[논문]Pichia pastoris에서 생산된 인체 췌장 α-아밀레이스 동질효소의 촉매활성에 대한 염소이온의 영향

김민규; 김영완

doi:10.9721/kjfst.2016.48.4.341

Pichia pastoris에서 생산된 인체 췌장 α-아밀레이스 동질효소의 촉매활성에 대한 염소이온의 영향
Effect of chloride ions on the catalytic properties of human pancreatic α-amylase isozyme produced in Pichia pastoris 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.48 no.4, 2016년, pp.341 - 346

김민규 (고려대학교 식품생명공학과) , 김영완 (고려대학교 식품생명공학과)

초록
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HPA는 식품으로 섭취되는 녹말을 분해하는데 있어서 매우 중요한 역할을 수행하는 효소이기 때문에 HPA 효소 활성의 억제는 당뇨와 비만과 같은 질환의 예방과 치료에 있어서 의미를 가진다. 따라서 HPA는 당뇨병 치료와 비만 예방을 위한 새로운 식 의약품 소재 개발을 위한 주요 타깃 효소 중 하나이며, 새로운 소재의 개발을 위해서는 HPA의 반응 메커니즘을 비롯하여 천연 기질 분해 특성에 대한 이해가 반드시 필요하다. 본 연구에서는 HPA의 동질효소 중 연구가 거의 진행되지 않은 HPA II에 대한 효소 특성화를 진행하고자 P. pastoris 시스템을 이용하여 재조합 HPA II를 생산하였으며, 녹말 분해와 관련된 효소적 특성을 분석하였다. HPA II는 10 mM NaCl까지 농도 의존적으로 효소활성이 증가하였으며, 최적 활성을 위한 pH는 0 mM NaCl 조건에서 pH 6.5이었으나 10 mM NaCl조건에서 pH 7.5로 이동하는 특성을 보였으며, 이는 HPA I을 포함하는 염소이온 의존형 아밀레이스가 나타내는 전형적인 특징이다. 염소이온 존재 시 최적 pH가 염기성 pH 영역으로 이동하는 것은 염소 이온과 효소의 결합에 의해 HPA II의 산/염기 촉매 잔기의 $pK_a$값이 커진다는 것을 의미하며, 염소이온을 첨가하였을 때 녹말에 대한 가수분해 활성의 증대 정도가 산성 pH 영역보다 염기성 pH 영역에서 두드러지게 나타났다는 점이 이를 뒷받침하였다. 반응속도론적 분석 결과에 따르면 염소이온 존재 시 효소활성의 증대는 대부분 전환수(turnover number)의 증대에 의한 것으로 나타났으며, 가용성 녹말 보다 곡류 녹말에 대한 전환수의 증대가 크게 나타났다. 염소이온은 활성의 증대뿐만 아니라 고농도의 기질 조건에서 기질에 의한 효소 활성 억제 양상을 심화시키는 것으로 나타났다. 결론적으로 HPA II의 특징은 HPA I과 거의 유사한 경향을 나타내었으며, 염소이온 첨가여부에 따른 HPA II의 가수분해활성 결과를 바탕으로 향 후 HPA에 대한 곡류 녹말 가수분해 활성 억제제 개발을 위한 연구를 추진할 계획이다.

Abstract ▼ AI-Helper

The AMY2B gene, encoding human pancreatic ${\alpha}$-amylase isozyme (HPA II), was expressed in Pichia pastoris, and the effects of chloride ions on HPA II activity toward starch substrates were investigated. As seen with chloride ion-dependent ${\alpha}$-amylases-including HPA I, the isozyme of HPA II-chloride ions increased enzyme activity and shifted the optimal pH to an alkaline pH. The activity enhancement by chloride was more significant at pH 8 than that at pH 6, suggesting that the protonation state of the general acid/base catalyst of HPA II was important for the hydrolysis of starches at an alkaline pH because of the increase in its $pK_a$ by chloride ions. The turnover values for cereal starches as the substrates markedly increased in the presence of chloride by up to 7.2-fold, whereas that for soluble starch increased by only 1.7-fold. Chloride inhibited substrate hydrolysis at high substrate concentrations, with $K_i$ values ranging from 6 to 15 mg/mL.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 HPA는 당뇨병 치료와 비만 예방을 위한 새로운 식 · 의약품 소재 개발을 위한 주요 타깃 효소 중 하나이며, 새로운 소재의 개발을 위해서는 HPA의 반응 메커니즘을 비롯하여 천연 기질 분해 특성에 대한 이해가 반드시 필요하다. 본 연구에서는 HPA의 동질효소 중 연구가 거의 진행되지 않은 HPA II에 대한 효소 특성화를 진행하고자 P. pastoris 시스템을 이용하여 재조합 HPA II를 생산하였으며, 녹말 분해와 관련된 효소적 특성을 분석하였다.
HPA I에 대한 광범위한 연구와 달리 동질효소인 HPA II의 경우 야생형(wild type) 효소와 Saccharomyces cerevisiae를 이용한 재조합 효소를 이용한 기본적인 특성화에 대해서만 연구만이 진행되었을 뿐(17,18), 염소이온 의존적 효소 활성과 천연의 기질인 녹말 가수분해 활성에 대해서는 연구가 진행된 바 없다. 본 연구의 목적은 재조합 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 이용하여 HPA 동질효소 중 하나인 HPA II를 재조합 효소로 생산하고, 염소 이온에 따른 녹말 분해 활성의 변화를 살펴봄으로써 천연 기질에 대한 HPA II의 효소적 특성에 관한 정보를 제공하고자 한다.

제안 방법

1% 가용성 녹말과 곡류 녹말 용액 500 μL와 100 mM 완충 용액 400 μL를 혼합한 후 100 μL의 희석된 효소액을 넣고 30에서 반응하면서 3, 6, 및 10분 마다 100 μL의 반응액을 취한 후 500 μL의 구리-비신코니네이트 용액을 첨가하여 반응을 정지시키고, 증류수 400 μL를 첨가한 후 80에서 30분간 반응하여 발색시켰다.
AMY2B 유전자를 증폭하기 위하여 플라스미드 SC113058를 주형으로 사용하였으며, 두 개의 합성 프라이머 HPA-Pm-fw (5'-GGGTTCTGCACGTGGCAGTATTCCCCAAATACA-3')와 HPA-Sa-rv (5'-TTAAGTCGACCAATTTAGATTCAGCATGAAT-3')을 이용하여 PCR을 수행하였다.
HPA II의 활성 측정을 위하여 구리-비신코니네이트(copper-bicinchoninate) 방법(21)을 수정하여 효소활성을 측정하였다. 1% 가용성 녹말 용액 50 μL와 100 mM 완충용액 40 μL를 혼합한 후 10 μL의 희석된 효소액을 넣고 10분간 30에서 반응하였다.
P. pastoris를 이용한 HPA II 생산은 Invitrogen에서 제공하는 EasySelect^TM Pichia Expression Kit 매뉴얼을 참고하여 실시하였다. 재조합 단백질 생산을 위해서 BMGY 배지 [1% yeast extract, 2% peptone, 1.
다양한 녹말 및 염소이온 존재 여부에 따른 HPA II의 활성에 대한 반응속도론적 분석(kinetic analysis)을 위하여 호화시킨 녹말을 기질로 하여 0.1-5.0 mg/mL의 범위에서 효소 활성을 측정하였다. 1% 가용성 녹말과 곡류 녹말 용액 500 μL와 100 mM 완충 용액 400 μL를 혼합한 후 100 μL의 희석된 효소액을 넣고 30에서 반응하면서 3, 6, 및 10분 마다 100 μL의 반응액을 취한 후 500 μL의 구리-비신코니네이트 용액을 첨가하여 반응을 정지시키고, 증류수 400 μL를 첨가한 후 80에서 30분간 반응하여 발색시켰다.
라이게이션 반응액을 Escherichia coli TOP10 [F' {proAB, lacIq, lacZΔM15, Tn10 (TetR)} mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), φ80lacZΔM15, lacX74, deoR, recA1, araD139, Δ(ara-leu)7697, galU, galK, rpsL(StrR), endA1, nupG λ-]에 형질전한 한 후, 제오신(zeocin)이 25 μg/mL 함유된 LB 고체배지(1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 1.5% agar)에 도말하여 항생제 내성 형질전환체를 선발하였다.
배양액을 3,000×g, 5 분간 원심분리하여 균체를 회수한 후, BMMY 배지를 이용하여 OD값이 1.0이 되도록 현탁하고, 현탁액 1 mL을 10 mL BMMY 배지에 접종하였다.
복수의 AMY2B 유전자가 삽입된 형질전환체를 선발하기 위하여 형질전환체 선발 시 사용된 농도(0.25 mg/mL) 보다 고농도의 제오신(1 mg/mL)이 함유된 고체배지에 배양하여 자라는 형질전환체를 선발하였다. 고농도의 제오신 배지에서 자란 P.
1). 상기 결과로부터 60시간을 최적 배양 시간으로 결정하였다. 총 1리터 배양액으로부터 1,890 U의 효소가 생산되었으며, Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 통해 약 40%의 수율로 정제되었으며 총 1.
선발된 형질전환체를 배양 후 QIAGEN plasmid miniprep kit (QIAGEN lnc., Valencia, CA, USA)를 이용하여 플라스미드를 회수한 후 제한효소 처리를 통해 재조합 플라스미드 pPICZα-HPAII를 선발하였다.
식품으로부터 섭취되는 곡류 녹말에 대한 HPA II의 기질 특이성을 알아보기 위해서 다양한 곡류 녹말과 약 55% 아밀로오스를 함유하는 고아밀로스 녹말(Hylon-V, Ingredion Korea Inc., Incheon, Korea)을 기질로 하여 효소활성에 대한 반응속도론적 분석(kinetic analysis)를 실시하였다. 염소이온 부재 시 곡류 녹말을 기질로 사용한 경우 전형적인 포화 반응속도 유형(saturation kinetics mode)을 나타내었으나(Fig.
염소이온 존재 시 가용성 녹말을 기질로 사용한 실험 결과 값은 기질 억제 반응속도 식에 맞지 않았기 때문에 억제 상수(K_i) 값을 결정하지 못하고 저농도 구간에서의 반응속도 값만을 이용하여 반응속도 상수만을 구하였으며, 이외의 기질에 대해서는 반응속도 유형에 따른 반응 속도식을 이용하여 반응속도상수와 억제 상수를 구하였다(Table 2). 반응속도상수를 비교하면 염소이온에 따른 곡류 녹말에 대한 K_M값의 변화는 거의 없었으나, 특이하게 가용성 녹말의 경우 염소 이온이 존재할 때 K_M값(0.
0)을 사용하였다. 염소이온이 효소활성에 미치는 영향을 관찰하기 위해서 염화소듐(NaCl)을 0, 1, 2, 5, 및 10 mM을 반응액에 첨가한 후 각 인산소듐 완충용액(pH 6.0-8.0)에서의 효소 활성을 측정하였다.
염이 효소 활성에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 1 mM 염 존재 하에서 효소 활성을 측정하였다(Table 1). 그 결과 염소를 포함하지 않는 염에 의해서는 활성의 변화가 없었으며, 니켈 및 구리 이온을 포함하는 염에 의한 활성 억제가 관찰되었다.
온도에 따른 HPAII 활성 변화를 관찰하기 위하여 인산소듐 완충용액(sodium phosphate buffer, pH 6.0) 조건에서 온도를 20℃에서 60℃ 범위에서 효소 활성을 측정하였다. 완충용액 종류에 따른 HPA II의 활성을 측정하기 위하여 아세트산소듐 완충용액(sodium acetate buffer, pH 4.
원심분리를 통해 배양상등액을 회수한 후 His-Trap® 컬럼(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)이 장착된 AKTA primeTM plus (GE Healthcare)를 이용하여 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 실시하여 정제하였다(20).
재조합 단백질 생산을 위해서 BMGY 배지 [1% yeast extract, 2% peptone, 1.34% Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate and without amino acids (YNB), 4×10-5% biotin, 1% glycerol in 100 mM potassium phosphate, pH 6.0)와 BMMY 배지 (1% yeast extract, 2% peptone, 1.34% YNB, 4×10-5% biotin, 0.5% methanol in 100 mM potassium phosphate, pH 6.0]를 사용하였다.
증폭된 DNA 조각을 PmlI과 SalI으로 절단한 후, 같은 제한효소로 절단한 pPICZα (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 라이게이션하였다.
상기 결과로부터 60시간을 최적 배양 시간으로 결정하였다. 총 1리터 배양액으로부터 1,890 U의 효소가 생산되었으며, Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 통해 약 40%의 수율로 정제되었으며 총 1.8 mg의 정제된 효소를 정제하였다. 정제된 HPA II의 비효소 활성은 409 U/mg으로 결정되었으며, 비효소활성에 근거하여 P.
최적 배양 시간을 결정하기 위하여 배양 후, 12시간 간격으로 시료를 취하여 배양 상층액 내 효소 활성을 측정하였다. 그 결과 36시간까지는 효소활성이 거의 검출되지 않았으나, 48시간 이후로 급격히 효소 생산성이 늘어난 후 60시간에서 최대 효소활성을 나타내었으며 이후로는 오히려 효소활성이 감소하였다(Fig.
상온에서 15분간 냉각한 후 200 μL씩 microplate에 분주하고 plate reader (VersaMax^TM, Molecular device, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 엿당을 표준물질로 하여 사용하여 제작한 표준곡선을 이용하여 환원당 양을 측정하였다.
형질전환 액을 제오신(250 μg/mL)가 함유된 YPD 고체배지(1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose, 1 M sorbitol, 2% agar)에 도말하여 항생제 내성을 보이는 형질전환체를 1차로 선발하였다.
형질전환체를 30 mL 살균수에 현탁한 후, 현탁액 1 mL를 PCR 주형으로 사용하였고, HPA II 유전자의 삽입을 확인하기 위하여 알파인자프라이머(α-factor primer, 5'-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3')와 HPA II 유전자에 결합하는 HPA-seq-rev2 (5'-TTATGTCTCCAGGCCACA-3')을 이용하여 700 bp 크기의 PCR 산물이 증폭되는 형질전환체를 선발하였다.

대상 데이터

AMY2B 유전자(GenBank NM_020978)가 클로닝된 플라스미드 클론 SC113058을 OriGene Technologies, Inc. (Rockville, MD, USA)에서 구입하였다.
04 U/mL의 효소활성이 검출되었다. 따라서 최종 선발된 재조합 P. pastoris는 두 개의 AMY2B 유전자가 삽입되었을 것으로 예상하였으며, 선발된 형질전환체를 이후 HPA II를 생산하는데 사용하였다.

데이터처리

1% 가용성 녹말과 곡류 녹말 용액 500 μL와 100 mM 완충 용액 400 μL를 혼합한 후 100 μL의 희석된 효소액을 넣고 30에서 반응하면서 3, 6, 및 10분 마다 100 μL의 반응액을 취한 후 500 μL의 구리-비신코니네이트 용액을 첨가하여 반응을 정지시키고, 증류수 400 μL를 첨가한 후 80에서 30분간 반응하여 발색시켰다. 각 시간대에 생성된 환원당 양을 바탕으로 직선회귀를 통해 각 기질 농도에서의 반응속도를 측정하고, 측정된 반응속도 결과값을 미하엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 식에 대입한 후 SigmaPlot 프로그램(Systat Software, Chicago, IL, USA)을 이용한 비선형 회귀방법으로 반응속도 상수를 결정하였다. 기질 저해/억제가 나타나는 경우 Haldane 식(22)을 이용하여 반응속도 상수(k_cat 및 K_M)와 억제 상수(K_i)를 결정하였다.

이론/모형

(C) Dependence of rate on corn starch concentration with 10 mM NaCl; (D) Dependence of rate on soluble starch concentration with 10 mM NaCl. Due to the abnormal substrate inhibition mode at high substrate concentrations (closed circles), only the rates at low substrate concentrations (open circles) were fitted to the Michaelis-Menten equation.
각 시간대에 생성된 환원당 양을 바탕으로 직선회귀를 통해 각 기질 농도에서의 반응속도를 측정하고, 측정된 반응속도 결과값을 미하엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 식에 대입한 후 SigmaPlot 프로그램(Systat Software, Chicago, IL, USA)을 이용한 비선형 회귀방법으로 반응속도 상수를 결정하였다. 기질 저해/억제가 나타나는 경우 Haldane 식(22)을 이용하여 반응속도 상수(k_cat 및 K_M)와 억제 상수(K_i)를 결정하였다.
재조합 플라스미드 pPICZα-HPAII를 Lin-Cereghino 등의 방법에 따라서 P. pastoris GS115에 형질전환 하였다(19).

성능/효과

HPA II는 10 mM NaCl까지 농도 의존적으로 효소활성이 증가하였으며, 최적 활성을 위한 pH는 0 mM NaCl 조건에서 pH 6.5이었으나 10 mM NaCl조건에서 pH 7.5로 이동하는 특성을 보였으며, 이는 HPA I을 포함하는 염소이온 의존형 아밀레이스가 나타내는 전형적인 특징이다. 염소이온 존재 시 최적 pH가 염기성 pH 영역으로 이동하는 것은 염소 이온과 효소의 결합에 의해 HPA II의 산/염기 촉매 잔기의 pK_a값이 커진다는 것을 의미하며, 염소이온을 첨가하였을 때 녹말에 대한 가수분해 활성의 증대 정도가 산성 pH 영역보다 염기성 pH 영역에서 두드러지게 나타났다는 점이 이를 뒷받침하였다.
촉매 효율(catalytic efficiency, k_cat/K_M)을 기반으로 기질에 대한 특이성을 살펴보면 옥수수녹말에 대한 기질특이성이 염소이온의 존재여부와 상관없이 가장 우수하였다. 가용성 녹말 에 대한 촉매 효율과 비교해서 다른 곡류 기질의 촉매 효율은 유사하거나 낮은 반면, 옥수수녹말 에 대한 촉매 효율은 염소이온 부재 시 2.16배, 염소이온 존재 시 1.62배 큰 값을 나타내었으며, 이는 다른 기질에 비해 상대적으로 낮은 K_M값(염소이온 존재 혹은 부재 시 각각 0.33 및 0.37 mM)에 기인한 것이다.
가용성 녹말을 기질로 한 활성 측정 결과 최적 온도는 40℃이었으며, 최적 pH는 pH6.5이었다(Fig. 2). 염소이온의 영향을 살펴 보기 위해서 NaCl을 농도 별로 첨가한 결과 최적온도는 염소이온의 증가에 따른 변화가 없었으나(Data not shown), 효소활성의 경우 염소이온의 농도 10 mM까지 농도 의존적으로 증가한 후(Fig.
최적 배양 시간을 결정하기 위하여 배양 후, 12시간 간격으로 시료를 취하여 배양 상층액 내 효소 활성을 측정하였다. 그 결과 36시간까지는 효소활성이 거의 검출되지 않았으나, 48시간 이후로 급격히 효소 생산성이 늘어난 후 60시간에서 최대 효소활성을 나타내었으며 이후로는 오히려 효소활성이 감소하였다(Fig. 1). 상기 결과로부터 60시간을 최적 배양 시간으로 결정하였다.
염이 효소 활성에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 1 mM 염 존재 하에서 효소 활성을 측정하였다(Table 1). 그 결과 염소를 포함하지 않는 염에 의해서는 활성의 변화가 없었으며, 니켈 및 구리 이온을 포함하는 염에 의한 활성 억제가 관찰되었다. 반면 염소이온을 포함하는 염에 의해서는 활성이 증가하였으나, 염화망가니스(MnCl₂)의 경우 염소 이온이 존재함에도 불구하고 효소활성이 70% 수준으로 감소하는 것으로 봐서 망가니즈 이온에 의해서 효소활성이 억제되는 것으로 판단된다.
따라서 2-클로로-4-나이트로페놀(2-chloro-4-nitrophenol)과 같은 좋은 이탈기(leaving group)을 가지는 CNP-G3의 경우 산/염기 촉매 잔기의 프로톤화(protonation) 정도에 덜 민감하므로 염소이온 존재 하에서 전반적인 pH 영역에서 효소 활성이 증가한 반면, 전분을 기질로 하는 경우 pH에 따른 산/염기 촉매 잔기의 프로톤화 정도가 효소 활성에 중요한 영향을 미침으로써 산성 pH 영역(pH 6)에서는 효소활성이 차이가 없었으며, 염기성 pH 영역(pH 8)에서는 효소 활성이 크게 증가한 것으로 보인다.
5로 이동)과 더불어서 전반적인 pH영역(pH 6-8)에서 효소활성 증대가 나타났다(7). 반면 녹말을 기질로 분석한 본 실험에서는 pH 6에서는 거의 활성의 증대가 없었으나, pH 8에서의 효소활성 증대가 크게 나타났다(Fig. 3). Numao 등은 염소 이온 존재에 따른 최적 pH의 증가가 염소 이온의 존재에 따른 산/염기 촉매 잔기의 pK_a값의 증가 때문으로 설명하였다(7).
염소이온 존재 시 최적 pH가 염기성 pH 영역으로 이동하는 것은 염소 이온과 효소의 결합에 의해 HPA II의 산/염기 촉매 잔기의 pK_a값이 커진다는 것을 의미하며, 염소이온을 첨가하였을 때 녹말에 대한 가수분해 활성의 증대 정도가 산성 pH 영역보다 염기성 pH 영역에서 두드러지게 나타났다는 점이 이를 뒷받침하였다. 반응속도론적 분석 결과에 따르면 염소이온 존재 시 효소활성의 증대는 대부분 전환수(turnover number)의 증대에 의한 것으로 나타났으며, 가용성 녹말 보다 곡류 녹말에 대한 전환수의 증대가 크게 나타났다. 염소이온은 활성의 증대뿐만 아니라 고농도의 기질 조건에서 기질에 의한 효소 활성 억제 양상을 심화시키는 것으로 나타났다.
) 값을 결정하지 못하고 저농도 구간에서의 반응속도 값만을 이용하여 반응속도 상수만을 구하였으며, 이외의 기질에 대해서는 반응속도 유형에 따른 반응 속도식을 이용하여 반응속도상수와 억제 상수를 구하였다(Table 2). 반응속도상수를 비교하면 염소이온에 따른 곡류 녹말에 대한 K_M값의 변화는 거의 없었으나, 특이하게 가용성 녹말의 경우 염소 이온이 존재할 때 K_M값(0.44 mg/ mL)이 염소이온이 없을 때 K_M값(1.41 mg/mL)의 30% 수준으로 크게 감소하여 기질에 대한 친화도가 높아졌음을 알 수 있었다. 전환수(turnover number, k_cat)의 경우 곡류녹말에 대한 값은 염소 이온이 존재함에 따라 4.
염소이온이 존재할 경우 고농도의 기질 조건에서 기질에 의한 효소 활성 억제 정도가 증가하는 경향을 나타내었다. 앞서 서술한 바와 같이 염소이온이 존재할 때 가용성녹말에 대한 K_i값은 결정할 수 없었으나, 기질 농도가 1 mg/mL와 2 mg/mL일 때의 반응속도를 비교하면 가장 높은 기질 억제 경향을 나타내었다(Fig. 4D). 또한 염소 이온이 존재할 경우 곡류 녹말에 대한 기질 저해 경향이 나타났으며 K_i값은 6-15 mg/mL 수준이었다(Table 2).
, Incheon, Korea)을 기질로 하여 효소활성에 대한 반응속도론적 분석(kinetic analysis)를 실시하였다. 염소이온 부재 시 곡류 녹말을 기질로 사용한 경우 전형적인 포화 반응속도 유형(saturation kinetics mode)을 나타내었으나(Fig. 4A), 가용성 녹말의 경우 고농도의 기질 조건에서 활성이 저해되는 기질 억제 반응속도 유형(substrate inhibition kinetics mode)을 나타내었다(Fig 4B). 흥미롭게 염소이온이 존재할 경우 곡류 녹말에 대해서도 고농도의 기질 조건에서 기질 억제 반응속도 유형이 관찰되었다(Fig.
반응속도론적 분석 결과에 따르면 염소이온 존재 시 효소활성의 증대는 대부분 전환수(turnover number)의 증대에 의한 것으로 나타났으며, 가용성 녹말 보다 곡류 녹말에 대한 전환수의 증대가 크게 나타났다. 염소이온은 활성의 증대뿐만 아니라 고농도의 기질 조건에서 기질에 의한 효소 활성 억제 양상을 심화시키는 것으로 나타났다. 결론적으로 HPA II의 특징은 HPA I과 거의 유사한 경향을 나타내었으며, 염소이온 첨가여부에 따른 HPA II의 가수분해활성 결과를 바탕으로 향 후 HPA에 대한 곡류 녹말 가수분해 활성 억제제 개발을 위한 연구를 추진할 계획이다.
2). 염소이온의 영향을 살펴 보기 위해서 NaCl을 농도 별로 첨가한 결과 최적온도는 염소이온의 증가에 따른 변화가 없었으나(Data not shown), 효소활성의 경우 염소이온의 농도 10 mM까지 농도 의존적으로 증가한 후(Fig. 3), 그 이상에서는 거의 변화가 나타나지 않았다. 이러한 경향은 HPA I에서도 유사한 결과를 나타내었다(5).
염소이온이 존재할 경우 고농도의 기질 조건에서 기질에 의한 효소 활성 억제 정도가 증가하는 경향을 나타내었다. 앞서 서술한 바와 같이 염소이온이 존재할 때 가용성녹말에 대한 K_i값은 결정할 수 없었으나, 기질 농도가 1 mg/mL와 2 mg/mL일 때의 반응속도를 비교하면 가장 높은 기질 억제 경향을 나타내었다(Fig.
8 mg의 정제된 효소를 정제하였다. 정제된 HPA II의 비효소 활성은 409 U/mg으로 결정되었으며, 비효소활성에 근거하여 P. pastoris를 이용한 재조합 HAP II의 생산성은 배양액 1 L당 4.5 mg이었다.
7배에 불과하였다. 촉매 효율(catalytic efficiency, k_cat/K_M)을 기반으로 기질에 대한 특이성을 살펴보면 옥수수녹말에 대한 기질특이성이 염소이온의 존재여부와 상관없이 가장 우수하였다. 가용성 녹말 에 대한 촉매 효율과 비교해서 다른 곡류 기질의 촉매 효율은 유사하거나 낮은 반면, 옥수수녹말 에 대한 촉매 효율은 염소이온 부재 시 2.
Numao 등은 발색단을 가지는 합성기질인 2-클로로-4-나이트로페닐-α-말토트리오시드(2-chloro-4-nitrophenyl-α-maltotrioside, CNP-G3)를 이용한 분석에서 HPA I의 k_cat/K_M값이 100 mM NaCl 조건까지 증가된다고 보고하였다(5). 최적 pH의 경우 HPA II는 0 mM NaCl 조건에서는 pH 6.5이었던 최적 pH가 염소이온의 농도가 증가할 수록 염기성 영역으로 이동하였으며, 10 mM에서는 pH 7.5가 최적 pH로 측정되었다(Fig. 3). 염소이온 첨가에 따른 최적 pH의 염기성 pH 영역으로의 이동현상은 염소이온 의존형 α-아밀레이스의 일반적인 특성으로 보고되고 있다(7,23).

후속연구

염소이온은 활성의 증대뿐만 아니라 고농도의 기질 조건에서 기질에 의한 효소 활성 억제 양상을 심화시키는 것으로 나타났다. 결론적으로 HPA II의 특징은 HPA I과 거의 유사한 경향을 나타내었으며, 염소이온 첨가여부에 따른 HPA II의 가수분해활성 결과를 바탕으로 향 후 HPA에 대한 곡류 녹말 가수분해 활성 억제제 개발을 위한 연구를 추진할 계획이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	α-아밀레이스가 분해하는 결합은?	1.1)는 녹말의 α-1,4-당사슬 결합을 분해하는 효소이며, 미생물, 식물 및 동물 등 자연계에서 광범위하게 발견되고 있다. α-아밀레이스는 식이를 통해 섭취된 전분/녹말의 효소적 분해를 담당하는 주요 소화효소이며, 인체 췌장에서 분비되는 α-아밀레이스(human pancreatic α-amylase, HPA)의 작용은 식후 혈당 증가와 밀접한 관계가 있으며(1,2), 이러한 이유로 HPA에 대한 억재제와 HPA에 의해 느리게 분해되는 저항녹말의 개발은 기능성 식품 및/과 제약 산업에서의 중요한 관심 분야이다(3,4).
	HPA I과 HPA II의 구조적 차이는?	HPA는 AMY2A와 AMY2B로 명명된 2개의 유전자로부터 발현되는 각각 HPA I과 HPA II로 명명된 2종류의 동질효소(isozyme)가 존재한다(14-16). AMY2B 유전자에서 발현되는 HPA II는 511개의 아미노산 잔기로 구성되어 있으며, HPA I과 동일하게 염소이온 의존적 α-아밀레이스로서 염소이온 결합자리를 구성하는 아미노산 잔기들(HPA I의 R195, N298, 및 R337)이 HPA II에도 보존되어 있으며, 전체적으로 HPA I과는 단지 6개의 아미노산 잔기 만이 다르다. HPA I에 대한 광범위한 연구와 달리 동질효소인 HPA II의 경우 야생형(wild type) 효소와 Saccharomyces cerevisiae를 이용한 재조합 효소를 이용한 기본적인 특성화에 대해서만 연구만이 진행되었을 뿐(17,18), 염소이온 의존적 효소 활성과 천연의 기질인 녹말 가수분해 활성에 대해서는 연구가 진행된 바 없다.
	HPA의 기질 가수분해 메커니즘은?	HPA에 대한 연구는 단백질 구조학적 분석과 변이체 효소에 대한 반응속도론적 분석 등 광범위하게 진행되었다(5-8). HPA는 당-효소 공유결합 중간체(covalent glycosyl-enzyme intermediate)의 형성을 거치는 이중치환 메커니즘(double displacement mechanism)을 통해 기질을 가수분해함으로써 기질의 아노머(anomer) 중심과 가수분해산물의 아노머 중심의 입체화학구조가 동일하도록 유지되는 유지형 글리코시데이스(retaining glycosidase)에 속한다(9,10). 미생물 유래의 α-아밀레이스와는 달리 HPA를 포함하여 고등생물 유래의 α-아밀레이스들은 염소이온을 보조인자(cofactor)로 사용하며, 농도의존적으로 활성화되며, 최적 pH가 염기 쪽으로 이동한다고 보고되어 있다(11-13).

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