사람과 어류에게 감염증을 유발하는 Edwardsiella sp., Streptococcus sp. 및 Vibrio sp. 의 해양 유해세균에 대한 해조류 추출물의 항균 활성을 조사하였다. 연구에 사용된 4종의 식용 해조류 중에서 감태 MeOH 추출물이 본 연구에서 사용 된 6종의 모든 해양 유해세균에 대해 넓은 범위의 항균 활성을 나타내었다. 감태의 MeOH 추출물의 유기용매 분획 추출물들 중에서, EtOAc 분획 추출물이 가장 높은 항균활성을 나타내었으며 6종의 해양 유해세균에 대하여 $128{\mu}g/mL$에서 $256{\mu}g/mL$의 MIC 값을 나타내었다. 또한, HPLC 분석에 의해 감태 EtOAc 분획 추출물에 phlorotannin 화합물인 dieckol이 다량 존재하고 있는 것이 확인 되었다. 결론적으로, 감태 추출물의 phlorotannin 화합물이 여러 유해세균에 대한 강한 항균활성을 나타내는 것처럼, 해양 유해세균에 대해서도 강한 항균활성을 나타내는 것으로 판단된다.
사람과 어류에게 감염증을 유발하는 Edwardsiella sp., Streptococcus sp. 및 Vibrio sp. 의 해양 유해세균에 대한 해조류 추출물의 항균 활성을 조사하였다. 연구에 사용된 4종의 식용 해조류 중에서 감태 MeOH 추출물이 본 연구에서 사용 된 6종의 모든 해양 유해세균에 대해 넓은 범위의 항균 활성을 나타내었다. 감태의 MeOH 추출물의 유기용매 분획 추출물들 중에서, EtOAc 분획 추출물이 가장 높은 항균활성을 나타내었으며 6종의 해양 유해세균에 대하여 $128{\mu}g/mL$에서 $256{\mu}g/mL$의 MIC 값을 나타내었다. 또한, HPLC 분석에 의해 감태 EtOAc 분획 추출물에 phlorotannin 화합물인 dieckol이 다량 존재하고 있는 것이 확인 되었다. 결론적으로, 감태 추출물의 phlorotannin 화합물이 여러 유해세균에 대한 강한 항균활성을 나타내는 것처럼, 해양 유해세균에 대해서도 강한 항균활성을 나타내는 것으로 판단된다.
The object of this study was to evaluate antibacterial activity of edible seaweed extracts against marine bacterial pathogens including Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae, Streptococcus parauberis, Vibrio anguillarum, Vibiro harveyi and Vibrio scophthalm, which are associated with human or fish...
The object of this study was to evaluate antibacterial activity of edible seaweed extracts against marine bacterial pathogens including Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae, Streptococcus parauberis, Vibrio anguillarum, Vibiro harveyi and Vibrio scophthalm, which are associated with human or fish infectious disease. Ecklonia cava methanolic extract showed a strong and broad spectrum antibacterial activity against marine bacterial pathogens used in this study. Among solvent-soluble fractions of the E. cava extract, the ethyl acetate (EtOAc) soluble fraction showed the strongest antibacterial activity against marine bacterial pathogens tested in this study with MIC in the range of $128-256{\mu}g/mL$. Furthermore, HPLC analysis revealed that the soluble fraction contains abundant dieckol, a phlorotannin compound, compared to other solvent soluble fractions, suggesting that phlorotannins including dieckol would be a key antibacterial agent against marine bacterial pathogens.
The object of this study was to evaluate antibacterial activity of edible seaweed extracts against marine bacterial pathogens including Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae, Streptococcus parauberis, Vibrio anguillarum, Vibiro harveyi and Vibrio scophthalm, which are associated with human or fish infectious disease. Ecklonia cava methanolic extract showed a strong and broad spectrum antibacterial activity against marine bacterial pathogens used in this study. Among solvent-soluble fractions of the E. cava extract, the ethyl acetate (EtOAc) soluble fraction showed the strongest antibacterial activity against marine bacterial pathogens tested in this study with MIC in the range of $128-256{\mu}g/mL$. Furthermore, HPLC analysis revealed that the soluble fraction contains abundant dieckol, a phlorotannin compound, compared to other solvent soluble fractions, suggesting that phlorotannins including dieckol would be a key antibacterial agent against marine bacterial pathogens.
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문제 정의
하지만, 사람에 대한 감염증 및 어류 양식에 막대한 피해를 유발하는 해양 유해세균들에 대한 해조류 유래 물질의 항균활성에 대한 연구는 미미한 편이다13,17). 이에 본 연구에서는 항생제 등의 화학요법제를 대체 할 수 있는 가능성을 검토하기 위하여 가격이 저렴하고 쉽게 구입할 수 있는 해조류를 이용하여 인체 감염증과 어류 양식 산업에 큰 피해를 가지고 오는 대표적인 해양 유해세균에 대한 해조류의 항균활성을 평가하였다.
또한 식중독 등을 유발하는 병원성 세균들에 대한 대황(Eisenia bicyclis) 추출물의 항균활성 연구에서도 본 연구에서 얻어진 결과와 마찬가지로 EtOAc 분획물에서 가장 뛰어난 활성을 보고하였고, 대황 EtOAc 분획 추출물에 다량으로 함유되어 있는 phlorotannins 화합물이 항균활성과 관련된 주요 물질이라고 보고되었다20). 이에 본 연구에서도 감태 MeOH 추출물 및 유기용매 분획 추출물에서 해양 유해세균들에 대한 항균활성 성분을 파악하기 위하여 HPLC 분석을 실시하였다. 감태 추출물에서 활성물질을 분석하기 위해 이전의 연구에서 감태로부터 분리 정제한 5종의 phlorothanin 화합물(eckol, eckstolonol, dieckol, phloroglucinol; triphlorethol-A)을 대조구로 사용하여 HPLC 분석 조건을 확립하였다(Fig.
이에 해양 유해세균의 제어를 위해 사용되는 항생제 등의 화학적 요법을 대체할 수 있는 친환경소재로서 감태 메탄올 추출물의 가능성과 그 항균 특성을 조사하기 위하여 유기용매를 이용하여 분획하고 각 유기용매 분획 추출물의 항균활성을 측정하였다. Table 2에 나타낸 것처럼 여러 유기용매 분획 추출물 중 EtOAc 분획 추출물이 disk diffusion assay에서 해양 유해세균들에 대해 가장 강력한 항균활성을 나타냈다.
가설 설정
b)no detected antibacterial activity.
제안 방법
이에 본 연구에서도 감태 MeOH 추출물 및 유기용매 분획 추출물에서 해양 유해세균들에 대한 항균활성 성분을 파악하기 위하여 HPLC 분석을 실시하였다. 감태 추출물에서 활성물질을 분석하기 위해 이전의 연구에서 감태로부터 분리 정제한 5종의 phlorothanin 화합물(eckol, eckstolonol, dieckol, phloroglucinol; triphlorethol-A)을 대조구로 사용하여 HPLC 분석 조건을 확립하였다(Fig. 1).
감태에서 분리 정제된 5종의 phlorotannin 화합물과 감태 추출물을 C18 reverse-phase column (Shiseido SG300A, 4.6 × 250 mm; Shiseido, Japan)과 Hitachi 2000 series HPLC system (Hitachi Tech, Japan)을 사용하여 분석하였다.
배양시간이 지나면 억제환의 지름을 측정하여 항균활성을 평가한다. 모든 평가는 3회 진행하였고 중간 값을 결과로 제시하였다.
, Tokyo, Japan) 로 농축시켰다14). 유기 용매를 이용한 추출을 위하여서는 농축된 메탄올 추출물(76.3 g)에 1L의 10% 메탄올을 넣고 차례로 1.0L의 n-hexane (Hexane), dichloromethane (DCM), ethyl acetate (EtOAc) 그리고 n-butanol (BuOH)로 3회 추출 분획하고, 각 분획물을 진공상태인 45℃에서 진공회전농축기(Eyela Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 증발시켰다14).
해양 유해세균에 대한 감태 추출물의 항균활성에 대한 후속 연구를 위해 유기용매를 이용하여 분획을 하였고, 분획층 중에서 EtOAc 분획 추출물이 disc diffusion assay에서 본 연구에 사용된 6종의 해양 유해세균에 대해 가장 높은 항균활성을 나타내었다(Table 2). 이에 감태 EtOAc 분획 추출물의 항균효과를 보다 정확하게 평가하기 위해 MIC assay를 이용하여 항균활성을 정량적으로 분석 하였다. Table 3에 나타낸 것처럼 6종의 해양 유해세균들에 대한 감태 EtOAc 분획 추출물의 MIC 값은 128 µg/mL에서 256 µg/mL로 나타났으며 상대적으로 Vibirio sp.
해조류 추출물의 MIC는 Mueller Hinton broth (MHB, Difco)에서 단계적으로 희석한 추출물을 넣고 37℃에서 20-24시간 배양 후 미생물의 생육억제 정도를 시각적으로 판정하였다. 해조류 추출물의 MIC값은 two-fold serial dilution method법에 의해 판정하였다.
대상 데이터
Streptococcus parauberis KCTC 3651와 Streptococcus iniae KCTC 3657는 Trypicase Blood Agar(TBA; Difco, Detroit, MI)에 접종하여 24시간 동안 30℃에 배양 시킨 후 전형적인 균 집락을 2% NaCl이 첨가된 Brain Heart Infusion (BHI, Difco) agar에 2회 계대 배양시킨 후 사용하였다. Edwardsiella tarda KCTC 12267는 Xylose Lysine Desoxycholate (XLD, Difco)에 접종하여 24 시간 동안 30℃에 배양 시킨 후 전형적인 균 집락을 2% NaCl이 첨가된 BHI agar에 2회 계대 배양시킨 후 사용하였다. Vibrio anguillarum KCTC 2711, Vibiro harveyi KCTC 12724 그리고 Vibrio scophthalmi CECT 5965는 2% NaCl이 첨가된 BHI agar에 접종하여 48시간 동안 30℃에 2회 계대 배양시킨 후 사용하였다.
본 연구에서 사용한 균주는 그람 양성균 2종과 그람 음성균 4종으로 한국미생물자원센터[Korean Collection for Type Cultures (KCTC), Daejeon, Korea]와 Colección Española de Cultivos Tipo (CECT)에서 분양 받은 균주를 사용하였다. Streptococcus parauberis KCTC 3651와 Streptococcus iniae KCTC 3657는 Trypicase Blood Agar(TBA; Difco, Detroit, MI)에 접종하여 24시간 동안 30℃에 배양 시킨 후 전형적인 균 집락을 2% NaCl이 첨가된 Brain Heart Infusion (BHI, Difco) agar에 2회 계대 배양시킨 후 사용하였다. Edwardsiella tarda KCTC 12267는 Xylose Lysine Desoxycholate (XLD, Difco)에 접종하여 24 시간 동안 30℃에 배양 시킨 후 전형적인 균 집락을 2% NaCl이 첨가된 BHI agar에 2회 계대 배양시킨 후 사용하였다.
Edwardsiella tarda KCTC 12267는 Xylose Lysine Desoxycholate (XLD, Difco)에 접종하여 24 시간 동안 30℃에 배양 시킨 후 전형적인 균 집락을 2% NaCl이 첨가된 BHI agar에 2회 계대 배양시킨 후 사용하였다. Vibrio anguillarum KCTC 2711, Vibiro harveyi KCTC 12724 그리고 Vibrio scophthalmi CECT 5965는 2% NaCl이 첨가된 BHI agar에 접종하여 48시간 동안 30℃에 2회 계대 배양시킨 후 사용하였다.
실험에 사용한 해조류는 안전성이 검증된 식용 갈조류(곰피, Ecklonia stolonifera; 다시마, Saccharina japonica; 미역, Undaria pinnatifida)를 기장 등의 재래시장에서 구입하여 각 실험에 사용하였다. 감태(Ecklonia cava)의 경우에는 2014년 11월부터 2015년 4월에 걸쳐 제주도 해역에서 채집한 것으로 제주대학교 전유진 교수로부터 시료를 받아 사용하였다.
본 연구에서 사용한 균주는 그람 양성균 2종과 그람 음성균 4종으로 한국미생물자원센터[Korean Collection for Type Cultures (KCTC), Daejeon, Korea]와 Colección Española de Cultivos Tipo (CECT)에서 분양 받은 균주를 사용하였다.
6 × 250 mm; Shiseido, Japan)과 Hitachi 2000 series HPLC system (Hitachi Tech, Japan)을 사용하여 분석하였다. 분석에 사용된 이동상 용매는 물과 메탄올을 사용하였고 초기에 10%의 메탄올을 함유하고 있는 물 용액(water with 10% methanol, v/v)을 분당 0.8 mL의 유속으로 흘려주면서 50분 후에는 100% 메탄올을 함유하는 이동상이 되도록 조절하여 230 nm에서 측정하였다.
실험에 사용한 해조류는 안전성이 검증된 식용 갈조류(곰피, Ecklonia stolonifera; 다시마, Saccharina japonica; 미역, Undaria pinnatifida)를 기장 등의 재래시장에서 구입하여 각 실험에 사용하였다. 감태(Ecklonia cava)의 경우에는 2014년 11월부터 2015년 4월에 걸쳐 제주도 해역에서 채집한 것으로 제주대학교 전유진 교수로부터 시료를 받아 사용하였다.
이론/모형
인체 감염증 및 어류 양식에 큰 피해를 초래하는 해양 유래 유해세균 6종에 대한 해조류 메탄올 추출물의 항균력을 disk diffusion assay를 이용하여 평가하였다. Table 1에 나타낸 것처럼 본 연구에 사용된 4종의 해조류 중 감태가 해양 유해세균에 대해 항균활성이 가장 좋았으며, 5 mg의 감태 메탄올 추출물은 본 연구에 사용된 6종의 모든 해양 유해세균에 대해 12-18 mm의 clear zone을 형성하는 것으로 나타났다.
해조류 추출물로부터 물질을 식별하기 위해 이전에 기술한 방법에 따라 high performance liquid chromatography(HPLC) 분석을 실시 하였다18). 감태에서 분리 정제된 5종의 phlorotannin 화합물과 감태 추출물을 C18 reverse-phase column (Shiseido SG300A, 4.
해조류 추출물의 MIC는 Mueller Hinton broth (MHB, Difco)에서 단계적으로 희석한 추출물을 넣고 37℃에서 20-24시간 배양 후 미생물의 생육억제 정도를 시각적으로 판정하였다. 해조류 추출물의 MIC값은 two-fold serial dilution method법에 의해 판정하였다. 모든 평가는 3회 진행하였고 중간 값을 결과로 제시하였다.
해조류 추출액의 항균활성은 disk diffusion assay를 이용한 정성적인 방법과 minimum inhibitory concentration (MIC) assay를 이용한 정량적인 방법으로 측정하였다14). 정성적인 항균활성은 대상 균주를 Tryptic Soy Broth (TSB, Difco; Streptococcus sp.
성능/효과
하지만, EtOAc 분획 추출물 이외에는 모든 해양 유래 세균들에 대해 항균활성을 나타나지는 않았다. BuOH 분획 추출물은 4종의 해양 유해세균(E. tarda, V. anguillarum, V. scophthalmi 및 S. iniae)에 그리고 물 분획 추출물은 1종의 해양 유해세균(S. iniae)에 대한 항균활성을 나타내었으나 Hexane 및 DCM 분획 추출물의 경우 항균활성이 나타나지 않았다. 이러한 결과는 해양 갈조류 추출물들의 EtOAc 분획 추출물이 다양한 병원균에 대해 가장 뛰어난 항균활성을 나타낸다는 다른 연구자들의 연구 일치하였고 이는 감태 EtOAc 분획 추출물에 해양 유해 세균들에 대해 항균활성을 나타내는 물질이 다량 함유하고 있기 때문으로 판단된다13,14,15,16).
인체 감염증 및 어류 양식에 큰 피해를 초래하는 해양 유래 유해세균 6종에 대한 해조류 메탄올 추출물의 항균력을 disk diffusion assay를 이용하여 평가하였다. Table 1에 나타낸 것처럼 본 연구에 사용된 4종의 해조류 중 감태가 해양 유해세균에 대해 항균활성이 가장 좋았으며, 5 mg의 감태 메탄올 추출물은 본 연구에 사용된 6종의 모든 해양 유해세균에 대해 12-18 mm의 clear zone을 형성하는 것으로 나타났다. 감태와 같은 속의 갈조류인 곰피 메탄올 추출물의 경우에도 다른 연구자들의 보고와 유사하게 우수한 항균활성을 가지고 있는 것으로 나타났으나 본 연구에 사용된 모든 해양유해세균에 대한 항균 효과는 나타나지 않았다19).
감태의 MeOH 추출물과 각 유기용매 분획물의 HPLC 분석 결과, phlorotannin계열 화합물인 diekcol이 MeOH 추출물과 EtOAc 분획 추출물에 다량으로 존재하는 것이 확인 되었다(Fig. 2). Dieckol은 대황, 감태 및 곰피 등의 갈조류의 EtOAc추출물에서 많이 관찰되며 다양한 식중독 세균, 부패세균에 대해 강한 항균활성을 나타낸다고 보고되었다18,19,20).
하지만 그 외의 해조류 추출물들은 일부의 해양 유해세균에 대해서만 항균활성을 나타내었고 감태 추출물보다 항균활성은 미약한 것으로 판단되었다. 이러한 결과는 본 연구에서 사용한 감태 메탄올 추출물에 다른 해조류보다 본 연구에 사용된 해양 유해세균들에 대한 항균물질을 보다 많이 함유하고 있다는 것을 의미한다13,14,15).
이상의 결과를 종합하여 판단해 보면, 감태의 EtOAc 분획물이 해양유래 유해세균에 대해 강한 항균 활성을 나타내는 이유 중의 하나는 다양한 병원성 세균에 대해 항균활성을 가지고 있는 것으로 알려진 dieckol 등의 phlorotannin 화합물들을 함유하고 있다는 것이다. 즉, 감태 유래의 phlorotannin 화합물들이 해양 유래 유해세균에 대해서도 강한 항균활성을 나타내는 것으로 판단되며, 이를 보다 명백히 하기 위해서는 향후 정제된 phlorotannin 화합물들을 이용한 MIC 등과 같은 항균활성 평가 연구가 필요할 것으로 판단된다.
감태와 같은 속의 갈조류인 곰피 메탄올 추출물의 경우에도 다른 연구자들의 보고와 유사하게 우수한 항균활성을 가지고 있는 것으로 나타났으나 본 연구에 사용된 모든 해양유해세균에 대한 항균 효과는 나타나지 않았다19). 하지만 그 외의 해조류 추출물들은 일부의 해양 유해세균에 대해서만 항균활성을 나타내었고 감태 추출물보다 항균활성은 미약한 것으로 판단되었다. 이러한 결과는 본 연구에서 사용한 감태 메탄올 추출물에 다른 해조류보다 본 연구에 사용된 해양 유해세균들에 대한 항균물질을 보다 많이 함유하고 있다는 것을 의미한다13,14,15).
해양 유해세균에 대한 감태 추출물의 항균활성에 대한 후속 연구를 위해 유기용매를 이용하여 분획을 하였고, 분획층 중에서 EtOAc 분획 추출물이 disc diffusion assay에서 본 연구에 사용된 6종의 해양 유해세균에 대해 가장 높은 항균활성을 나타내었다(Table 2). 이에 감태 EtOAc 분획 추출물의 항균효과를 보다 정확하게 평가하기 위해 MIC assay를 이용하여 항균활성을 정량적으로 분석 하였다.
후속연구
이상의 결과를 종합하여 판단해 보면, 감태의 EtOAc 분획물이 해양유래 유해세균에 대해 강한 항균 활성을 나타내는 이유 중의 하나는 다양한 병원성 세균에 대해 항균활성을 가지고 있는 것으로 알려진 dieckol 등의 phlorotannin 화합물들을 함유하고 있다는 것이다. 즉, 감태 유래의 phlorotannin 화합물들이 해양 유래 유해세균에 대해서도 강한 항균활성을 나타내는 것으로 판단되며, 이를 보다 명백히 하기 위해서는 향후 정제된 phlorotannin 화합물들을 이용한 MIC 등과 같은 항균활성 평가 연구가 필요할 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
사람과 해양동물에게 질병을 유발하는 유해 세균들은 무엇이 있는가?
해양 유래세균들 중에는 해산물의 부패를 유발하는 것 뿐만 아니라 사람과 해양동물에게 질병을 유발하는 유해 세균들이 많이 있다. 그 중 Edwardsiella sp., Streptococcus sp. 및 Vibrio sp.의 일부 세균은 종종 사람에게 감염증을 유발할 뿐만 아니라 어류 질병을 유발하는 유해세균이다1,2). 특히, 어류 질병을 유발하는 세균들의 경우에는 양식산업에 막대한 영향을 미치며, 2010년에서 2013년의 제주도 주요 양식어종인 넙치의 세균성 질병 발생률은 Vibrio sp.
2010년에서 2013년의 제주도 주요 양식어종인 넙치의 세균성 질병 발생률은 어떻게 되는가?
의 일부 세균은 종종 사람에게 감염증을 유발할 뿐만 아니라 어류 질병을 유발하는 유해세균이다1,2). 특히, 어류 질병을 유발하는 세균들의 경우에는 양식산업에 막대한 영향을 미치며, 2010년에서 2013년의 제주도 주요 양식어종인 넙치의 세균성 질병 발생률은 Vibrio sp.와의 혼합감염이 38.7%로, Streptococcus sp. 29%, 그리고 Edwardsiella sp. 9.6% 인 것으로 보고 되고 있다3). 질병에 의한 피해는 폐사에 따른 생산량의 감소뿐만 아니라 치료를 위한 항생제 등의 화학약품 사용 증가로 항생제잔류 및 항생제 내성균의 증가를 초래한다4).
생리활성 물질은 무엇인가?
항생제 등의 화학요법제로 인한 이러한 부작용을 저감화하기 위한 방법으로 상대적으로 안전한 천연 생리활성 물질을 이용한 방법들이 대체방안으로 제시되었다7,8). 생리활성 물질이란 일반적으로 생물 체내 물질이 생물 개체나 동종 또는 타종간에 어떤 활성 유발 기능을 가진 화학 물질을 의미하고 다양한 생리 활성 물질 중 식물 유래 추출물의 항균활성은 지방산, flavonoid 등의 phenol 성 물질, 정유 등의 terpenoid, alkaloid 및 배당체 등에 기인한다고 보고되고 있다9).
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