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문제 정의
- 본 연구에서는 수집되거나 직접 제작한 누룩의 전분 분해 효소 활성을 평가하고 전분 분해와 관련된 효소의 활성을 평가하고, 전분 분해 효소 활성이 우수한 곰팡이 균주를 선발하고자 하였다.
제안 방법
- 누룩의 glucoamylase 효소활성. Glucoamylase 효소 활성(SP)은 Choi 등[3]의 방법을 수정하여 사용하였으며, 분쇄한 2.5 g의 누룩을 50 ml의 증류수에 현탁하여 30℃에서 1시간 동안 교반한 후, 여과지(Advantec)로 거른 여과액을 조효소액으로 사용하였다. 가용성 전분(2%, w/v) 20 ml에 2.
- oryzae와 R. oryzase 균주의 α-amylase와 glucoamylase 효소 활성을 조사하기 위하여 2%의 가용성 전분을 탄소원으로 함유한 PDB 배지를 사용하여 25℃에서 24시간 배양한 후 상등액을 회수하여 효소 활성을 측정하였다. 곰팡이 균주 중에서 R.
- 누룩의 α-amylase 효소 활성. α-Amylase 효소 활성은 Park 등[23]의 방법을 수정하여 측정하였다. 분쇄한 0.
- 광주 A, B 누룩의 경우 제조방법은 동일하지만 누룩 제조 시기가 각각 초겨울(2014년 11월)과 여름(2015년 8월)으로 달랐다. 강원도에서 전통방식으로 제조된 누룩을 수집하기 위하여 강원도 춘천시 풍물시장, 정선군 오일장, 양양군 오색 약수장 등 전통시장과 전통주 생산업체를 대상으로 조사하였으나 직접 누룩을 제조하지 않고 다른 지역에서 구매하여 사용하고 있어서 기상청 자료에 근거한 최근 30년간 강릉 지역의 8월 기후를 바탕으로 온도와 습도를 조절하여 누룩을 직접 제조하였다.
- 곰팡이 균주의 동정은 internal transcribed spacer (ITS) 영역을 증폭할 수 있는 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') 및 ITS2 (5'-TCCTCCGCTGATTGATATGC-3') 프라이머[8]를 사용하여 유전자 단편을 증폭한 후 염기서열을 분석하였다. 분석한 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI, USA)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) [1]를 사용하여 기존에 보고된 균주와의 상동성을 근거로 동정하였다.
- 경기도 용인시(3점), 충청남도 예산군(2점), 경상북도 상주시(1점), 광주광역시(2점), 경상남도 창원시(2점), 부산광역시(1점), 제주시(1점) 등 전통방식으로 제작하는 12점의 누룩을 수집하였다. 누룩은 기후, 원료 등에 따라서 다양한 미생물의 종류가 나타나므로[8, 9, 22] 수집된 누룩의 제조 시기, 기간, 원료 등을 조사하였다. 진주 B 누룩은 수분이 12% 이하로 2013년 4월에 제작되었으며, 용인 C와 상주 누룩은 이화주 제조용으로 제작되었다.
- 누룩을 제조할 때 주로 사용하는 원료가 생밀기울이므로 누룩의 당화력은 매우 중요하다[5]. 누룩의 당화력은 주로 glucoamylase 활성을 지표로 나타내므로 전국에서 수집한 누룩과 본 연구에서 직접 제조한 누룩의 glucoamylase 효소 활성을 측정하였다(Fig. 1B).
- 성형한 누룩은 볏짚 위에 올린 후 온도와 습도 조건을 조절한 항온항습기(BioFree, Korea)에서 15일간 배양하였다. 온도와 습도를 조건별로 제작한 누룩을 강원 A−F로 각각 명명하였으며(Table 1), 배양 후 서늘한 곳에서 3일 동안 건조한 후 분쇄기로 분쇄하여 미생물 분리와 효소 활성 측정에 사용하였다.
- 전국에서 수집한 누룩과 본 연구에서 온도와 습도 조건을 달리하여 직접 제조한 누룩의 α-amylase 효소 활성을 측정하였다(Fig. 1A).
대상 데이터
- 전분분해 활성과 밀접한 연관을 갖는 α-amylase와 glucoamylase의 활성이 우수한 것으로 나타난 R. oryzae MBF345 균주를 최종 선발하였다. R.
- oryzae와 R. oryzae 균주 44점을 선발하였다.
- oryzae는 농촌진흥청 농업유전자원센터에서 분양받은 KACC44246 균주를 R. oryzae는 ATCC1026 균주를 대조구 균주로 사용하였다. 효소 활성은 2% (w/v)의 가용성 전분을 함유하고 있는 potato dextrose broth (PDB, BD) 배지에서 24시간 동안 배양한 후 측정하였다.
- A. oryzae는 농촌진흥청 농업유전자원센터에서 분양받은 KACC44246 균주를 R. oryzae는 ATCC1026 균주를 대조구 균주로 사용하였다.
- 경기도 용인시(3점), 충청남도 예산군(2점), 경상북도 상주시(1점), 광주광역시(2점), 경상남도 창원시(2점), 부산광역시(1점), 제주시(1점) 등 전통방식으로 제작하는 12점의 누룩을 수집하였다. 누룩은 기후, 원료 등에 따라서 다양한 미생물의 종류가 나타나므로[8, 9, 22] 수집된 누룩의 제조 시기, 기간, 원료 등을 조사하였다.
- 누룩은 경기도 용인시, 충청남도 예산군, 경상북도 상주시, 광주광역시, 경상남도 진주시, 부산광역시 및 제주시를 포함한 7개 지역에서 수집하거나 배양온도와 습도를 달리하여 직접 제조하였다. 밀(원주농업협동조합, Korea), 물(평창수, Korea) 및 볏짚(Korea)은 구매하여 누룩 제조에 사용하였다.
- 누룩은 경기도 용인시, 충청남도 예산군, 경상북도 상주시, 광주광역시, 경상남도 진주시, 부산광역시 및 제주시를 포함한 7개 지역에서 수집하거나 배양온도와 습도를 달리하여 직접 제조하였다. 밀(원주농업협동조합, Korea), 물(평창수, Korea) 및 볏짚(Korea)은 구매하여 누룩 제조에 사용하였다. 밀은 수돗물로 3회 세척하고 12시간 동안 건조한 후 분쇄기(Hanil, Korea)를 사용하여 분쇄하였다.
- 대부분의 누룩이 밀로 만들어졌으나, 용인 A와 B 누룩은 원료로 쌀을 사용하였으며, 당화력이 우수하여 이양주 등의 청주를 제조하는 누룩으로 판매중이었다. 용인 C 누룩은 찹쌀과 녹두를 원료로 사용하였으며 백수환동주와 이화주를 제조할 때 사용하는 누룩이었다. 광주 A, B 누룩의 경우 제조방법은 동일하지만 누룩 제조 시기가 각각 초겨울(2014년 11월)과 여름(2015년 8월)으로 달랐다.
- 누룩은 기후, 원료 등에 따라서 다양한 미생물의 종류가 나타나므로[8, 9, 22] 수집된 누룩의 제조 시기, 기간, 원료 등을 조사하였다. 진주 B 누룩은 수분이 12% 이하로 2013년 4월에 제작되었으며, 용인 C와 상주 누룩은 이화주 제조용으로 제작되었다. 대부분의 누룩이 밀로 만들어졌으나, 용인 A와 B 누룩은 원료로 쌀을 사용하였으며, 당화력이 우수하여 이양주 등의 청주를 제조하는 누룩으로 판매중이었다.
데이터처리
- 모든 측정은 3회 반복 수행하였으며 측정값은 SPSS (v 20.0 SPSS, IBM, USA)를 사용하여 통계처리 하였으며, 유의성 검증은 일원배치 분산 분석법[28]을 이용하였다.
이론/모형
- 5 N) 용액을 첨가하여 반응을 종결하였다. 누룩의 glucoamylase효소 활성은 55℃에서 누룩 1 g이 가용성 전분 1 g에 작용하여 생성되는 포도당을 기질에 대하여 백분율로 표시하는 것으로 대한민국 국세청 주류 분석규정의 환원당 분석법을 기준으로 정의하였다[24].
- 곰팡이 균주의 동정은 internal transcribed spacer (ITS) 영역을 증폭할 수 있는 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') 및 ITS2 (5'-TCCTCCGCTGATTGATATGC-3') 프라이머[8]를 사용하여 유전자 단편을 증폭한 후 염기서열을 분석하였다. 분석한 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI, USA)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) [1]를 사용하여 기존에 보고된 균주와의 상동성을 근거로 동정하였다.
성능/효과
- 선발한 44점의 곰팡이 균주의 glucoamylase 활성을 측정하였는데(Fig. 3B) MBF345 균주의 활성이 4,911.8 ± 48.1 SP로 가장 우수하였고, MBF324 (4,595.4 ± 33.3 SP), MBF375 (4,556.7 ± 33.8 SP) 균주의 순서로 나타났다. A.
- oryzae ATCC10260 균주와 A. oryzae KACC44246 균주는 각각 21,191.0 ± 621.5 units/mg protein과 13,832.5 ± 1,627.4 units/mg protein의 α-amylase 효소 활성을 나타냈다. R.
- oryzae ATCC10260 균주와 A. oryzae KACC44246 균주는 각각 3,510.7 ± 150.9 SP와 322.9 ± 18.0 (SP)로 나타났다. MBF191, MBF222, MBF257, MBF348, MBF351, MBF354 MBF366 및 MBF372 등의 낮은 glucoamylase 효소 활성을 나타낸 균주들은 대부분 A.
- R. oryzae MBF345 균주가 대조구와 비교하여 1.7배 높은 효소 활성을 나타냈으며, 상대적으로 낮은 효소 활성을 나타낸 MBF190, MBF191, MBF257 및 MBF363 균주들은 A. oryzae로 확인되었다.
- 곰팡이 균주 중에서 R. oryzae MBF345가 36,724.9 ± 10.2 units/mg protein으로 가장 우수한 α-amylase 효소 활성을 나타냈으며, MBF333 균주는 32,090.8 ± 527.7 units/mg protein으로 두번째로 높은 α-amylase 효소 활성을 나타냈다(Fig. 3A).
- oryzae 균주는 26점, R. oryzae 균주는 18점으로 나타났으며, 이외에도 Mucor circinelloides, Syncephalastrum monosporum, Syncephalastrum racemosum, Aspergillus flavus, Aspergillus tereus 등의 균주가 동정되었다. Rhizopus 속 곰팡이는 누룩으로부터 비교적 분리가 쉽고, 균주의 생육 속도 및 효소 생성도가 높으며[4], Aspegillus는 증자한 쌀에서 성장이 용이하며 강력한 전분 당화효소를 생산하는 것으로 알려져 있다[6].
- A. oryzae 균주로 동정된 MBF222 (59.7 ± 0.9 SP) 및 MBF257 (152.9 ± 0.8 SP) 균주는 상대적으로 낮은 glucoamylase 효소 활성을 나타냈다. 대조구로 사용한 R.
- 7배 높은 효소 활성을 나타냈으며, 상대적으로 낮은 효소 활성을 나타낸 MBF190, MBF191, MBF257 및 MBF363 균주들은 A. oryzae로 확인되었다.
- 충청남도 예산의 두 지역에서 수집된 누룩은 전반적으로 전분의 액화력보다는 당화력이 상대적으로 우수한 것으로 나타났으며, 광주광역시에 수집된 누룩의 경우는 당화력보다는 액화력이 상대적으로 우수하였다. 강원 E 누룩은 641.6 ± 35.7 SP로 가장 우수한 glucoamylase 효소 활성을 나타냈으며, 진주 B (615.1 ± 13.1 SP), 강원 C (586.5 ± 4.7 SP), 예산 A (586.5 ± 19.7 SP) 누룩의 순으로 나타났다. 강원B 누룩의 경우, α-amylase와 glucoamylase 효소 활성이 모두 나타나지 않은 반면, 강원 C 누룩은 배양 온도만 차이 났음에도, 우수한 α-amylase와 glucoamylase 효소 활성을 나타냈다.
- 7 SP) 누룩의 순으로 나타났다. 강원B 누룩의 경우, α-amylase와 glucoamylase 효소 활성이 모두 나타나지 않은 반면, 강원 C 누룩은 배양 온도만 차이 났음에도, 우수한 α-amylase와 glucoamylase 효소 활성을 나타냈다. 따라서, 누룩을 배양하는 온도가 미생물군의 분포에 매우 큰 영향을 미친 것으로 추정된다.
- 1A). 경기도 용인시에서 수집한 누룩 C와 강원 B, 강원 D, 강원 F 누룩에서는 α-amylase 효소 활성이 거의 나타나지 않았으며, 예산 A 누룩이 4,233.9 ± 662.0 units/mg protein으로 가장 낮은 활성을 나타냈다. 상대습도 40%, 30℃에서 15일간 배양한 강원 C 누룩이 가장 높은 α-amylase 효소 활성(24,747.
- 0 units/mg protein) 보다 상대적으로 낮게 나타났다. 경상남도 진주에서 수집된 누룩의 효소 활성으로부터 동일지역에서 제조된 누룩도 제조시기에 따라 효소 활성의 차이가 크다는 것을 알 수 있었다. 또한 경기도 용인시에서 수집한 누룩의 효소 활성을 근거로 비슷한 지역과 시기에 제작된 누룩도 사용 원료에 따라 효소 활성이 유의적으로 상이한 것으로 나타났다[18].
- 강원B 누룩의 경우, α-amylase와 glucoamylase 효소 활성이 모두 나타나지 않은 반면, 강원 C 누룩은 배양 온도만 차이 났음에도, 우수한 α-amylase와 glucoamylase 효소 활성을 나타냈다. 따라서, 누룩을 배양하는 온도가 미생물군의 분포에 매우 큰 영향을 미친 것으로 추정된다. 또한, 기존의 연구보고에 따르면, 원료의 종류[18], 수분 첨가율[15], 배양 온도[17]에 의해서 누룩의 전분 분해 효소활성이 변화하는 것을 확인하였으나, 두 가지 이상의 조건을 동시에 조절하여 누룩의 효소 활성을 조사한 연구는 여전히 미흡한 것으로 판단된다.
- 0 units/mg protein으로 가장 낮은 활성을 나타냈다. 상대습도 40%, 30℃에서 15일간 배양한 강원 C 누룩이 가장 높은 α-amylase 효소 활성(24,747.1 ± 777.7 units/mg protein)을 나타냈으며, 그 다음으로 용인A 누룩이 21,382.4 ± 1583.0 units/mg protein으로 우수한 활성을 나타냈다. 광주광역시에서 수집된 A, B 누룩의 경우, 동일한 재료와 방법으로 제조되었으나 2015년 8월에 제작한 광주 B 누룩의 α-amylase 효소 활성이 6,799.
- 또한, 기존의 연구보고에 따르면, 원료의 종류[18], 수분 첨가율[15], 배양 온도[17]에 의해서 누룩의 전분 분해 효소활성이 변화하는 것을 확인하였으나, 두 가지 이상의 조건을 동시에 조절하여 누룩의 효소 활성을 조사한 연구는 여전히 미흡한 것으로 판단된다. 이상의 결과를 바탕으로 같은 지역에서도 누룩을 제조하는 원료, 시기 및 방법이 누룩의 전분 분해력에 매우 큰 영향을 미치는 것으로 판단하였다.
- 전분 분해력이 우수한 곰팡이 균주를 선발하기 위하여 전분 분해력이 우수한 강원 C 누룩으로 부터 98점의 곰팡이 균주를 분리하고 동정하였다(Fig. 2).
- 전분분해 활성과 밀접한 연관을 갖는 α-amylase와 glucoamylase의 활성이 우수한 것으로 나타난 R. oryzae MBF345 균주를 최종 선발하였다.
- 1B). 제조시기가 8월인 광주 B 누룩과 배양온도 25℃, 상대습도 40%에서 제조된 강원 B 누룩에서는 glucoamylase 활성이 나타나지 않았으며, 광주 A 누룩은 7.9 ± 0.9 SP, 상주 누룩은 39.1 ± 1.9 SP로 다른 누룩들과 비교하여 유의적으로 낮은 glucoamylase 효소 활성을 나타냈다. 충청남도 예산의 두 지역에서 수집된 누룩은 전반적으로 전분의 액화력보다는 당화력이 상대적으로 우수한 것으로 나타났으며, 광주광역시에 수집된 누룩의 경우는 당화력보다는 액화력이 상대적으로 우수하였다.
- 9 SP로 다른 누룩들과 비교하여 유의적으로 낮은 glucoamylase 효소 활성을 나타냈다. 충청남도 예산의 두 지역에서 수집된 누룩은 전반적으로 전분의 액화력보다는 당화력이 상대적으로 우수한 것으로 나타났으며, 광주광역시에 수집된 누룩의 경우는 당화력보다는 액화력이 상대적으로 우수하였다. 강원 E 누룩은 641.
후속연구
- oryzae 균주는 A. oryzae 균주와 달리 생전분을 분해하는 활성이 매우 우수하며[10] 우리나라 전통 발효제인 누룩에서 발견되는 산업적으로 이용 가능성이 매우 유망한 균주로서, 향후 유전체, 전사체 및 대사체 차원의 연구가 필요할 것으로 판단된다.
- 누룩을 제조하는 환경과 조건에 따라서 미생물의 분포와 대사체 등이 변화한다는 연구결과가 보고된 바 있으므로[4, 20], 누룩의 배양온도와 습도의 차이가 효소 활성의 차이를 나타내는 원인으로 추정된다. 따라서 사용하는 원료와 시기에 따라 누룩에 분포하는 미생물군의 차이에 대한 보다 체계적인 연구가 수반되어야할 것으로 사료된다.
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