인간 단핵구 THP-1의 염증반응 및 장관상피세포와의 상호작용에 미치는 퉁퉁마디 추출물 분획의 영향 Modulation of the inflammatory process and interaction of THP-1 monocytes with intestinal epithelial cells by glasswort (Salicornia herbacea L.) extracts원문보기
본 연구에서는 퉁퉁마디 추출물의 용매 분획을 통해 얻은 Fr.H, Fr.E, Fr.EA, Fr.B, 및 Fr.W, 분획의 인간 단핵구THP-1 세포에 대한 면역조절 활성과 정상 장관계 세포 및 장관계 암세포를 이용하여 면역세포와 장관상피 세포의 상호작용에 미치는 영향을 조사하였다. THP-1 세포는 PMA에 의해 분화가 진행되었으며 분화된 THP-1 세포는 LPS에 의해 활성화되어 COX-2 단백질 발현이 유도 되었다. 퉁퉁마디 분획은 분화된 THP-1 세포에서 COX-2, iNOS, 및 $cPLA_2$ 발현에는 영향을 미치지 않았으나, 분획 중 Fr.E는 LPS에 의해 유도된 COX-2의 발현을 유의적으로 증가시켰다. 분화된 THP-1에서 퉁퉁마디 분획을 처리하여 얻은 배양액은 INT-407 정상 장관계 세포의 성장을 촉진한 반면, HT-29 대장암 세포에는 영향을 미치지 않거나 성장 억제 활성을 나타내었다. THP-1에 LPS를 처리한 배양액은 HT-29 세포의 COX-2 발현을 유도하였으며 이러한 LPS의 효과는 Fr.E의 처리에 의해 억제되었다. 본 연구에서는 면역세포와 장관계 세포 간의 상호작용에 미치는 퉁퉁마디 분획의 영향을 조사하여 이를 통한 면역조절 활성을 나타낼 수 있음을 보였으며, 면역조절 기능성 소재로서의 퉁퉁마디의 이용성 확대를 위한 기본 정보를 제공하고자 하였다.
본 연구에서는 퉁퉁마디 추출물의 용매 분획을 통해 얻은 Fr.H, Fr.E, Fr.EA, Fr.B, 및 Fr.W, 분획의 인간 단핵구 THP-1 세포에 대한 면역조절 활성과 정상 장관계 세포 및 장관계 암세포를 이용하여 면역세포와 장관상피 세포의 상호작용에 미치는 영향을 조사하였다. THP-1 세포는 PMA에 의해 분화가 진행되었으며 분화된 THP-1 세포는 LPS에 의해 활성화되어 COX-2 단백질 발현이 유도 되었다. 퉁퉁마디 분획은 분화된 THP-1 세포에서 COX-2, iNOS, 및 $cPLA_2$ 발현에는 영향을 미치지 않았으나, 분획 중 Fr.E는 LPS에 의해 유도된 COX-2의 발현을 유의적으로 증가시켰다. 분화된 THP-1에서 퉁퉁마디 분획을 처리하여 얻은 배양액은 INT-407 정상 장관계 세포의 성장을 촉진한 반면, HT-29 대장암 세포에는 영향을 미치지 않거나 성장 억제 활성을 나타내었다. THP-1에 LPS를 처리한 배양액은 HT-29 세포의 COX-2 발현을 유도하였으며 이러한 LPS의 효과는 Fr.E의 처리에 의해 억제되었다. 본 연구에서는 면역세포와 장관계 세포 간의 상호작용에 미치는 퉁퉁마디 분획의 영향을 조사하여 이를 통한 면역조절 활성을 나타낼 수 있음을 보였으며, 면역조절 기능성 소재로서의 퉁퉁마디의 이용성 확대를 위한 기본 정보를 제공하고자 하였다.
The glasswort is an edible halophyte demonstrating various physiological effects including anti-inflammatory activity. In the present study, the effects of glasswort extracts on inflammatory events and interactions of THP-1 monocytes with intestinal epithelial cells were investigated. Five solvent f...
The glasswort is an edible halophyte demonstrating various physiological effects including anti-inflammatory activity. In the present study, the effects of glasswort extracts on inflammatory events and interactions of THP-1 monocytes with intestinal epithelial cells were investigated. Five solvent fractions, including the ethylether fraction (Fr.E), were prepared from a 70% methanol extract of glasswort. THP-1 monocytes underwent differentiation by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment and were then activated by lipopolysaccharide (LPS), which induced cyclooxygenase (COX)-2 expression. None of the glasswort fractions tested alone induced COX-2 in differentiated THP-1 cells. Fr.E, however, enhanced LPS-induced COX-2 expression in differentiated THP-1 cells. Culture media of THP-1 cells treated with each fraction stimulated the growth of normal intestinal INT-407 cells more prominently than that of HT-29 colon cancer cells. COX-2 expression in HT-29 cells was inhibited when the cells were exposed to the THP-1 culture medium treated with Fr.E. Thus, glasswort could modulate the interaction between immune cells and intestinal cells.
The glasswort is an edible halophyte demonstrating various physiological effects including anti-inflammatory activity. In the present study, the effects of glasswort extracts on inflammatory events and interactions of THP-1 monocytes with intestinal epithelial cells were investigated. Five solvent fractions, including the ethylether fraction (Fr.E), were prepared from a 70% methanol extract of glasswort. THP-1 monocytes underwent differentiation by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment and were then activated by lipopolysaccharide (LPS), which induced cyclooxygenase (COX)-2 expression. None of the glasswort fractions tested alone induced COX-2 in differentiated THP-1 cells. Fr.E, however, enhanced LPS-induced COX-2 expression in differentiated THP-1 cells. Culture media of THP-1 cells treated with each fraction stimulated the growth of normal intestinal INT-407 cells more prominently than that of HT-29 colon cancer cells. COX-2 expression in HT-29 cells was inhibited when the cells were exposed to the THP-1 culture medium treated with Fr.E. Thus, glasswort could modulate the interaction between immune cells and intestinal cells.
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문제 정의
하지만 이를 규명하기 위한 연구는 거의 진행된 바 없으며 특히 이와 관련한 퉁퉁마디의 연구는 지금까지 전무하다. 따라서 본 연구에서는 면역세포와 장관 상피세포의 상호작용 평가를 위하여 인간 단핵구 THP-1 세포와 정상 장관계 및 장관계 암세포를 이용한 실험시스템의 개발을 모색하고, 퉁퉁마디의 면역세포에 대한 효과와 장관계 세포와의 상호작용에 미치는 영향을 조사하여 포괄적인 면역조절 활성 평가를 시도하였다.
제안 방법
1A). PMA에 의해 분화된 THP-1 세포에 LPS (2 μg/mL), 퉁퉁마디 분획(Fr.H, Fr.E, Fr.EA, Fr.B는 각각 40 μg/mL, Fr.W는 400μg/mL) 또는 LPS와 퉁퉁마디 분획을 같이 처리하여 24시간 후 세포 생존율을 평가하였다. 그 결과 각 분획의 단독처리에 의한 세포 생존율에는 변화가 없었으나, LPS를 처리했을 때는 35%정도 세포 성장 촉진효과가 나타났으며, LPS와 각 분획을 같이 처리했을 경우 LPS 단독처리구와의 세포 생존율 차이는 나타나지 않았다(data not shown).
INT-407 및 HT-29 세포는 96-well plate 또는 6-well plate에서 24시간 배양시켜 준비하고, THP-1에 처리한 배양액과 각 해당 세포의 배지를 1:1로 섞어 24시간 더 처리하였다. THP-1세포에 처리하지 않은 LPS 또는 퉁퉁마디 분획을 동일한 농도와 배지 조건 상에서 제조하고 INT-407 및 HT-29 세포에 처리하여 대조구로 사용하였다. 이 후 MTT assay와 Western blot을 통하여 세포활성 변화와 단백질 발현 변화를 평가하였다.
LPS는 분화된 THP-1를 활성화하며 염증 또는 면역활성화 관련 유전자와 단백질의 발현을 유도하며(21,22), 본 결과에서도 COX-2의 발현 유도를 확인할 수 있었다. 따라서 LPS 및 LPS와 함께 처리한 퉁퉁마디 분획 처리에 의한 THP-1에서의 iNOS, cPLA2, COX-2의 변화를 조사하였다. THP-1에 LPS를 처리하였을 때 NO 생성량은 검출 한도 이하였으며(data not shown), iNOS의 발현 역시 관찰되지 않았다(Fig.
THP-1세포에 처리하지 않은 LPS 또는 퉁퉁마디 분획을 동일한 농도와 배지 조건 상에서 제조하고 INT-407 및 HT-29 세포에 처리하여 대조구로 사용하였다. 이 후 MTT assay와 Western blot을 통하여 세포활성 변화와 단백질 발현 변화를 평가하였다.
특히 발암과정의 진행에 있어서 대식세포가 중요한 역할을 하며, tumor-associated macrophage가 위암 세포의 NF-κB 경로를 활성화하여 혈관형성(angiogenesis)을 유도한다는 결과가 발표되었다 (25). 장관계 세포와 면역세포와의 상호작용에 미치는 퉁퉁마디의 영향을 조사하기 위해, 분화된 THP-1에 퉁퉁마디 분획을 처리하여 얻은 배양액을 정상 장관계 세포주인 INT-407 및 대장암 세포주인 HT-29에 처리하여 세포활성을 조사하였다. 퉁퉁마디 분획을 직접 INT-407과 HT-29 세포에 처리하였을 때, 해당농도에서 HT-29세포에서는 LPS에 의해 약 20%정도, INT-407세포에서 Fr.
대상 데이터
퉁퉁마디 시료는 전남 신안군에 소재한 대신함초(Sinan, Korea) 로부터 구입하였다. 인간 대장암 세포주 HT-29 및 정상장관계 세포주 INT-407는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서, 인간 단핵구 THP-1은 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받았다. Cell lysis buffer는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서, 3-(-4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltertra-zolium bromide (MTT)는 Amresco (Solon, OH, USA)에서 구입하였다.
퉁퉁마디 시료는 전남 신안군에 소재한 대신함초(Sinan, Korea) 로부터 구입하였다. 인간 대장암 세포주 HT-29 및 정상장관계 세포주 INT-407는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서, 인간 단핵구 THP-1은 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받았다.
데이터처리
모든 측정값은 3회 이상 분석하여 평균±표준편차로 나타내었고, 각 실험군별 유의차 분석은 Student’s t-test 또는 일원배치 분산분석(One-way ANOVA)과 Tukey’s HSD test를 실시하여 95% 또는 99%의 유의수준에서 검정하였다.
성능/효과
암세포에서의 COX-2와 그 대사물은 암세포의 사멸 억제와 성장 촉진은 물론 전이 및 신혈관 생성 등의 각종 악성 성질의 획득에 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다(26). HT-29에서의 COX2 발현량의 변화를 측정한 결과, 대조구와 LPS 단독 처리시에는 COX-2의 발현이 미미하였지만, THP-1 세포에 LPS를 24시간 노출시킨 배양액을 처리한 결과 COX-2의 발현이 유도됨을 확인하였다. 그러나 LPS와 지상부 Fr.
그 결과 각 분획의 단독처리에 의한 세포 생존율에는 변화가 없었으나, LPS를 처리했을 때는 35%정도 세포 성장 촉진효과가 나타났으며, LPS와 각 분획을 같이 처리했을 경우 LPS 단독처리구와의 세포 생존율 차이는 나타나지 않았다(data not shown). PMA에 의해 분화된 THP-1 세포에서의 LPS 및 퉁퉁마디 분획에 의한 염증 관련 단백질인 iNOS, cPLA2및 COX-2의 발현량을 조사한 결과, 모든 처리구에서 iNOS의 발현은 검출되지 않았으며 cPLA2 발현량에도 변화가 나타나지 않았다(Fig. 1B).
본 결과는 면역세포에서 분비되는 다양한 cytokine들이 장관계상피 세포의 성장 조절에 관여하며, 단핵구, 대식세포와 같은 면역세포에 대한 퉁퉁마디 성분의 조절 활성이 장관계 세포의 성장 및 COX-2 발현 등의 분자 활성에 영향을 줄 수 있음을 보여준다. 본 연구는 면역세포와 장관상피세포의 상호작용에 미치는 기능성 식품소재의 영향 평가를 위한 가능한 실험시스템과 평가 방법에 대한 접근을 목적으로 이루어졌으며, 향후 상호작용 평가를 위한 정밀한 시스템 개발을 통해 이에 영향을 미치는 각종 cytokine 및 작용 분자들과 활성 성분에 대한 보다 면밀한 검토가 진행되어야 할 것으로 생각된다.
2B). 본 실험 시스템에서 퉁퉁마디 분획은 분화된 THP-1에서의 iNOS와 cPLA2단백질 발현에 영향을 미치지 않았으며, Fr.E은 자체적으로 COX2의 발현에는 영향을 미치지 않으나, LPS에 의해 유도된 COX2 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(Fig. 2B).
후속연구
본 결과는 면역세포에서 분비되는 다양한 cytokine들이 장관계상피 세포의 성장 조절에 관여하며, 단핵구, 대식세포와 같은 면역세포에 대한 퉁퉁마디 성분의 조절 활성이 장관계 세포의 성장 및 COX-2 발현 등의 분자 활성에 영향을 줄 수 있음을 보여준다. 본 연구는 면역세포와 장관상피세포의 상호작용에 미치는 기능성 식품소재의 영향 평가를 위한 가능한 실험시스템과 평가 방법에 대한 접근을 목적으로 이루어졌으며, 향후 상호작용 평가를 위한 정밀한 시스템 개발을 통해 이에 영향을 미치는 각종 cytokine 및 작용 분자들과 활성 성분에 대한 보다 면밀한 검토가 진행되어야 할 것으로 생각된다.
LPS에 의한 자극의 유무는 THP-1으로부터 IL-6를 비롯한 cytokine들의 분비 양상을 변화시켜 장관계 세포의 성장에 상이한 영향을 미치는 것으로 보인다. 이와 같은 장관계 세포성장 조절에 미치는 면역세포로부터 분비된 다양한 cytokine의 영향에 대한 향후 연구가 체계적으로 진행되어야할 것으로 생각된다. 특히 IL-1β 와 TNF-α의 경우 HT-29 세포에서 COX-2의 발현을 촉진하는 것으로 보고되어(28), 분화된 THP-1에 LPS 처리 시 이들 cytokine의 분비가 COX-2의 발현 증가를 유도한 것으로 보인다(Fig.
참고문헌 (28)
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