 보였지만, 통계적 유의차를 보이지 않았다(Fig.
상기와 같은 실험 결과를 토대로, 葛根湯의 임상 응용 가능성을 파악하기 위하여 마우스 모델을 이용하여 in vivo에서 葛根湯의 면역조절 능력을 조사하였다. 마우스를 KLH 항원으로 면역 후 1㎎의 葛根湯을 경구로 강제 투여하였다. 우선 葛根湯의 독성 여부를 확인하기 위해서 마우스 폐, 흉선 그리고 비장의 무게를 비교하였다.
상기와 같은 실험 결과를 토대로, 葛根湯의 임상 응용 가능성을 파악하기 위하여 마우스 모델을 이용하여 in vivo에서 葛根湯의 면역조절 능력을 조사하였다. 마우스를 KLH 항원으로 면역 후 1㎎의 葛根湯을 경구로 강제 투여하였다.
이를 좀 더 정확히 확인하고자 T세포 유래의 사이토카인 생산을 비교하였다. 순수 분리한 T세포를 항원제시세포 존재하에 항CD3로 자극을 하면서 葛根湯 농도를 1-1,000 ㎍/㎖까지 다양하게 처리하여 IFN-γ, IL-4, IL-2 사이토카인의 생산을 조사하였다. IFN-γ생산은 葛根湯의 농도가 10, 100 ㎍/㎖에서 사이토카인 생산이 두드러지게 증가한 반면, 1000 ㎍/㎖ 의 葛根湯의 농도에서는 현저히 억제되는 경향을 보였으며(Fig.
마우스를 KLH 항원으로 면역 후 1㎎의 葛根湯을 경구로 강제 투여하였다. 우선 葛根湯의 독성 여부를 확인하기 위해서 마우스 폐, 흉선 그리고 비장의 무게를 비교하였다. PBS를 처리한 대조군과 葛根湯을 투여한 실험군 간의 마우스 폐와 흉선, 비장의 무게는 차이를 보이지 않았다(Fig.
전 실험을 통해 葛根湯은 B세포의 증식을 유도하고 활성화 B세포의 증식을 증가시킨 반면, 활성화 T세포의 증식을 억제하였다. 이에 葛根湯이 T세포의 면역학적 기능도 억제하는지를 확인하고자 분비성 단백질인 사이토카인의 생산에 미치는 葛根湯의 효과를 조사하였다. 순수 분리한 T세포를 항 CD3 (0.
전 실험들에서 고농도의 葛根湯이 T세포의 증식이나 사이토카인 생산을 억제하는 것을 관찰하였으므로 이러한 결과가 T세포에 미치는 葛根湯의 세포독성에 의한 것인지를 확인하기 위하여 고농도의 葛根湯처리 후 활성화 T세포의 아포토시스를 측정하였다. T세포를 항 CD3로 자극한 후 葛根湯의 농도를 달리하여 배양하고 세포를 수거하여 측정하였던 바, 1, 10, 100 ㎍/㎖ 농도의 葛根湯에 의해에서는 대조군과 비교하여 커다란 차이를 보이지 않았지만, 1,000 ㎍/㎖의 葛根湯의 농도에서 apoptosis가 현저히 높아졌으며, 2일 후에는 37.
비장은 항원 특이적 림프구들이 항원을 인식하는 2차 면역기관으로서 성숙된 T세포나 B세포가 존재한다21). 전 실험의 결과에 따라 비장세포의 증식이 T 혹은 B림프구, 또는 모든 림프구의 증식 때문인지를 확인하기 위하여, T, B세포를 분리하여 각각의 mitogen 존재 하에서 葛根湯의 양을 달리하여 첨가한 후 증식을 비교하였다. T세포에 葛根湯만을 첨가하는 경우에는 증식에 영향을 미치지 않았지만, 항CD3에 의한 자극 배양시 葛根湯 농도에 의존적으로 T세포의 증식이 두드러지게 억제되었다(Fig.
동결 건조한 葛根湯을 100 ㎎/㎖에 용해시킨 후 고압 멸균하여 사용하였다. 표적 세포를 준비한 후 제시된 농도의 葛根湯을 가하여 3일간 배양한 후, 세포 증식 및 사이토카인 생산량을 측정하여 비교하였다.
대상 데이터
본 실험에서 사용한 실험동물은 생후 3-5주된 Balb/c 마우스를 화학연구소 (대전)에서 구입하였으며, 항온 항습장치 (대종기기산업, 서울) 내에서 사육하면서 7주된 생쥐를 실험에 사용하였다.
데이터처리
앞선 실험들에서, 葛根湯이 고농도에서 T세포의 증식이나, 사이토카인 생산이 두드러지게 억제되는 것을 관찰하였다. 이러한 결과가 T세포에 미치는 葛根湯의 세포독성 효과에 의한 것인지를 확인하기 위하여, T세포의 apoptosis를 annexin-V 분석방법을 이용하였다. T세포를 항CD3로 자극한 후 葛根湯의 농도별로 첨가하여 배양 3일 후 세포를 수거하고 유식세포 분석(FACS)을 이용하여 측정한 바, 葛根湯의 농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖에선 대조군과 비교하여 커다란 차이를 보이지 않았지만 (실험 결과는 제시하지 않음), 葛根湯의 농도가 1,000 ㎍/㎖에서 약 2배 정도의 apoptosis가 유도되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig.
이론/모형
葛根湯은 許의 圖解常用韓方方劑20)에 수록된 내용을 사용하였으며, 내용은 표와 같다(Table 1).
마우스의 비장세포와 림프절 세포를 주사침을 사용하여 유리시키고, 9초 동안 멸균 증류수에 노출시키는 저장액 충격(hypotonic shock) 방법으로 적혈구를 파괴시킨 후 인산염 완충액 (PBS)으로 세척하였으며, trypan blue 염색 방법을 이용하여 생존 세포의 수를 측정하였다. 얻어진 림프절 세포와 비장세포부터 각각 T, B세포를 분리하기 위하여 플라스틱 배양접시를 이용하여 37℃에서 1시간 배양한 후, 비부착성 세포와 부착성 세포를 분리하여 수거하였다.
이에 葛根湯이 T세포의 면역학적 기능도 억제하는지를 확인하고자 분비성 단백질인 사이토카인의 생산에 미치는 葛根湯의 효과를 조사하였다. 순수 분리한 T세포를 항 CD3 (0.1 ㎍/㎖)로 자극을 하면서 1-1,000 ㎍/㎖ 농도의 葛根湯을 가한 후 3일간 배양하여 상청액을 수거하였으며, 상청액 중의 사이토카인 양을 ELISA 방법으로 조사하였다. T세포의 성장 인자인 IL-2 생산은 葛根湯처리에 의해 변화되지 않았다(Fig.
성능/효과
IFN-γ생산은 葛根湯의 농도가 10, 100 ㎍/㎖에서 사이토카인 생산이 두드러지게 증가한 반면, 1000 ㎍/㎖ 의 葛根湯의 농도에서는 현저히 억제되는 경향을 보였으며(Fig. 5), 제2형 조력 T림프구가 생산하는 IL-4의 생산을 葛根湯의 농도별로 조사한 바, 10 ㎍/㎖의 葛根湯 농도에서 증가하는 것으로 보였으며, 고농도인 1,000 ㎍/㎖에서 두드러진 억제효과를 보였다(Fig. 6).
순수 분리한 T세포를 항원제시세포 존재하에 항CD3로 자극을 하면서 葛根湯 농도를 1-1,000 ㎍/㎖까지 다양하게 처리하여 IFN-γ, IL-4, IL-2 사이토카인의 생산을 조사하였다. IFN-γ생산은 葛根湯의 농도가 10, 100 ㎍/㎖에서 사이토카인 생산이 두드러지게 증가한 반면, 1000 ㎍/㎖ 의 葛根湯의 농도에서는 현저히 억제되는 경향을 보였으며(Fig. 5), 제2형 조력 T림프구가 생산하는 IL-4의 생산을 葛根湯의 농도별로 조사한 바, 10 ㎍/㎖의 葛根湯 농도에서 증가하는 것으로 보였으며, 고농도인 1,000 ㎍/㎖에서 두드러진 억제효과를 보였다(Fig.
반면에 B세포의 경우에는 葛根湯에 의하여 증식이 유도되었으며, 葛根湯의 농도가 100 ㎍/㎖에서 증식이 가장 높았고, 고농도에서 증식이 오히려 억제되는 것을 확인하였다. LPS 자극배양시에도 葛根湯 100 ㎍의 농도에서 증식이 높았으며, 고농도에서 현저하게 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 3).
이러한 결과가 T세포에 미치는 葛根湯의 세포독성 효과에 의한 것인지를 확인하기 위하여, T세포의 apoptosis를 annexin-V 분석방법을 이용하였다. T세포를 항CD3로 자극한 후 葛根湯의 농도별로 첨가하여 배양 3일 후 세포를 수거하고 유식세포 분석(FACS)을 이용하여 측정한 바, 葛根湯의 농도가 1, 10, 100 ㎍/㎖에선 대조군과 비교하여 커다란 차이를 보이지 않았지만 (실험 결과는 제시하지 않음), 葛根湯의 농도가 1,000 ㎍/㎖에서 약 2배 정도의 apoptosis가 유도되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 7).
1). 또한 항원 특이적 림프구 증식 반응시 葛根湯 노출이 어떤 영향을 미치는지를 알아보기 위하여 항CD3 항체를 이용하여 마우스 비장세포를 비특이적으로 자극하면서 葛根湯의 양을 달리하여 첨가한 후 세포의 증식능에 미치는 영향을 조사한 바, 葛根湯의 농도가 100 ㎍ 까지는 葛根湯의 농도에 의존적으로 유의하게 증식하였지만, 고농도인 1,000 ㎍에선 증식이 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 1).
세포독성 물질은 세포의 아포토시스(apoptosis)를 유발하여 항원에 반응을 하지 못하게 한다. 앞선 실험들에서, 葛根湯이 고농도에서 T세포의 증식이나, 사이토카인 생산이 두드러지게 억제되는 것을 관찰하였다. 이러한 결과가 T세포에 미치는 葛根湯의 세포독성 효과에 의한 것인지를 확인하기 위하여, T세포의 apoptosis를 annexin-V 분석방법을 이용하였다.
7). 이러한 결과로 보아 고농도의 葛根湯 추출물은 T세포의 사멸을 유도함으로서 T세포 기능을 억제함을 알 수 있었다.
이상의 결과를 종합할 때, 葛根湯의 체내투여는 체액성 면역반응 보다는 세포성 면역기능을 유도할 것으로 판단되며, 따라서 葛根湯의 복용은 감염증, 특히 바이러스 질환과 같은 세포내 감염증의 예방에 유효할 것으로 기대된다.
사이토카인을 생산하여 다른 면역세포의 기능을 조절하는 조력 T세포는 IFN-γ를 생산하는 1형 조력 T세포(type 1 helper T; Th1) 또는 IL-4 및 IL-5를 주로 생산하는 2형 조력 T 세포(Th2)로 분화되어 각각 세포매개성 면역반응과 체액성 면역반응에 관여하게 된다30-37). 즉, 본 연구결과에 따르면 葛根湯 투여가 IFN-γ생산을 증가시킴으로써 세포성 면역 반응은 증강시키나 IL-4의 생산에는 그 영향이 유의하지 않아 체액성 면역기능에는 영향을 미치지 않음을 보여주었다.
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