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문제 정의
- 본 연구에서는 식품공전에서 검사하는 미생물 중 일반적인 식품중독균에 대한 MALDI-TOF 질량스펙트럼을 상용화된 국내 데이터베이스, MicroIDTM (ASTA Inc., Suwon, Korea)에 구축하여 신속 정확한 MALDI-TOF 질량분석기반 식품중독균 동정법의 적용가능성을 확인하였다. 데이터베이스 구축에 사용하지 않은 표준균주와 식품의 안전성을 확인하기 위해 식품중독균 유무를 검사한 다양한 식품 시료로부터 분리한 균으로 미생물 동정을 위한 질량분석 데이터베이스의 변별력을 검증하였다.
제안 방법
- 황색포도알세균이 검출되어 분리된 4점은 모두 16S rRNA 유전자 염기서열 분석에 의해 황색포도알세균으로 동정되었다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 결과를 기준으로 기존의 상용화된 생화학 분석법과 질량분석기반 미생물 동정에 의한 결과의 정확도를 비교하였다(Table 5). 바실루스 세레우스인 분리 균 1과 3, 바실루스 투링기엔시스인 분리 균 2에 대해서 생화학 분석 결과는 바실루스 세레우스와 바실루스 투링기엔시스를 구분하지 못하는 바실루스 세레우스 그룹으로 동정했다.
- 2000에서 2015년까지 식품의 안전성 시험 · 검사에서 식품중독 균이 검출되었던 시료 7점에서 분리된 균을 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 실시하여 동정하였다.
- Labopass Tissue Mini prep kit (COSMO genetech, Seoul, Korea)를 사용하여 추출한 세균의 genomic DNA 2 μL에 10 μM polymerase 0.5 μL, 10 mM 27F 프라이머 1 μL, 5 μM 1492R 프라이머 1 μL, dNTP 2 μL와 nuclease free water를 첨가하여 25 μL의 PCR 반응액을 조성하여 94℃에서 5분 반응 후 94℃(30초), 58℃(30초), 72℃(30초) 조건으로 35 사이클을 반복하였다.
- 시료와 매트릭스의 균일한 크리스탈이 형성되면 MALDI-TOF 질량분석기에 삽입하여 분석한다. MALDI-TOF 질량분석기는 Thinker-bell LT (ASTAInc.)를 사용하였고, linear positive모드에서 1,000 shots을 자동으로 acquisition하여 3-20 kDa의 단백질 질량 패턴을 얻었다. 질량 스펙트럼은 대장균(Escherichia coli)에서 추출한 단백질로서 리보뉴클리에이스 A (RNase A, 13,682 Da), 마이오글로빈(Myoglobin, 16,952 Da) 등으로 externally calibration 하였다.
- 질량분석은 다양한 화합물의 질량 대 전하(mass to charge, m/z)의 비율을 측정하여 검출하는데, 이러한 분석을 위해 다양한 이온화방법과 질량 분석시스템이 개발되었다. MALDI-TOF 질량분석은 매트릭스 물질과 시료를 결합한 고체상태의 결정에 레이저 펄스를 조사하여 분석물질을 이온화시키고, 이온화된 물질의 비행시간을 측정하여 분석물질의 질량을 검출한다. MALDI-TOF 질량분석법에 의한 미생물 동정은 1975년 Anhalt와 Fenselau(6)에 의해 처음 시도되었고, 세균 세포의 단백질을 직접 분석하여 미생물을 구별하는 MALDI-TOF MS 질량분석법은 Claydon, Holland, Krishnamurthy(7-9) 등에 의해 구축되었다.
- MALDI-TOF 질량스펙트럼에서 S/N (signal to noise)비 4 이상,250 ppm의 허용한계(tolerance)를 갖는 70개의 피크, m/z (mass to charge)는 MALDI-TOF 분석 소프트웨어와 자동으로 연계되어 있는 패턴 매칭 알고리즘 소프트웨어를 통해 라이브러리의 질량 패턴과 매칭시켰다. 미생물 동정 결과는 MicroIDTM (ASTA Inc.
- 5 μL, 10 mM 27F 프라이머 1 μL, 5 μM 1492R 프라이머 1 μL, dNTP 2 μL와 nuclease free water를 첨가하여 25 μL의 PCR 반응액을 조성하여 94℃에서 5분 반응 후 94℃(30초), 58℃(30초), 72℃(30초) 조건으로 35 사이클을 반복하였다. PCR산물은 2% agarose 겔에서 확인하고, LaboPass PCR purification Kit (COSMO genetech, Seoul, Korea)를 이용하여 반응되지 않은 dNTP와 프라이머를 제거하였다. 정제된 PCR 산물은 Big-Dye® Terminator 3.
- 식품공전에 등록되어 있는 17종의 미생물 검사에서 농림축산식품부와 질병관리본부에서 특별 관리되고 있어 분양받을 수 없는 고위험병원체인 탄저균(Bacillus anthracis), 클로스트리듐 보튤리늄(Clostridium botulinum), 브루셀라균(Brucella) 및 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)과 미생물 오염의 지표로 사용되는 대장균을 포함한 다른 많은 종이 속하는 대장균군(Coliform bacteria)과 독소로서 구별되는 장출혈성대장균은 질량분석 데이터베이스 대상에서 제외하고, 식품의 안전관리에서 주로 시험 · 검사하는 식품중독균을 우선 선정하였다. Table 1의 데이터베이스 구축용 식품중독균 표준 균주 10종 즉, 바실루스 세레우스, 클로스트리 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes), 황색포도알세균, 장염비브리오(Vibrio parahaemolyticus), 캄필로박터 제주니/콜리(Campylobacter jejuni/coli), 엔테로박터 사카자키이(Cronobacter sakazakii), 살모넬라(Salmonella Enteritidis/Typhimurium)와 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)의 20균주에 대한 MALDI-TOF 질량 분석을 확인하였다. 각각의 표준 균주로부터 얻은 질량피크(mass peaks)에서 각 균주 간에 동일한 피크(허용공차: 1500 ppm 이내)가 몇 개 존재하는지 평가하여 식품중독균에 따른 고유의 특이적 MALDITOF 질량 패턴을 확인하였다(Fig.
- Weisburg 등(10)에 의해 확인된 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 위해 가장 널리 사용되는 유전자 증폭 프라이머(27F: 5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'와 1492R: 5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 사용하여 약 1.5 kb로 증폭시켰다.
- 각각의 선택배지에서 분리된 미생물의 형태학과 생화학 확인시험을 위하여 각각의 콜로니는 Table 2의 조건에서 24시간 배양한 후, 슬라이드 글라스에 취해 검경하여 세균의 형태와 운동성을 관찰하고, 그램 염색을 실시하여 형태학적 특성을 확인하였다. 또한 생화학적 확인을 위해 Table 2와 같이 배양액의 탁도를 맞추고 해당되는 카드를 선택하여 자동 생화학 분석장비(VITEK2 compact, bioMérieux, Marcy lEtoile, France)에 장착하여 분석하였다.
- 3과 같이 진행한다. 각각의 식품중독균으로부터 얻은 질량 스펙트럼에서 질량 피크들의 상대적인 피크 세기에 강도 계수(intensity factor)를 적용하는 표준화를 거친 후 참조 데이터베이스와 비교하여 정확한 종 수준의 동정을 한다.
- Table 1의 데이터베이스 구축용 식품중독균 표준 균주 10종 즉, 바실루스 세레우스, 클로스트리 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 리스테리아 모노사이토젠스(Listeria monocytogenes), 황색포도알세균, 장염비브리오(Vibrio parahaemolyticus), 캄필로박터 제주니/콜리(Campylobacter jejuni/coli), 엔테로박터 사카자키이(Cronobacter sakazakii), 살모넬라(Salmonella Enteritidis/Typhimurium)와 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)의 20균주에 대한 MALDI-TOF 질량 분석을 확인하였다. 각각의 표준 균주로부터 얻은 질량피크(mass peaks)에서 각 균주 간에 동일한 피크(허용공차: 1500 ppm 이내)가 몇 개 존재하는지 평가하여 식품중독균에 따른 고유의 특이적 MALDITOF 질량 패턴을 확인하였다(Fig. 2). 균 종간에 일치하는 피크의 개수가 많아질수록 붉은 색으로, 일치하는 피크가 적어질수록 파란색으로 표시해 균 종간 질량패턴 유사성을 한눈에 볼 수 있도록 나타내었다.
- 그램 양성 식품중독균인 바실루스 세레우스를 사용하여 일반적인 direct smear법과 on-target lysis 방법을 비교 평가하였다(Fig.1a). 시료 플레이트에 건조된 세균 세포 스팟에 70% 폼산을 처리한 후 매트릭스와 결정화하여 분석하였을 때 질량스펙트럼의 S/N비 30 이상인 피크의 개수가 24에서 47개로 크게 증가하였다.
- 그러나, Blast 서칭 결과 바실루스 세레우스와 바실루스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis)로 각각 100% 일치한 경우는 518R 프라이머(5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3')(11-13)를 사용한 추가적인 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 실시하여 유전자은행(GenBank)에 등록되어 있는 바실루스 세레우스 KT026101.1, 바실루스 투링기엔시스 AB592540.1과 대조하여 구별하였다.
- 단백질 질량 패턴 데이터베이스에 적용하지 않은 식품중독균 표준 균주, 리스테리아 모노사이토젠스, 살모넬라, 황색포도알세균, 장염비브리오와 여시니아 엔테로콜리티카를 이용하여 식품중독균 10종을 적용시킨 MicroID 데이터베이스로부터 미생물 동정의 변별력을 확인하였다(Table 3). 그리고 해외 상용화된 데이터베이스, Biotyper와 분석 결과를 비교하였다. 클로스트리듐 퍼프리젠스를 제외한 다른 식품중독균은 두 데이터베이스 모두 종 수준에서 정확하게 동정되었다.
- 단백질 질량 패턴 데이터베이스에 적용하지 않은 식품중독균 표준 균주, 리스테리아 모노사이토젠스, 살모넬라, 황색포도알세균, 장염비브리오와 여시니아 엔테로콜리티카를 이용하여 식품중독균 10종을 적용시킨 MicroID 데이터베이스로부터 미생물 동정의 변별력을 확인하였다(Table 3). 그리고 해외 상용화된 데이터베이스, Biotyper와 분석 결과를 비교하였다.
- MALDI-TOF 질량분석법에 의한 미생물 동정은 1975년 Anhalt와 Fenselau(6)에 의해 처음 시도되었고, 세균 세포의 단백질을 직접 분석하여 미생물을 구별하는 MALDI-TOF MS 질량분석법은 Claydon, Holland, Krishnamurthy(7-9) 등에 의해 구축되었다. 단백질과 펩타이드 동정에 널리 사용되고 있는 고감도 MALDI-TOF 질량분석은 레이저 펄스를 이용해 각각의 식품중독균을 이루는 독특한 단백질 패턴을 제공하고, 각 패턴을 데이터베이스와 비교함으로써 식품중독균을 확인하고 구별한다. 104에서 106 CFU의 세균만 존재하여도 또는 하나의 콜로니를 직접 분석할 수 있어 추가적인 배양이 필요로 하지 않고, 시료 전처리 또한 매우 간단하고 분석 시간이 수분 이내로 짧아 다량의 시료를 단시간에 분석할 수 있어 매우 효과적이다.
- , Suwon, Korea)에 구축하여 신속 정확한 MALDI-TOF 질량분석기반 식품중독균 동정법의 적용가능성을 확인하였다. 데이터베이스 구축에 사용하지 않은 표준균주와 식품의 안전성을 확인하기 위해 식품중독균 유무를 검사한 다양한 식품 시료로부터 분리한 균으로 미생물 동정을 위한 질량분석 데이터베이스의 변별력을 검증하였다. 특히 식품중독균이 검출된 식품에서 분리한 균은 16S rRNA 유전자 염기서열 분석에 의해 동정하였고, 이 결과를 기준으로 기존의 상용화된 생화학분석과 MALDI-TOF 질량분석에 의한 결과를 비교하였다.
- 본 실험에 사용된 표준 균주(Table 1)는 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC), 한국미생물보존센터(KCCM), 한국수의유전자원은행(KVCC)과 질병관리본부 국가병원체자원은행(NCCP)에서 분양 받았다. 동결 건조된 미생물에 살균증류수 0.5 mL를 첨가한 현탁액을 소량 채취하여 최적의 평판배지에 도말하고 각각의 최적온도에서 24시간 배양하여 활성화하였다.
- 또한 생화학적 확인을 위해 Table 2와 같이 배양액의 탁도를 맞추고 해당되는 카드를 선택하여 자동 생화학 분석장비(VITEK2 compact, bioMérieux, Marcy lEtoile, France)에 장착하여 분석하였다.
- 특히 식품중독균이 검출된 식품에서 분리한 균은 16S rRNA 유전자 염기서열 분석에 의해 동정하였고, 이 결과를 기준으로 기존의 상용화된 생화학분석과 MALDI-TOF 질량분석에 의한 결과를 비교하였다. 또한, 식품중독균의 질량 스펙트럼을 포함한 국내 데이터베이스 MicroID에 의한 식품중독균 동정의 정확성은 해외의 질량분석 데이터베이스인 Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics)와 비교하여 확인하였다.
- 미생물 콜로니를 MALDI 시료 플레이트(ASTA Inc.)에 도말하여 실온 건조한 후 70% 폼산(formic acid) 2 μL를 시료에 첨가한 후 건조한다.
- 2000에서 2015년까지 식품의 안전성 시험 · 검사에서 식품중독 균이 검출되었던 시료 7점에서 분리된 균을 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 실시하여 동정하였다. 바실루스 세레우스라고 분리된 3점의 균 중에서 분리 균 1과 3은 바실루스 세레우스인 식품중독균으로 확인되었으나, 분리 균 2는 인체에 해를 끼치지 않는 생물학제제로 사용되는 바실루스 투링기엔시스로 유전자은행에 수록되어 있는 16S rRNA sequence와 대조하여 구별하였다. Table 4에서와 같이 바실루스 세레우스 GenBank KT026101.
- 정제된 PCR 산물은 Big-Dye® Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 cycle sequencing 반응을 하고, ABI 3730XL (capillary 96ea X 50 cm, Applied Biosystems)로 분석하였다.
- )를 사용하였고, linear positive모드에서 1,000 shots을 자동으로 acquisition하여 3-20 kDa의 단백질 질량 패턴을 얻었다. 질량 스펙트럼은 대장균(Escherichia coli)에서 추출한 단백질로서 리보뉴클리에이스 A (RNase A, 13,682 Da), 마이오글로빈(Myoglobin, 16,952 Da) 등으로 externally calibration 하였다.
- 데이터베이스 구축에 사용하지 않은 표준균주와 식품의 안전성을 확인하기 위해 식품중독균 유무를 검사한 다양한 식품 시료로부터 분리한 균으로 미생물 동정을 위한 질량분석 데이터베이스의 변별력을 검증하였다. 특히 식품중독균이 검출된 식품에서 분리한 균은 16S rRNA 유전자 염기서열 분석에 의해 동정하였고, 이 결과를 기준으로 기존의 상용화된 생화학분석과 MALDI-TOF 질량분석에 의한 결과를 비교하였다. 또한, 식품중독균의 질량 스펙트럼을 포함한 국내 데이터베이스 MicroID에 의한 식품중독균 동정의 정확성은 해외의 질량분석 데이터베이스인 Biotyper 3.
대상 데이터
- 2000에서 2015년 농협식품연구원의 식품의 안전성 시험 · 검사에서 분리한 7종의 식품중독균, 즉 바실루스 세레우스(Bacillus cereus) 3종과 황색포도알세균(Staphylococcus aureus) 4종을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 표준 균주(Table 1)는 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC), 한국미생물보존센터(KCCM), 한국수의유전자원은행(KVCC)과 질병관리본부 국가병원체자원은행(NCCP)에서 분양 받았다. 동결 건조된 미생물에 살균증류수 0.
- 식품공전에 등록되어 있는 17종의 미생물 검사에서 농림축산식품부와 질병관리본부에서 특별 관리되고 있어 분양받을 수 없는 고위험병원체인 탄저균(Bacillus anthracis), 클로스트리듐 보튤리늄(Clostridium botulinum), 브루셀라균(Brucella) 및 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)과 미생물 오염의 지표로 사용되는 대장균을 포함한 다른 많은 종이 속하는 대장균군(Coliform bacteria)과 독소로서 구별되는 장출혈성대장균은 질량분석 데이터베이스 대상에서 제외하고, 식품의 안전관리에서 주로 시험 · 검사하는 식품중독균을 우선 선정하였다.
- 1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 cycle sequencing 반응을 하고, ABI 3730XL (capillary 96ea X 50 cm, Applied Biosystems)로 분석하였다. 획득한 16S rRNA sequences는 NCBI BLAST 2 Sequence (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi)에서 align한 후 Blast 서칭을 하였다. 16S rRNA sequences가 100% 일치하면 종(species) 수준에서 동정되었다고 하였다.
데이터처리
- )에 수록된 표준 질량스펙트럼과 시료의 질량스펙트럼을 비교하여 매칭 스코어로서 표현되는데, 120 이상은 결과의 신뢰도가 높음, 80-120은 결과에 대한 확인이 필요함, 80 미만은 동정 결과의 신뢰도가 낮음을 의미한다. 구축한 데이터베이스에서 얻은 식품 미생물 동정 결과는 2015년 기준 2,400여종의 5,600 균주의 단백질 질량 스펙트럼을 보유하고 있는 Biotyper 3.0과 비교하였다.
이론/모형
- 2에서는 동일한 종간에 질량 패턴의 유사성이 높고, 타 종간에는 질량 패턴의 유사성이 낮아 MALDI-TOF 질량분석 데이터베이스에서 각각의 식품중독균을 판별할 수 있음을 보여주었다. Table 1의 데이터베이스 구축용 표준 균주에 대해 10개 이상의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 얻어 표준화된 단백질 질량 피크들과 피크의 상대적인 세기에 강도 계수(intensity factor)를 부여한 분석알고리즘을 MicroIDTM (ASTA Inc.)의 데이터베이스에 적용시켰다. 2016년 4월 기준 국내 미생물 2,500여종의 6,000균주에 대한 데이터를 보유한 MicroID를 이용한 동정은 Fig.
- 그래서 강한 유기산과 유기용매와 같은 화학물질이나 효소 등을 처리하여 세균 세포에서 단백질을 추출하여 질량분석에 적용하는 방법 등이 개발(14-16)되었으나 이러한 방법들의 경우 2-30분 정도의 샘플 준비 시간이 필요하다. 그렇기 때문에 일반적인 시료 전처리법의 간단, 신속성을 유지하면서 단백질 추출의 효율성을 접목시킨 Haigh 등의 방법(17)을 변형한 on-target lysis 방법을 적용하였다.
- 국내 식품 미생물의 확인시험방법은 전통적인 미생물 동정법인 그램 염색 등과 같은 형태학적 특성과 생화학적 분석에 의해서 주로 확인되는데, 확인 과정이 복잡하고 장시간이 소요된다. 이를 극복하기 위한 새로운 미생물 동정법인 MALDITOF 질량분석기반 미생물 동정법을 식품의 식품중독균 검사에 적용하기 위해 식품공전에서 주로 검사하는 식품중독균 10종에 대한 질량 패턴 데이터를 국내 질량분석 데이터베이스인 MicroID에 적용하였다. 표준 균주와 식품중독균이 검출된 시료에서 분리한 균으로 비교했을 때 질량분석기반 미생물 동정은 현재 사용되고 있는 생화학적 분석결과와 일치한 결과를 보여주었다.
성능/효과
- 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 결과 황색포도알세균으로 확인된 분리 균 4-7은 자동 생화학 분석에서 황색포도알세균으로 동정하였다. 각각의 Biotyper와 MicroID를 이용한 질량분석기반 미생물 동정에서도 종 수준의 높은 신뢰도로 황색포도알세균으로 동정되었다.
- 1는 16S rRNA gene sequence 중 단 4개의 위치에 서로 다른 뉴클레오타이드로 구별되었다. 59, 72, 74와 174 위치의 뉴클레오타이드가 분리균 1과 3은 바실루스 세레우스와 일치하였고, 분리균 2는 바실루스 투링기엔시스와 일치하였다. 황색포도알세균이 검출되어 분리된 4점은 모두 16S rRNA 유전자 염기서열 분석에 의해 황색포도알세균으로 동정되었다.
- 바실루스 세레우스인 분리 균 1과 3, 바실루스 투링기엔시스인 분리 균 2에 대해서 생화학 분석 결과는 바실루스 세레우스와 바실루스 투링기엔시스를 구분하지 못하는 바실루스 세레우스 그룹으로 동정했다. Biotyper를 이용한 질량분석기반 미생물 동정 결과, 분리균 1-3을 모두 바실루스 세레우스라고 동정했다. 그러나 분리 균1과 2의 ID 스코어는 속(genus) 수준에서 신뢰할 수 있는 결과이므로 Bacillus sp.
- 임을 확인하였고, 분리 균 3은 종 수준에서 신뢰할 수 있는 바실루스 세레우스임을 확인하였다. MicroID의 동정 결과는 분리 균 1은 바실루스 세레우스, 분리 균 2와 3은 바실루스 투링기엔시스로 신뢰도 높은 값으로 동정되었다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 결과와 비교하면 분리 균 3은 오인된 결과를 얻었다.
- 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 결과 황색포도알세균으로 확인된 분리 균 4-7은 자동 생화학 분석에서 황색포도알세균으로 동정하였다. 각각의 Biotyper와 MicroID를 이용한 질량분석기반 미생물 동정에서도 종 수준의 높은 신뢰도로 황색포도알세균으로 동정되었다. 따라서, 황색포도알세균에 대해서는 질량분석기반 미생물 동정의 정확도는 기존의 상용화된 자동 생화학 분석법과 동등하였다.
- 각각의 Biotyper와 MicroID를 이용한 질량분석기반 미생물 동정에서도 종 수준의 높은 신뢰도로 황색포도알세균으로 동정되었다. 따라서, 황색포도알세균에 대해서는 질량분석기반 미생물 동정의 정확도는 기존의 상용화된 자동 생화학 분석법과 동등하였다. 식품중독균에 오염된 식품 시료의 수집이 어려워 비교 평가한 균의 개수가 많지 않아 본 연구에서는 질량분석기반 미생물 동정의 정확도가 생화학 분석에 비해 더 높은 결과를 보여주지 못했지만, Bessède 등(29)은 캄필로박터 제주니, 캄필로박터 콜리와 캄필로박터 라리(Campylobacter lari)에 대해서 기존의 상용화된 생화학분석법에 비해 질량분석기반 미생물 동정의 정확도가 각각 2.
- 시료 플레이트에 건조된 세균 세포 스팟에 70% 폼산을 처리한 후 매트릭스와 결정화하여 분석하였을 때 질량스펙트럼의 S/N비 30 이상인 피크의 개수가 24에서 47개로 크게 증가하였다. 또한, 각각의 방법으로 4개의 샘플 스팟을 준비하여 MALDI-TOF 분석한 후 MicroID 데이터베이스와 비교하였을 때, on-target lysis 방법을 사용한 경우 매칭 스코어 값의 평균이 131에서 172.5로 증가할 뿐만 아니라 샘플 스팟 간 일정한 매칭 스코어를 얻었다(Fig. 1b). 이는 시료 전처리 방법의 최적화를 통해 식품중독균의 동정에 대한 신뢰도를 결정하는 매칭 스코어를 높였을 뿐 아니라 말디 샘플 스팟 간 재현성을 높이는 긍정적인 영향을 얻었다.
- 표준 균주와 식품중독균이 검출된 시료에서 분리한 균으로 비교했을 때 질량분석기반 미생물 동정은 현재 사용되고 있는 생화학적 분석결과와 일치한 결과를 보여주었다. 또한, 식품중독균을 포함한 국내 미생물 균주를 이용해서 구축한 데이터베이스, MicroID는 기존의 상용화된 해외 MALDI-TOF 질량분석 데이터베이스 Biotyper와 동등 이상의 정확도를 나타내었다. 국내 식품관련 미생물에 대한 질량스펙트럼을 추가하여 데이터베이스를 지속적으로 확장시키면 신속 정확한 미생물 동정법으로 자리매김할 수 있을 것이다.
- MALDI-TOF 질량스펙트럼에서 S/N (signal to noise)비 4 이상,250 ppm의 허용한계(tolerance)를 갖는 70개의 피크, m/z (mass to charge)는 MALDI-TOF 분석 소프트웨어와 자동으로 연계되어 있는 패턴 매칭 알고리즘 소프트웨어를 통해 라이브러리의 질량 패턴과 매칭시켰다. 미생물 동정 결과는 MicroIDTM (ASTA Inc.)에 수록된 표준 질량스펙트럼과 시료의 질량스펙트럼을 비교하여 매칭 스코어로서 표현되는데, 120 이상은 결과의 신뢰도가 높음, 80-120은 결과에 대한 확인이 필요함, 80 미만은 동정 결과의 신뢰도가 낮음을 의미한다. 구축한 데이터베이스에서 얻은 식품 미생물 동정 결과는 2015년 기준 2,400여종의 5,600 균주의 단백질 질량 스펙트럼을 보유하고 있는 Biotyper 3.
- 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 결과를 기준으로 기존의 상용화된 생화학 분석법과 질량분석기반 미생물 동정에 의한 결과의 정확도를 비교하였다(Table 5). 바실루스 세레우스인 분리 균 1과 3, 바실루스 투링기엔시스인 분리 균 2에 대해서 생화학 분석 결과는 바실루스 세레우스와 바실루스 투링기엔시스를 구분하지 못하는 바실루스 세레우스 그룹으로 동정했다. Biotyper를 이용한 질량분석기반 미생물 동정 결과, 분리균 1-3을 모두 바실루스 세레우스라고 동정했다.
- 생화학적 특성이 거의 일치(25)하여 전통적인 생화학분석으로 생물농약으로 사용되고 있는 바실루스 투링기엔시스와 구별할 수 없었던 바실루스 세레우스는 질량분석기반 미생물동정법에서도 정확히 구별이 되지 않았다. 바실루스 투링기엔시스의 표준 균주의 질량스펙트럼을 데이터베이스화하고, 데이터베이스에 사용하지 않은 표준 균주로 평가했을 때 신뢰도가 높은 값을 가지는 순위에 바실루스 세레우스와 바실루스 투링기엔시스 모두 있어, 두 균을 구별하는 변별력이 없었다(data not shown). 이는 세균 세포를 직접 MALDI-TOF 질량분석 시 세포 단백질의 20% 이상을 차지하는 ribosomal 단백질이 주로 분석되는데(26,27), 바실루스 세레우스와 바실루스 투링기엔시스의 16S rRNA 서열의 동질성이 매우 높기 때문이다.
- 1a). 시료 플레이트에 건조된 세균 세포 스팟에 70% 폼산을 처리한 후 매트릭스와 결정화하여 분석하였을 때 질량스펙트럼의 S/N비 30 이상인 피크의 개수가 24에서 47개로 크게 증가하였다. 또한, 각각의 방법으로 4개의 샘플 스팟을 준비하여 MALDI-TOF 분석한 후 MicroID 데이터베이스와 비교하였을 때, on-target lysis 방법을 사용한 경우 매칭 스코어 값의 평균이 131에서 172.
- 1b). 이는 시료 전처리 방법의 최적화를 통해 식품중독균의 동정에 대한 신뢰도를 결정하는 매칭 스코어를 높였을 뿐 아니라 말디 샘플 스팟 간 재현성을 높이는 긍정적인 영향을 얻었다. Haigh 등(17)은 폼산을 처리하였을 때 direct smear법에 비해 미생물 동정률이 약 11% 증가하였다고 보고하였고, Ford와 Burnham(20)과 Tekippe 등(21)도 각각 그램 양성과 그램 음성 미생물에 대해 평가한 결과 매칭 스코어 값이 커지고 동정률도 증가하였다고 보고하였다.
- 그러나 분리 균1과 2의 ID 스코어는 속(genus) 수준에서 신뢰할 수 있는 결과이므로 Bacillus sp.임을 확인하였고, 분리 균 3은 종 수준에서 신뢰할 수 있는 바실루스 세레우스임을 확인하였다. MicroID의 동정 결과는 분리 균 1은 바실루스 세레우스, 분리 균 2와 3은 바실루스 투링기엔시스로 신뢰도 높은 값으로 동정되었다.
- 이를 극복하기 위한 새로운 미생물 동정법인 MALDITOF 질량분석기반 미생물 동정법을 식품의 식품중독균 검사에 적용하기 위해 식품공전에서 주로 검사하는 식품중독균 10종에 대한 질량 패턴 데이터를 국내 질량분석 데이터베이스인 MicroID에 적용하였다. 표준 균주와 식품중독균이 검출된 시료에서 분리한 균으로 비교했을 때 질량분석기반 미생물 동정은 현재 사용되고 있는 생화학적 분석결과와 일치한 결과를 보여주었다. 또한, 식품중독균을 포함한 국내 미생물 균주를 이용해서 구축한 데이터베이스, MicroID는 기존의 상용화된 해외 MALDI-TOF 질량분석 데이터베이스 Biotyper와 동등 이상의 정확도를 나타내었다.
- 59, 72, 74와 174 위치의 뉴클레오타이드가 분리균 1과 3은 바실루스 세레우스와 일치하였고, 분리균 2는 바실루스 투링기엔시스와 일치하였다. 황색포도알세균이 검출되어 분리된 4점은 모두 16S rRNA 유전자 염기서열 분석에 의해 황색포도알세균으로 동정되었다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 결과를 기준으로 기존의 상용화된 생화학 분석법과 질량분석기반 미생물 동정에 의한 결과의 정확도를 비교하였다(Table 5).
후속연구
- 또한, 식품중독균을 포함한 국내 미생물 균주를 이용해서 구축한 데이터베이스, MicroID는 기존의 상용화된 해외 MALDI-TOF 질량분석 데이터베이스 Biotyper와 동등 이상의 정확도를 나타내었다. 국내 식품관련 미생물에 대한 질량스펙트럼을 추가하여 데이터베이스를 지속적으로 확장시키면 신속 정확한 미생물 동정법으로 자리매김할 수 있을 것이다.
- 7%의 동질성을 가지므로 16S rRNA 유전자 염기서열 분석으로도 두 균을 구별하기가 어렵다라고 보고하고 있다. 따라서, 16s RNA 유전자 서열의 동질성이 높은 균을 구별할 수 있는 바이오마커를 찾는 질량분석 연구가 앞으로 필요하다.
- Seng 등의 보고(22)와 같이 MALDI-TOF 질량분석기반 미생물 동정법은 전통적인 미생물 동정법에 비해 시료 준비과정이 단순하고 분석 시간이 매우 빠르다. 선택배지에서 배양된 콜로니를 자동 생화학 분석시스템을 이용하여 동정하기 위해서는 분석을 위한 미생물의 시료를 확보하기 위해 추가적인 배양을 실시하고, 검출하고자 하는 균에 따라 카드를 선택해서 사용하고, 카드에 따라 분석시간이 최소 3시간에서 16시간이 걸리므로 전통적인 미생물 동정법에 의한 확인시험은 이틀 정도 소요된다. 그러나 질량분석기반 미생물 동정법은 선택배지에 확인된 콜로니를 직접 분석하고, 전처리 및 분석 시간이 약 5분 정도 소요되므로 매우 신속한 동정이 가능하다.
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