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문제 정의
- 본 연구에서는 약용식물로부터 항산화 및 tyrosinase 저해활성을 나타내는 천연소재를 탐색하고자 국내의 자생식물을 대상으로 효능을 평가하였으며, 그중에서 우수한 저해능을 나타낸 미성숙 사과의 70% EtOH 추출물 및 각 분획물에 대하여 강한 라디칼 소거능 및 tyrosinase 저해능을 확인하였기에 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 각 시료용액에 120 μl에 0.45 mM의 희석한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyI(DPPH) 용액 60 μl을 넣고 교반한 후 15분간 방치한 다음 517 mm에서 흡광도를 측정하였다.
- 1과 같이 농축 결과물을 10% MeOH로 현탁하여 저극성 용매인 n-Haxane 으로 먼저 추출한 후 수층을 다시 ethyl acetate(EtOAc), n-butyl alcohol(n-BuOH)을 이용하여 각각 순차적으로 3회 분획하여 추출하였다. 각 용매추출 분획을 감압 농축하여 건조 시킨 후 n-Haxane 가용분획(1.1 g), EtOAc 가용분획 (18.8 g), n-BIOH 가용분획(17.6 g), H2O 가용분획(73.6 g)을 각각 얻었으며 각 분획물을 대상으로 라디칼 소거능 및 tyrosinase 저해 활성을 평가하였다.
- 미성숙 사과 70% methanol 추출물의 2,2'-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS) radical 소거능을 Re의 방법(20)을 변형하여 다음과 같이 측정하였다.
- 미성숙 사과를 70% ethanol 추출물에 대해 n-hexane, EtOAc 및n-BuOH로 순차 용매 분획하였고, 얻어진 결과물에 대하여 DPPH 및 ABTS+ radical 소거능 및 tyrosinase 저해활성을 평가하였다. DPPH 라디칼 소거능은 페놀성 화합물의 함량이 상대적으로 높은 EtOAc 가용부의 IC50값은 51.
- 신선한 미성숙 사과 2.0 kg을 잘게 자른 후 70% ethyl alcohol (EtOH) 7 L로 3일간 실온에서 3회 반복 추출한 후 얻어진 추출액을 여과한 후, 감압 농축(Rotary vacuum evaporator N-N series, Eyela, Tokyo, Japan)하여 얻어진 추출물(112.9 g)에 대해 항산화 효능의 평가로 이용된 DPPH 및 ABTS+ 라디칼에 대해서 각각의 시험농도에서 라디칼소거활성을 평가하였으며, tyrosinase 저해활성도 이전의 실험방법에 (21,22) 준하여 수행하였다.
- 전통 천연 식물로부터 항산화 및 멜라닌생성 억제 선도물질개발을 목표로 하여 미성숙 사과의 70% EtOH 추출물을 극성에 따라n-hexane, EtOAc, n-BuOH로 순차 분획하여 얻어진 각 분획에 대하여 mushroom tyrosinase를 이용한 실험을 통해 활성을 평가하였다. 그 결과 Fig.
- 9 g)에 대해 항산화 효능의 평가로 이용된 DPPH 및 ABTS+ 라디칼에 대해서 각각의 시험농도에서 라디칼소거활성을 평가하였으며, tyrosinase 저해활성도 이전의 실험방법에 (21,22) 준하여 수행하였다. 활성부분에 함유되어 있는 활성물질의 형태를 추정하기 위해 Fig. 1과 같이 농축 결과물을 10% MeOH로 현탁하여 저극성 용매인 n-Haxane 으로 먼저 추출한 후 수층을 다시 ethyl acetate(EtOAc), n-butyl alcohol(n-BuOH)을 이용하여 각각 순차적으로 3회 분획하여 추출하였다. 각 용매추출 분획을 감압 농축하여 건조 시킨 후 n-Haxane 가용분획(1.
대상 데이터
- 본 실험에서 시료로 사용한 미성숙 사과(malus pumila cv. Fuji)는 2014년 5월에 경북 영천시에서 채취한 신선 미성숙 사과를 마쇄한 다음 사용하였다.
이론/모형
- Tyrosinase의 작용 결과 생성되는 DOPA chrome을 비색 법에 의해 측정하는 Yagi 등의 방법(23)에 따라 실시하였다. 반응구는 0.
- 미성숙 사과 70% ethanol 추출물의 전자공여능은 Blois 방법(19)에 따라 측정하였다. 각 시료용액에 120 μl에 0.
- 총 페놀성 화합물의 함량은 Folin-Denis 방법(24)에 따라 측정하였으며, 추출물 혹은 분획물을 1.0 mg/mL 농도로 조제한 후, 75 mL의 증류수가 함유된 100 mL의 시험관에 1 mL을 넣고 잘 혼합하여 Folin-Denis 시액 5 mL와 탄산나트륨 포화용액 15 mL를 차례로 넣은 다음 이것을 잘 혼합하여 실온에서 60분 방치한 후, UV/VIS 분광광도계로 640 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질은 tannic acid(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 이용하여 표준곡선을 작성하여 양을 환산하였다.
성능/효과
- ABTS+ 라디칼 소거활성을 측정한 결과 Fig. 3에서 보는 것처럼 성숙 사과의 70% EtOH 추출물의 IC50값은 341.1±14.8 μg/mL, 미성숙 사과의 70% EtOH 추출물의 IC50값은 45.4±9.3 μg/mL로 미성숙 사과 70% EtOH 추출물에서 더욱 우수한 ABTS+ 라디칼 소거활성을 나타내었다.
- 1 μg/mL, n-Hexane의 IC50값은 >500μg/mL의 순으로 라디칼 소거활성을 나타냄을 확인하였다. DPPH 라디칼 소거능과 총 페놀성 화합물의 함량사이에는 밀접한 상관관계가 있다는 보고(26)에 근거하여 미성숙사과의 항산화 활성과 페놀성 화합물의 연관성을 평가한 결과, Fig. 2 및 Table 1에서 나타낸 것처럼, DPPH 라디칼 소거능은 페놀성 화합물의 함량이 상대적으로 높은 EtOAc 및n-BuOH 가용부에서 가장 우수한 것을 확인할 수 있다.
- DPPH 라디칼 소거능은 페놀성 화합물의 함량이 상대적으로 높은 EtOAc 가용부의 IC50값은 51.2±1.9 μg/mL으로 상대적으로 가장 우수한 활성을 확인 하였으며, 미성숙 사과 알콜 추출물에 존재하는 페놀성 화합물이 라디칼 소거능과의 연관성을 시사하였다.
- Fig. 2에서 나타낸 것처럼 성숙 및 미성숙 사과 70% EtOH 추출물 및 각 유기용매 분획에 대해서 DPPH 라디칼 소거활성을 평가한 결과, 성숙 사과의 70% EtOH 추출물의 IC50값은 304.6±8.1 μg/mL, 미성숙 사과의 70% EtOH 추출물의 IC50값은 115.4±6.4 μg/mL로 미성숙 사과 70% EtOH 추출물에서 더욱 우수한 활성을 나타내었다.
- 그 결과 Fig. 4에서 나타낸 것처럼 성숙 및 미성숙 사과 70% EtOH 추출물 및 각 유기용매 분획에 대해서 tyrosinase 저해활성을 평가한 결과, 성숙 사과의 70% EtOH 추출물의 IC50값은 >200 μg/mL으로 약한 활성을 나타내었으며, 미성숙 사과의 70% EtOH 추출물의 IC50값은 173.0±3.2 μg/mL으로 성숙 사과의 함수 EtOH 추출물보다 우수한 활성을 나타내었다.
- 다음으로n-BuOH 가용부의 IC50값은 78.9±3.1 μg/mL, H2O 가용부의 IC50값은 211.7±10.1 μg/mL, n-Hexane의 IC50값은 >500μg/mL의 순으로 라디칼 소거활성을 나타냄을 확인하였다.
- 또한 ABTS+ 라디칼 소거능은 EtOAc층의 IC50값은 28.3±1.5μg/mL의 소거 활성이 확인 되었고, 강한 활성물질의 존재가 시사되었다.
- 또한 n-hexane 분획물이 1 g당 1.6±0.2 mg의 상대적으로 낮은 페놀성 화합물의 함류량을 나타내는 것으로 분석되었다.
- 또한 미성숙 사과의 70% EtOH 추출물의 EtOAc 분획물이 1 g당 6.4±0.3 mg의 페놀성 화합물을 함유하는 것으로 나타났으며, n-BuOH 분획물이 1 g당 4.1±0.5 mg, H2O층에서는 1 g당 2.6±0.2 mg의 페놀성 화합물의 함량이 확인되었다.
- 또한 미성숙 사과의 EtOAc 가용부의 IC50값은 51.2±1.9 μg/mL으로 상대적으로 가장 우수한 활성을 나타내었으며, positive control인 (+)-catechin의 활성에 상당하는 효능을 확인하였다.
- 또한 미성숙 사과의 EtOAc 분획층의 IC50값은 28.3±1.5 μg/mL으로 상대적으로 가장 우수한 활성을 나타내었으며, positive control인 (+)-catechin의 IC50값인 1.3±0.2 μg/mL의 활성보다는 약한 활성임을 확인하였다.
- 5μg/mL의 소거 활성이 확인 되었고, 강한 활성물질의 존재가 시사되었다. 또한, tyrosinase 저해활성을 측정한 결과, 상대적으로 우수한 DPPH 및 ABTS+ 라디칼 소거능을 나타낸 EtOAc 층의 IC50은 101.2±1.7 mg/mL의 저해 활성을 나타내었으며 이는 대조군인 kojic acid의 IC50값인 57.2±2.1 μg/mL에 비해 약하나 단일물질로 정제할 경우 더욱 강한 효능의 화합물이 존재할 가능성이 있음을 시사하였다. 향후 이들 활성물질 동정을 통한 활성 기작에 대한 연구가 필요하며 본 연구결과는 보다 우수한 라디칼 소거능 및 tyrosinase 저해능을 가지는 새로운 선도화합물 발굴을 위한 기초자료로 활용가능하리라 사료된다.
- 상대적으로 우수한 효소 저해활성을 나타낸 미성숙 사과의 EtOAc 분획층의 IC50값은 101.2±1.7 μg/mL이였으며, positive control인 kojic acid의 IC50값인 57.2±2.1 μg/mL의 활성보다는 약한 활성임을 확인하였다.
- 성숙 및 미성숙 사과 70% EtOH 추출물 및 각 유기용매 분획에 대해서 시료 중의 총페놀성 화합물의 함량을 Table 1에 나타내었으며, 성숙 사과의 70% EtOH 추출물보다 미성숙 사과의 70% EtOH 추출물에서 1 g당 4.7±0.2 mg으로 페놀성 화합물의 함량이 높게 나타났다.
후속연구
- 3 μg/mL을 나타냄을 확인하였다(28). 이상의 결과 및 최근의 tyrosinase 저해 활성과 관련된 화합물 중 페놀성 화합물이 멜라닌 생성 억제 활성을 나타내는 물질이 다수 보고되어져 있으며, 미성숙 사과의 멜라닌 생성 억제 활성성분으로 추정되는 페놀성 화합물의 분리, 동정 및 활성기작 평가를 통하여 미성숙 사과 추출물의 우수한 미백 소재로서의 추가적인 연구가 필요하다고 사료된다.
- 1 μg/mL에 비해 약하나 단일물질로 정제할 경우 더욱 강한 효능의 화합물이 존재할 가능성이 있음을 시사하였다. 향후 이들 활성물질 동정을 통한 활성 기작에 대한 연구가 필요하며 본 연구결과는 보다 우수한 라디칼 소거능 및 tyrosinase 저해능을 가지는 새로운 선도화합물 발굴을 위한 기초자료로 활용가능하리라 사료된다.
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