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제안 방법
- 배양 이후, 커버글라스는 용액 관류 챔버(chamber)에 부착되었다. HEPES buffer (mmole/l, 10 HEPES, 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 1CaCl2, and 10 glucose, pH7.4, 310 mOsm)를 세포에 지속적으로 관류시킴으로써 잔류 Fura2를 씻어내고, 세포를 안정화 시킨 뒤 [Ca2+]i측정을 시작하였다. 세포 내 칼슘이 온의 농도는 340/380 nm dual wavelength를 이용한 excitation과 그로부터 방출된 형광을 510 nm의 필터를 이용하여 측정하였다.
- 증가는 미토콘드리아 및 ER 기능이상 및 세포사멸 관련 유전자의 발현을 유도함으로써 세포독성을 나타낸다[14,15]. hGF-1 세포에의 고농도 Cch 자극에 의한 [Ca2+]i 증가가 세포독성을 유도하는지 확인하기 위하여 세포 내 G6PD의 분비 정도를 측정하였다. hGF-1 세포에 1 mM 농도의 Cch을 처리하고 Figure 2에 표시된 시간만큼 추가 배양하였다.
- gingivalis에 노출되었을 때 세포 내 RANKL 및 osteoprotegerin (OPG) 발현이 조절된다는 보고가 있으며, 이러한 보고들은 치주조직 내 세포들이 치조골 항상성에 직접적으로 연관되어 있음을 나타낸다 [11,12]. 본 연구에서는 AChR의 활성에 의한 인체치은세포(human gingival fibroblast; hGF-1) 내 칼슘증가와 RANKL 발현증가를 나타내고 있다. 따라서 치주세포내 AChR는 항염증 반응 매개뿐만이 아닌, 치조골 항상성 조절인자로서의 역할수행 가능성을 제시한다.
- 4, 310 mOsm)를 세포에 지속적으로 관류시킴으로써 잔류 Fura2를 씻어내고, 세포를 안정화 시킨 뒤 [Ca2+]i측정을 시작하였다. 세포 내 칼슘이 온의 농도는 340/380 nm dual wavelength를 이용한 excitation과 그로부터 방출된 형광을 510 nm의 필터를 이용하여 측정하였다. 각 결과는 Ratio (F340/Fㅇ)값으로 표시되었다.
- 앞선 두 결과는 Cch의 hGF-1세포 자극은 세포 내 [Ca2+]i증가를 조절하며 장시간 자극시 세포염증반응이 아닌 다른 생리활성을 유도함을 나타낸다. 이를 확인하기 위해 hGF-1 세포에 고농도의 Cch를 시간별 처리하고 RT-PCR방법을 통해 RANKL, OPG, IL-6의 발현 정도를 확인하였다. 실험결과, OPG와 IL-6의 발현에는 변화가 관찰되지 않았으나, Cch 자극 후 3시간 이후부터 hGF-1 세포 내 RANKL 발현이 증가됨이 확인되 었다(Figure 3).
- 이후 세포독성은 Vybrant 세포독성 키트(Vybrant® Cytotoxicity assay kit, ThermoFisher Scientific, MA, USA)를 이용하여 제조사에서 제시하는 실험방법에 따라 세포독성을 확인하였다.
- 이후 세포독성은 Vybrant 세포독성 키트(Vybrant® Cytotoxicity assay kit, ThermoFisher Scientific, MA, USA)를 이용하여 제조사에서 제시하는 실험방법에 따라 세포독성을 확인하였다. 전 처리 후, 각 샘플의 배양배지를 새로운 well에 옮긴 후, 배양배지 내 존재하는 glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD)의 활성을 resazurin으로부터 생성되는 resorufln 형광(530/590 nm, Ex/Em)을 측정함으로써 G6PD 분비량(%)을 계산하였다.
- 추출된 mRNA (1 μg)로부터 cDNA를 합성하였으며 각 샘플의 cDNA로부터 primer (IL-6 forward 5'-GAG GCA CTG GCA GAA AAC AA-3', reverse 5'-TTG GGT CAG GGG TGG TTA TT-3'; RANKL forward 5'-GTA CCA TGA TCG GGG TTG GG-3', reverse 5'-CGG ATC CAG TAA GGA GGG GT-3'; GAPDH forward 5'-AGG GCT GCT TTT AAC TCT GGT-3', reverse 5'-CCC CAC TTG ATT TTG GAG GGA-3'; OPG forward 5'-TCA AGC AGG AGT GCA ATC G-3', reverse 5'-AGA ATG CCT CCT CAC ACA GG-3')를 이용하여 유전자 발현의 정도를 확인하였다.
- 증가를 유도하는 것으로 잘 알려져 있다[13]. 치은세포 내 AchR의 생리활성을 알아보기 위해 hGF-1 세포에 Cch을 처리하고 세포질 내 칼슘이온의 농도변화를 측정하였다. Cch은 muscarinic AChR 및 nicotinic AChR를 모두 활성화 시키는 콜린성 작용제(cholinergic agonist)로서, 치은세포 내 AChR 활성화가 [Ca2+]i증가를 유도하는지, 그리고 자극의 정도에 따라 [Ca2+]i증가가 조절되는지를 확인하고자 1 μM부터 1 mM 농도의 Cch를 hGF-1 세포에 처리하였다.
대상 데이터
- 세포배양기에서 배양하였다. Carbachol (Cch)은 Sigma Aldrich (MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- hGF-1 세포는 ATCC (CRL-2014)에서 구입하여 사용하였으며 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 세포배양배지에 10% fetal bovine serum, 100 IU/ml penicillin 및 100 IU/ml streptomycin 첨가한 배지에서 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양하였다.
- hGF-1 세포를 22 x 22 mm 크기의 커버글라스에 분주한 뒤, 다음 날 실험에 사용하였다. 세포배양액에 Fura2/ AM (TEFLabs, TX, USA)를 5 μM의 농도로 첨가한 뒤 세포배양기에서 1시간 동안 배양하였다.
- 추출된 mRNA (1 μg)로부터 cDNA를 합성하였으며 각 샘플의 cDNA로부터 primer (IL-6 forward 5'-GAG GCA CTG GCA GAA AAC AA-3', reverse 5'-TTG GGT CAG GGG TGG TTA TT-3'; RANKL forward 5'-GTA CCA TGA TCG GGG TTG GG-3', reverse 5'-CGG ATC CAG TAA GGA GGG GT-3'; GAPDH forward 5'-AGG GCT GCT TTT AAC TCT GGT-3', reverse 5'-CCC CAC TTG ATT TTG GAG GGA-3'; OPG forward 5'-TCA AGC AGG AGT GCA ATC G-3', reverse 5'-AGA ATG CCT CCT CAC ACA GG-3')를 이용하여 유전자 발현의 정도를 확인하였다. 대조단백으로 GAPDH (house-keeping gene)을 사용하였다.
데이터처리
- 대조군과 실험군의 통계학적 유의성 검사에는 SPSS 14 (SPSS Inc., IL, USA)을 사용하였다. 통계학적 유의성 검증을 위해 one-way ANOVA를 실시하였으며, Tukey’s post hoc test로 사후검정을 실시하였다.
- 통계학적 유의성 검증을 위해 one-way ANOVA를 실시하였으며, Tukey’s post hoc test로 사후검정을 실시하였다.
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