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문제 정의
- 따라서 款冬花 單味劑가 간독성을 유발할 가능성과는 별개로 方劑내의 배합된 다른 약물들과의 상호작용을 통하여 간독성을 유발하지 않을 가능성이 있을 것이라는 가설에 근거하여 본 연구에서는 款冬花 자체의 간독성 및 신독성, 款冬花가 들어있는 定喘湯 방제의 간독성 및 신독성, 定喘湯과 비슷한 효능을 가진 淸肺湯 및 淸肺湯에 款冬花를 넣었을 때의 간독성 및 신독성의 발현 여부를 각각 탐색함으로써 款冬花 및 款冬花가 方劑 중에 배합되었을 때의 생체 독성 발현 여부를 검증하고자 하였다.
- 본 연구의 최종 목표는 흰쥐를 대상으로 款冬花 물 추출물, 款冬花 분말, 定喘湯, 淸肺湯, 淸肺湯 加 款冬花를 2주간 혹은 30일간 경구 투여 시 흰쥐에서 간독성 및 신독성을 유발할 가능성을 탐색함으로써 款冬花 및 方劑 중에 配合된 款冬花의 생체 독성 발현 여부를 검증하는 것이었다.
제안 방법
- 2주간 혹은 30일간의 약물 투여가 종료된 후 각 군에 배당된 흰쥐의 체중 변화 (실험 시작일과 종료일 간의 차이, 체중 증가도)를 측정하고 기록하였다.
- 2주간 혹은 30일간의 약물 투여가 종료된 후 각 군에 배당된 흰쥐의 체중 변화를 측정한 후, 각 실험동물을 ethyl ether로 전신 마취하였다. 동물을 해부대에 위치시키고 심장 박동이 감지되는 위치에 멸균된 주사기를 삽입하여 혈액을 5 ㎕ 채취하였다.
- 6주령의 SD 종 雄性 흰쥐 18마리를 한 군당 3마리씩 총 6군으로 무작위 분류하였다. 분류된 동물을 대조군 (정제수 2 ㎕/rat), 款冬花 물 추출물 투여군 (최종 추출물 2 ㎕/rat), 款冬花 분말 투여군 (80 ㎎/2 ㎕/rat), 定喘湯 투여군 (최종 추출물 2 ㎕/rat), 淸肺湯 투여군 (최종 추출물 2 ㎕/rat), 淸肺湯 加 款冬花 투여군 (최종 추출물 2 ㎕/rat) 으로 정하고, 총 2주간 (5일/주) 경구 투여하였다.
- 8. Effect of Farfarae flos (KP) on serum GPT activity of rat during 30 days of administration KP was administered to rats and serum GPT activity of each rat was measured, as described in Materials and Methods. Each bar represents a mean ± S.
- 1. Effects of Farfarae flos (KW, KP), JCT, CPT, CPK on body weight of rat during 2 weeks of administration Farfarae flos (KW, KP), JCT, CPT, CPK were administered to rats and body weight of each rat was measured, as described in Materials and Methods. Each bar represents a mean ± S.
- 4. Effects of Farfarae flos (KW, KP), JCT, CPT, CPK on serum BUN concentration of rat during 2 weeks of administration Farfarae flos (KW, KP), JCT, CPT, CPK were administered to rats and serum BUN concentration of each rat was measured, as described in Materials and Methods. Each bar represents a mean ± S.
- 2. Effects of Farfarae flos (KW, KP), JCT, CPT, CPK on serum GOT activity of rat during 2 weeks of administration Farfarae flos (KW, KP), JCT, CPT, CPK were administered to rats and serum GOT activity of each rat was measured, as described in Materials and Methods. Each bar represents a mean ± S.
- 3. Effects of Farfarae flos (KW, KP), JCT, CPT, CPK on serum GPT activity of rat during 2 weeks of administration Farfarae flos (KW, KP), JCT, CPT, CPK were administered to rats and serum GPT activity of each rat was measured, as described in Materials and Methods. Each bar represents a mean ± S.
- 5. Effects of Farfarae flos (KW, KP), JCT, CPT, CPK on serum creatinine concentration of rat during 2 weeks of administration Farfarae flos (KW, KP), JCT, CPT, CPK were administered to rats and serum creatinine concentration of each rat was measured, as described in Materials and Methods. Each bar represents a mean ± S.
- 간독성의 지표로는 트랜스아미나제인 GOT (AST), GPT (ALT)의 혈청 중 활성을 선정하였으며, 2주간의 각 약물 경구투여 후 GOT, GPT의 혈청 중 활성을 측정한 결과 款冬花 물 추출물 투여군 (KW), 款冬花 분말 투여군 (KP), 定喘湯 투여군 (JCT), 淸肺湯 투여군 (CPT), 淸肺湯 加 款冬花 투여군 (CPK)의 어느 군에서도 대조군과 비교하여 유의한 차이를 보이지 않음으로 써 각 약물이 실험동물에서 간독성을 유발하지 않음을 알게 되었다.
- 그러나 실제로는 상용 환산용량의 25배에 해당하는 款冬花가 흰쥐에게 투여 되도록 하기 위해, 50 g의 款冬花를 탕전 (추출)하여 100 ㎕의 최종 추출물 (탕액)을 얻음으로써 0.5 g/㎕의 최종 농도로 조제하고, 흰쥐 1마리당 1일 2 ㎖ (1 g=40 ㎎의 25배/일)의 추출물을 투여하였다.
- 또한 款冬花 물 추출물의 잠재적인 독성과 款冬花 미세분말 현탁액의 잠재적 독성을 비교하기 위해 款冬花를 미세분말로 만들어 정제수에 40 ㎎/㎕ 농도로 현 탁액을 조제한 후 흰쥐 1마리당 1일 2 ㎕를 투여함으로써 체중 350 g 정도의 흰쥐에 투여되어야 할 환산용량 (1 ㎕, 款冬花 원 생약으로서 40 ㎎ 함유) 의 2배량을 투여하였다. 기타 定喘湯 , 淸肺湯, 淸肺湯 加 款冬花의 경우에도 흰쥐 1마리당 1일 2 ㎕를 투여함으로써 체중 350 g 정도의 흰쥐에 투여되어야 할 최종 추출물 환산용량의 2배량을 투여하였다.
- 2주간 혹은 30일간의 약물 투여가 종료된 후 각 군에 배당된 흰쥐의 체중 변화를 측정한 후, 각 실험동물을 ethyl ether로 전신 마취하였다. 동물을 해부대에 위치시키고 심장 박동이 감지되는 위치에 멸균된 주사기를 삽입하여 혈액을 5 ㎕ 채취하였다. 채취된 혈액을 멸균된 15 ㎕ 용량의 시험관에 주사기 침을 제거한 상태에서 조심스럽게 옮겨 넣었다.
- 또한 款冬花 물 추출물의 잠재적인 독성과 款冬花 미세분말 현탁액의 잠재적 독성을 비교하기 위해 款冬花를 미세분말로 만들어 정제수에 40 ㎎/㎕ 농도로 현 탁액을 조제한 후 흰쥐 1마리당 1일 2 ㎕를 투여함으로써 체중 350 g 정도의 흰쥐에 투여되어야 할 환산용량 (1 ㎕, 款冬花 원 생약으로서 40 ㎎ 함유) 의 2배량을 투여하였다. 기타 定喘湯 , 淸肺湯, 淸肺湯 加 款冬花의 경우에도 흰쥐 1마리당 1일 2 ㎕를 투여함으로써 체중 350 g 정도의 흰쥐에 투여되어야 할 최종 추출물 환산용량의 2배량을 투여하였다.
- 분류된 동물을 대조군 (정제수 2 ㎕/rat), 款冬花 물 추출물 투여군 (최종 추출물 2 ㎕/rat), 款冬花 분말 투여군 (80 ㎎/2 ㎕/rat), 定喘湯 투여군 (최종 추출물 2 ㎕/rat), 淸肺湯 투여군 (최종 추출물 2 ㎕/rat), 淸肺湯 加 款冬花 투여군 (최종 추출물 2 ㎕/rat) 으로 정하고, 총 2주간 (5일/주) 경구 투여하였다. 또한 별도로 각 군당 3마리씩 대조군 (정 제수 2 ㎕/rat) 및 款冬花 분말 투여군 (80 ㎎/2 ㎕/rat)을 설정하고 총 30일간 약물을 경구 투여하였다.
- 6주령의 SD 종 雄性 흰쥐 18마리를 한 군당 3마리씩 총 6군으로 무작위 분류하였다. 분류된 동물을 대조군 (정제수 2 ㎕/rat), 款冬花 물 추출물 투여군 (최종 추출물 2 ㎕/rat), 款冬花 분말 투여군 (80 ㎎/2 ㎕/rat), 定喘湯 투여군 (최종 추출물 2 ㎕/rat), 淸肺湯 투여군 (최종 추출물 2 ㎕/rat), 淸肺湯 加 款冬花 투여군 (최종 추출물 2 ㎕/rat) 으로 정하고, 총 2주간 (5일/주) 경구 투여하였다. 또한 별도로 각 군당 3마리씩 대조군 (정 제수 2 ㎕/rat) 및 款冬花 분말 투여군 (80 ㎎/2 ㎕/rat)을 설정하고 총 30일간 약물을 경구 투여하였다.
- 투여된 각 약물에 의한 간독성 발생 여부를 검증하기 위하여, 간세포 파괴 시 혈청으로 유출되는 효소인 GOT (AST), GPT (ALT)의 혈청 중 활성을 생화학 자동분석기인 OLYMPUS AU400 (Olympus, Japan)을 이용하여 측정하였다. 먼저 혈청 중의 GOT (Glutamate Oxaloacetate Transaminase)는 L-Asparatate와 α-ketoglutarate를 Oxaloacetate와 L-Glutamate로 전환시키며 이때 생성된 oxaloacetate는 Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NADH)의 존재 하에 Malate Dehydrogenase (MDH)의 작용으로 L-Malate로 전환된다.
- 투여된 약물에 의한 신독성 발생 여부를 검증하기 위하여, 각 약물 투여 후 혈청 중의 BUN (Blood Urea Nitrogen) 값을 생화학 자동분석기인 OLYMPUS AU400 (Olympus, Japan)을 이용하여 측정하였다. 혈청 중의 요소 (urea)는 urease에 의해 특이적으로 분해되어 암모니아와 이산화탄소를 생성하며, 생성된 암모니아는 2-oxoglutarate와 먼저 반응하고 GLDH의 존재 하에 NADH와 반응하여 Glutamate와 NAD를 생성하고, 이 반응에서 감소하는 NADH의 감소 속도를 측정하여 혈청 중의 요소질소 (BUN)의 양 (농도)을 계측하였다.
- 한편 款冬花 물 추출물 (KW)에는 독성물질인 pyrrolizidine alkaloids가 추출 및 함유되어 있지 않을 가능성을 배제하기 위하여 款冬花를 미세분말화 (KP)하여 현탁액을 조제한 후 인체 투여량 기준 2배 용량으로 투여하였다. 흰쥐의 체중 증가도, GOT 및 GPT 활성, BUN 및 creatinine 농도에 대조군과 비교하여 유의한 변화를 유발하지 않는다는 결과를 얻음으로 款冬花 미세분말 투여가 실험동물의 영양 섭취 및 대사 상태에 유의한 독성을 유발하지 않으며 간기능 및 신기능에도 유의한 독성을 유발하지 않을 가능성을 보여주었다 (Fig.
- 투여된 약물에 의한 신독성 발생 여부를 검증하기 위하여, 각 약물 투여 후 혈청 중의 BUN (Blood Urea Nitrogen) 값을 생화학 자동분석기인 OLYMPUS AU400 (Olympus, Japan)을 이용하여 측정하였다. 혈청 중의 요소 (urea)는 urease에 의해 특이적으로 분해되어 암모니아와 이산화탄소를 생성하며, 생성된 암모니아는 2-oxoglutarate와 먼저 반응하고 GLDH의 존재 하에 NADH와 반응하여 Glutamate와 NAD를 생성하고, 이 반응에서 감소하는 NADH의 감소 속도를 측정하여 혈청 중의 요소질소 (BUN)의 양 (농도)을 계측하였다. 혈청 중의 크레아티닌 (creatinine)은 pH가 알칼리성인 조건에서 picric acid와 반응하여 적색의 화합물을 생성하며, 이 때 생성되는 적색 화합물의 증가 속도를 측정함으로써 크레아티닌의 양 (농도)을 계측하였다.
- 혈청 중의 요소 (urea)는 urease에 의해 특이적으로 분해되어 암모니아와 이산화탄소를 생성하며, 생성된 암모니아는 2-oxoglutarate와 먼저 반응하고 GLDH의 존재 하에 NADH와 반응하여 Glutamate와 NAD를 생성하고, 이 반응에서 감소하는 NADH의 감소 속도를 측정하여 혈청 중의 요소질소 (BUN)의 양 (농도)을 계측하였다. 혈청 중의 크레아티닌 (creatinine)은 pH가 알칼리성인 조건에서 picric acid와 반응하여 적색의 화합물을 생성하며, 이 때 생성되는 적색 화합물의 증가 속도를 측정함으로써 크레아티닌의 양 (농도)을 계측하였다.
대상 데이터
- 에 근거하였으며 한 첩당 처방의 내용과 용량은 다음과 같다 (Table 2). 款冬花 및 定喘湯, 淸肺湯의 구성 藥材는 경동한방솔루션제약 (충남, 한국)에서 공급받아 精選하여 사용하였다.
- 별도로 600 g의 款冬花를 한약 분쇄기를 이용하여 전체를 미세분말로 만든 후, 정제수에 40 ㎎/㎕의 농도로 현탁하여 4 ℃ 냉장고에 보관하였다. 기타 제반 시약들은 Sigma사 (St. Louis, Mo., U.S.A.) 또는 여타의 국내외 시약 제조사에서 일급시약 (reagent grade) 이상의 제품들을 구입하여 사용하였다.
- 평균 체중 350 g 정도의 6주령 SD rat (흰쥐, 雄性)를 실험동물 전문사육 공급업체인 대한바이오링크 ㈜(Kyung-gi, Korea)에서 구입하고, 3-4일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 측정 결과는 Mean ± S.E.M.으로 환산된 후, 약물 처리군의 측정치는 대조군 측정치의 백분율로 나타냈다.
- 통계처리는 unpaired Student's t-test로 하였으며, p<0.05인 경우에 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
성능/효과
- 1. 인체 투여량 기준 25배의 고용량을 2주간 투여 시, 款冬花 물 추출물 (KW)은 흰쥐의 체중 증가도, GOT 및 GPT 활성, BUN 및 creatinine 농도에 대조군과 비교하여 유의한 변화를 유발하지 않았다.
- 2. 款冬花의 미세분말 (KP) 현탁액을 인체 투여량 기준 2배 용량으로 2주 혹은 30일간 투여 후에도 흰쥐의 체중 증가도, GOT 및 GPT 활성, BUN 및 creatinine 농도에 대조군과 비교하여 유의한 변화를 유발하지 않았다.
- 2주간의 약물 경구 투여기간 동안 각 실험동물의 체중 변화를 측정한 결과 款冬花 물 추출물 투여군(KW), 款冬花 분말 투여군 (KP), 定喘湯 투여군 (JCT), 淸肺湯 투여군 (CPT), 淸肺湯 加 款冬花 투여군 (CPK)의 어느 군에서도 대조군과 비교하여 유의한 차이를 보이지 않음으로써 각 약물이 실험동물의 영양 섭취 및 대사 상태에 유의한 독성을 유발하지 않음을 알게 되었다 (Fig. 1).
- 3. 款冬花를 함유하는 처방인 定喘湯 (JCT) 및 호흡기 질환에 사용되는 처방인 淸肺湯 (CPT)과 淸肺湯 加 款冬花 (CPK)를 인체 투여량 기준 2배 용량으로 2주간 투여 시에도 흰쥐의 체중 증가도, GOT 및 GPT 활성, BUN 및 creatinine 농도에 대조군과 비교하여 유의한 변화를 유발하지 않았다.
- 다음으로 단독 투여 후의 款冬花에 의한 독성 유발 가능성과 별개로 款冬花를 함유하는 方劑를 투여했을 때는 어떤 양상을 보이는지 알아보기 위해 款冬花가 들어있는 處方인 定喘湯 (JCT)을 인체 투여량 기준 2배 용량으로 투여한 결과 흰쥐의 체중 증가, 간독성 및 신독성 지표에 공히 유의한 변화를 유발하지 않았다 (Fig. 1-5).
- 본 연구의 결과 인체 투여량 기준 25배의 고용량 투여 시에도 款冬花 물 추출물 (KW)은 흰쥐의 체중 증가도, GOT 및 GPT 활성, BUN 및 creatinine 농도에 대조군과 비교하여 유의한 변화를 유발하지 않았다(Fig. 1-5).
- 신독성의 지표로는 Blood Urea Nitrogen (BUN) 및 creatinine의 혈청 중 농도를 선정하였으며, 2주간의 각 약물 경구투여 후 Blood Urea Nitrogen (BUN) 및 creatinine의 혈청 중 농도를 측정한 결과 款冬花 물 추출물 투여군 (KW), 款冬花 분말 투여군 (KP), 定喘湯 투여군 (JCT), 淸肺湯 투여군 (CPT), 淸肺湯 加 款冬花 투여군 (CPK)의 어느 군에서도 대조군과 비교하여 유의한 차이를 보이지 않음으로써 각 약물이 실험동물에서 신독성을 유발하지 않음을 알게 되었다.
- 이러한 실험결과는 고용량의 款冬花 추출물이라 해도 2주간의 일반적 투여 기간 (20첩, 1재 분량, 10일에서 14일간 복용)에는 실험동물의 영양 섭취 및 대사 상태에 유의한 독성을 유발하지 않으며 동시에 간기능 및 신기능에도 유의한 독성을 유발하지 않을 가능성을 시사하는 결과로 판단된다.
- 이상의 결과는 款冬花 혹은 款冬花를 포함하는 方劑 모두에서 간독성 및 신독성이 유발되지 않음으로 인체내 영양 섭취 및 대사 상태에 유의한 독성을 유발하지 않는다는 것을 시사하는 바이다.
- 이상의 결과는 인체 투여를 기준으로 처방의 상용량 및 상용 투여기간 범위 혹은 그 이상의 투여 기간에도 款冬花 및 款冬花를 포함하는 方劑 모두에서 간독성 및 신독성이 유발되지 않음을 시사한다. 그러나 단일 약제의 독성 여부를 확인하는데 체중 증가, GOT 및 GPT 활성, BUN 및 creatinine의 항목의 변화를 관찰에함에 단순이 이번 시험을 통해 款冬花 方劑가 간독성 및 신독성을 유발하지 않았다고 단정 짓기에는 부족한 점들이 있다고 사료된다.
- 이와는 별도로 독성물질로 보고된 pyrrolizidine alkaloids를 함유하고 있는 款冬花 미세분말화 (KP) 현탁액을 상기 2주 투여 기간의 2배에 해당하는 30일간 투여한 후에도 흰쥐의 체중 증가, GOT 및 GPT 활성, BUN 및 creatinine 농도에 대조군과 비교하여 유의한 변화를 유발하지 않음으로써 실험동물의 영양 섭취 및 대사 상태에 유의한 독성을 유발하지 않으며 동시에 간기능 및 신기능에도 유의한 독성을 유발하지 않음을 보여주었다 (Fig. 1-5).
- 각 군별 투여 용량의 설정 근거는 다음과 같다. 일반적인 처방 기준으로 체중 70 kg 성인이 1첩당 4 g의 款冬花를 1일 2첩씩 복용한다면 8 g/일/70 kg이므로, 체중 70 kg 성인에게 款冬花 추출물 200 ㎕/일 (통상 1일 2회 복용, 1회당 100 ㎕, 款冬花 원 생약으로서 총 8 g 함유) 투여를 기준으로 체중 350 g 정도의 흰쥐에 투여되어야 할 환산용량은 1 ㎕ (款冬花 원 생약으로서 40 ㎎ 함유)로 계산되었다. 그러나 실제로는 상용 환산용량의 25배에 해당하는 款冬花가 흰쥐에게 투여 되도록 하기 위해, 50 g의 款冬花를 탕전 (추출)하여 100 ㎕의 최종 추출물 (탕액)을 얻음으로써 0.
- 한편 款冬花 물 추출물 (KW)에는 독성물질인 pyrrolizidine alkaloids가 추출 및 함유되어 있지 않을 가능성을 배제하기 위하여 款冬花를 미세분말화 (KP)하여 현탁액을 조제한 후 인체 투여량 기준 2배 용량으로 투여하였다. 흰쥐의 체중 증가도, GOT 및 GPT 활성, BUN 및 creatinine 농도에 대조군과 비교하여 유의한 변화를 유발하지 않는다는 결과를 얻음으로 款冬花 미세분말 투여가 실험동물의 영양 섭취 및 대사 상태에 유의한 독성을 유발하지 않으며 간기능 및 신기능에도 유의한 독성을 유발하지 않을 가능성을 보여주었다 (Fig. 6-10).
후속연구
- 그러나 단일 약제의 독성 여부를 확인하는데 체중 증가, GOT 및 GPT 활성, BUN 및 creatinine의 항목의 변화를 관찰에함에 단순이 이번 시험을 통해 款冬花 方劑가 간독성 및 신독성을 유발하지 않았다고 단정 짓기에는 부족한 점들이 있다고 사료된다. 앞으로는 다양한 약재 추출법 및 세포독성시험, 항원성 시험, 생식독성시험 등의 여러 가지 지표들을 통하여 本草 단일 성분 뿐이 아닌 方劑단위의 안전성을 확증하는 심도있는 후속 연구과정이 필요하다고 사료된다.
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