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문제 정의
- 본 연구에서는 꽃송이버섯으로부터 분리, 선발한 균주를 이용하여 꽃송이버섯 발효물을 제조하고, 발효 후 항산화 및 면역 활성 분석을 통해 발효효능과 꽃송이버섯으로부터 분리한 균주의 이용 가능성을 확인하고자 한다.
- 이러한 비장 무게의 감소는 특정질환 감염 시 더 많은 변화를 보이며(29), 면역조절제를 투여할 시 흉선과 비장의 무게가 증가하는 것으로 알려져 있다(30). 본 연구에서는 정상군보다 대조군에서 비장 무게가 감소한 것은 MTX에 의해 면역이 저하되면서 림프구의 생성량에 변화가 생기고 그에 따라 비장세포에도 영향을 준 것으로 생각한다. 또한, 면역이 저하된 rat에 꽃송이버섯 추출물 및 발효물을 투여했을 때 비장 무게가 정상군에 근접한 것은 꽃송이버섯의 투여가 유의미한 면역조절 역할을 한 것으로 보인다.
제안 방법
- Tumor necrosis factor(TNF)-α, interleukin(IL)-2, IL-10과 immunoglobulin E(IgE)의 함량은 ELISA kit(R&D System, McKinley Place NE, Minneapolis, MN, USA)을 구입하여 제조사의 방법에 따라 측정하였다.
- pH는 pH meter기(pH meter 250L, ISTEK, Seoul, Korea)를 이용하였으며, 적정 산도는 0.1 N NaOH로 pH가 8.3이 될 때까지 적정하여 이때 소비된 NaOH 함량을 lactic acid(%)로 환산하여 계산하였다.
- plantarum 균주로 제조한 발효물을 투여한 군과 비교하였다. 각각의 구강투여는 전체 실험기간 동안 1회/1일, 총 20회 시행되었고 1회 투여량은 100 mg/kg으로 정하였다. 비장 무게는 실험 종료 후 비장을 분리해 무게를 측정하였다.
- 꽃송이버섯 발효물은 꽃송이버섯 분말에 50배 가수한 후 autoclave(121°C, 60 min)에서 추출하였으며 이 추출물에 균주를 각각 1% 접종하여 37°C incubator에서 5일간 발효하였다.
- 꽃송이버섯 발효물의 생균수는 시료 0.1 mL에 멸균증류수를 가하여 10배씩 단계별로 희석하였으며 plate count agar(Difco)에 분주하여 37°C에서 48시간 배양한 후 형성된 colony 수를 계수하였다.
- 꽃송이버섯 발효에 이용할 미생물 분리를 위하여 꽃송이버섯에 멸균증류수를 첨가한 후 희석 및 현탁하여 plate count agar(Difco, Sparks, MD, USA)에 도말하고 모양이 다른 single colony를 streaking 하여 37°C에서 48시간 배양하였다.
- 배양 후 관찰된 colony를 계대 배양하고 분리하여 4°C에서 보관하며 실험에 사용하였다. 꽃송이버섯 발효에 적합한 균주 선발을 위하여 꽃송이버섯 배지에서 배양하며 생균수 및 이화학적 변화 측정을 통한 발효 속도를 관찰하여 1차 선발하였으며, 이후 항산화능, 관능특성 등을 확인하여 2차 선발하였다(data not shown). 꽃송이버섯 발효에 우수한 생육능력 및 발효특성을 보인 FM 균주를 최종 선발하여 본 연구에 사용하였으며 선발된 FM 균주를 18S rRNA sequencing에 의해 분석한 결과 효모의 일종인 Meyerozyma guilliermondii와 가장 유사성이 높은 것으로 확인되었고 Meyerozyma guilliermondii FM으로 명명하였다(Fig.
- 꽃송이버섯에서 분리 선발한 Meyerozyma guilliermondii FM을 이용하여 꽃송이버섯 발효물을 제조하고 항산화 활성 및 면역조절 효과를 조사하였다. 꽃송이버섯 발효물 제조 시 M.
- 본 연구에서 in vitro 실험은 3반복 시행하였으며, in vivo 실험은 6반복 시행하였다. 결과는 평균에 대한 표준편차로 나타내었다.
- 각각의 구강투여는 전체 실험기간 동안 1회/1일, 총 20회 시행되었고 1회 투여량은 100 mg/kg으로 정하였다. 비장 무게는 실험 종료 후 비장을 분리해 무게를 측정하였다. 모든 실험은 동신대학교 동물실험윤리위원회의 승인 후 수행하였다(승인번호: 2016-01-01).
- )와 물을 충분히 공급하여 사육하였고, 1주일 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 사용된 동물의 면역저하 유발은 methotrexate(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 분말을 2 mg/kg의 농도로 투여하였으며, 8일째부터 1일/1회 총 4회 구강 투여를 시행하였다. 실험군은 정상군(Normal), methotrexate(MTX) 면역저하 유발 후 시술을 하지 않은 대조군(Control), MTX 면역저하 유발 후 꽃송이버섯 열수 추출물을 투여한 군으로 구성되어 있으며, 분리 균주 M.
- 꽃송이버섯 발효물은 꽃송이버섯 분말에 50배 가수한 후 autoclave(121°C, 60 min)에서 추출하였으며 이 추출물에 균주를 각각 1% 접종하여 37°C incubator에서 5일간 발효하였다. 시료 채취는 0, 1, 3, 5일째 실시하였다.
- 시료를 10배로 희석한 후 1 mL를 취하여 9 mL 증류수와 1 mL의 Folin-Ciocalteu's phenol reagent를 넣고 5분간 반응시킨 후 7% Na2CO3 10 mL와 증류수 4 mL를 첨가하고 상온에서 90분간 방치시킨 다음 UV spectrophotometer(UV-1601, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였고, gallic acid를 이용한 표준곡선을 작성하고 시료의 총페놀 함량을 산출하였다.
- Louis, MO, USA) 분말을 2 mg/kg의 농도로 투여하였으며, 8일째부터 1일/1회 총 4회 구강 투여를 시행하였다. 실험군은 정상군(Normal), methotrexate(MTX) 면역저하 유발 후 시술을 하지 않은 대조군(Control), MTX 면역저하 유발 후 꽃송이버섯 열수 추출물을 투여한 군으로 구성되어 있으며, 분리 균주 M. guilliermondii FM으로 제조한 발효물의 검증을 위하여 L. plantarum 균주로 제조한 발효물을 투여한 군과 비교하였다. 각각의 구강투여는 전체 실험기간 동안 1회/1일, 총 20회 시행되었고 1회 투여량은 100 mg/kg으로 정하였다.
- 실험에 사용된 혈청은 실험 종료 후 각각의 rat의 혈액을 채취하여 고속원심분리기(Centricon T-42K, Kontron, Milan, Italy)에서 1,000×g로 20분간 혈청을 분리하여 사용하였다.
- 총페놀 함량 함량은 Folin-Denis 방법(20)을 변형하여 분석하였다. 시료를 10배로 희석한 후 1 mL를 취하여 9 mL 증류수와 1 mL의 Folin-Ciocalteu's phenol reagent를 넣고 5분간 반응시킨 후 7% Na2CO3 10 mL와 증류수 4 mL를 첨가하고 상온에서 90분간 방치시킨 다음 UV spectrophotometer(UV-1601, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였고, gallic acid를 이용한 표준곡선을 작성하고 시료의 총페놀 함량을 산출하였다.
- 혈액내의 백혈구 함량은 채혈한 혈액 약 100 μL를 EDTA-bottle에 넣은 후 multi species hematology analyser(Hemavet 950, Drew Scientific, Waterbury, CT, USA)에 주입하여 백혈구 함량을 측정하였다.
대상 데이터
- 꽃송이버섯은 백아산꽃송이버섯 영농조합법인(Hwasun, Korea)에서 생물 상태로 구입하여 dry oven을 이용하여 건조 후 분말 형태로 제조하여 사용하였다. 꽃송이버섯 발효물은 꽃송이버섯 분말에 50배 가수한 후 autoclave(121°C, 60 min)에서 추출하였으며 이 추출물에 균주를 각각 1% 접종하여 37°C incubator에서 5일간 발효하였다.
- 면역 활성 측정을 위한 실험동물은 체중이 약 170~180 g인 rat(Samtako Inc., Osan, Korea)을 항온항습 환경의 사육장(온도 24~26°C, 습도 40~60%)에서 고형사료(Samtako Inc.)와 물을 충분히 공급하여 사육하였고, 1주일 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 1). 본 연구에서는 여러 실험의 상대적 비교를 위해 유산균(Lactobacillus plantarum KCCM 11322, Leuconostoc mesenteroies KCTC 3718, Bifidobacterium longum KCCM 11953)을 사용하였다.
데이터처리
- 본 연구에서 in vitro 실험은 3반복 시행하였으며, in vivo 실험은 6반복 시행하였다. 결과는 평균에 대한 표준편차로 나타내었다. 유의성 검정은 SPSS 22.
- 유의성 검정은 SPSS 22.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계 프로그램을 이용하여 분산분석(ANOVA test)을 하고 Duncan의 다중검정(Duncan's multiple range test)을 통해 95% 신뢰 수준에서 나타내었다.
이론/모형
- DPPH 라디칼 소거능은 Blois(21)의 방법에 따라 10배로 희석한 샘플 0.4 mL에 0.4 mM 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 용액 1.6 mL를 가하여 10분간 방치한 후 525 nm에서 흡광도를 측정한 다음 아래와 같은 공식에 의해 계산하였다.
성능/효과
- IL-2의 함량은 면역저하가 유발된 대조군이 37.31 pg/mL로 22.31 pg/mL의 함량을 보인 정상군보다 높았으며, 꽃송이버섯 비발효 추출물과 발효물을 투여했을 때의 결과도 정상군과 유사한 IL-2 함량을 보여 TNF-α의 경향성과 유사하였다.
- IgE 함량은 대조군에서 1.01 pg/mL로 정상군의 IgE 함량(0.51 pg/mL)보다 높은 함량을 보였으며, 꽃송이버섯 추출물 및 발효물을 투여할 시 0.52~0.59 pg/mL로 유의적으로 감소하였다. IgE는 알레르기와 아토피 피부염을 가지는 환자의 혈청에서 특히 높은 함량을 보인다(35-37).
- 78로 소폭 감소하거나 거의 일정한 값을 나타내었다. L. plantarum으로 발효한 실험구는 다른 균주보다 pH의 값이 가장 낮았으며, M. guilliermondii FM은 L. mesenteroides, B. longum을 접종한 실험구와 비슷한 경향성을 나타내었다. 일반적으로 발효기간 동안 pH는 감소하며 이에 반해 산도는 증가하는 경향성을 보이는데(18), 꽃송이버섯을 발효한 본 연구에서도 발효에 따라 pH는 감소하고 총산도는 증가하는 반비례적인 결과가 나타났다.
- 또한, 꽃송이버섯 발효물 투여에 따라 TNF-α, IL-2, IgE의 수치는 대조군보다 감소하였으며, IL-10은 증가하였으나 꽃송이버섯 비발효 추출물과 발효물 투여 사이의 유의적인 차이는 없었다. M. guilliermondii FM을 이용한 꽃송이버섯 발효물을 투여한 실험구는 혈액 내 백혈구 함량이 대조구 및 다른 처리구에 비하여 가장 높은 수치를 나타내었다.
- TNF-α와 IL-2와는 다르게 대식세포와 T세포에 직접 작용하여 대식세포의 항원 제시 기능을 억제하는 IL-10의 함량은 면역저하를 유발하지 않은 정상군이 48.09pg/mL로 가장 높은 함량을 보였고 M. guilliermondii FM 발효물, L. plantarum 발효물, 비발효 추출물을 투여한 rat 순으로 높았으며 대조구는 38.75 pg/mL로 가장 낮은 함량을 보였다.
- 일반적으로 발효기간 동안 pH는 감소하며 이에 반해 산도는 증가하는 경향성을 보이는데(18), 꽃송이버섯을 발효한 본 연구에서도 발효에 따라 pH는 감소하고 총산도는 증가하는 반비례적인 결과가 나타났다. pH의 값이 가장 낮은 L. plantarum을 접종한 실험구에서 가장 높은 총산도 값을 보였으며, M. guilliermondii FM으로 발효한 실험구의 총산도 값은 발효 1일까지 L. mesenteroides, B. longum으로 발효한 실험구와 유사한 수치를 보였으나 5일차에는 가장 낮은 값을 나타내었다. 유산균들은 lactic acid를 활발하게 생성하기 때문에 효모인 M.
- Total phenol은 모든 균주에서 발효 전보다 발효 후 유의적으로 높은 함량을 보였으며, 이는 버섯발효에 따라 총페놀 함량이 증가한 것으로 보고한 Kim과 Lee(22)의 연구 결과와 일치한다. 균주 간의 비교에서는 유산균보다 꽃송이버섯으로부터 분리한 M. guilliermondii FM으로 발효한 실험구에서 유의적으로 가장 높은 값을 나타내었으며 균주 간 차이를 나타내었다.
- 꽃송이버섯 발효가 진행됨에 따라 유산균을 접종한 실험구의 생균수는 점차 감소하였지만 꽃송이버섯에서 분리한 균주인 M. guilliermondii FM은 발효 1일째까지는 감소하였지만, 이후 발효 5일까지 생균수가 증가하였다.
- 꽃송이버섯에서 분리 선발한 Meyerozyma guilliermondii FM을 이용하여 꽃송이버섯 발효물을 제조하고 항산화 활성 및 면역조절 효과를 조사하였다. 꽃송이버섯 발효물 제조 시 M. guilliermondii FM은 유산균과 비슷한 생육능력을 보였으며, 5일째에는 오히려 높은 값을 나타내었다. 발효 후 총페놀 함량과 DPPH 라디칼 소거능은 유산균보다 유의적으로 높은 값을 나타내었다.
- 꽃송이버섯 발효에 적합한 균주 선발을 위하여 꽃송이버섯 배지에서 배양하며 생균수 및 이화학적 변화 측정을 통한 발효 속도를 관찰하여 1차 선발하였으며, 이후 항산화능, 관능특성 등을 확인하여 2차 선발하였다(data not shown). 꽃송이버섯 발효에 우수한 생육능력 및 발효특성을 보인 FM 균주를 최종 선발하여 본 연구에 사용하였으며 선발된 FM 균주를 18S rRNA sequencing에 의해 분석한 결과 효모의 일종인 Meyerozyma guilliermondii와 가장 유사성이 높은 것으로 확인되었고 Meyerozyma guilliermondii FM으로 명명하였다(Fig. 1). 본 연구에서는 여러 실험의 상대적 비교를 위해 유산균(Lactobacillus plantarum KCCM 11322, Leuconostoc mesenteroies KCTC 3718, Bifidobacterium longum KCCM 11953)을 사용하였다.
- 88 K/μL로 유의적으로 감소하였다. 꽃송이버섯 추출물 및 발효물을 투여한 실험구들은 혈액 내의 백혈구 함량이 증가하였고 M. guilliermondii FM 발효물을 투여한 군이 가장 높은 값을 보였지만 유의적인 차이는 없었다. 이러한 함량 변화는 호중구(neutrophils), 림프구(lymphocyte), 그리고 단핵구(monocyte)에서도 유사한 변화 패턴을 보였으며, 호중구와 단핵구의 실험 결과에서는 꽃송이버섯 비발효 추출물보다 M.
- 05). 꽃송이버섯 추출물(발효 전) 및 발효물을 투여했을 때의 비장 무게는 꽃송이버섯 비발효 추출물이 0.74 g/rat이었으며, L. plantarum과 꽃송이버섯 유래균인 M. guilliermondii FM 발효물을 투여한 실험구가 각각 0.78 g/rat, 0.79 g/rat으로 면역을 저하시킨 대조군보다 꽃송이버섯 비발효 추출물과 발효물 모두 유의적으로 증가하였다. 하지만 꽃송이버섯 비발효 추출물과 발효물 사이의 유의적인 차이는 없었다.
- 3과 같다. 꽃송이버섯 추출물의 초기 pH는 5.6이었고 발효 24시간 이후 모든 샘플에서 3.60~4.29로 급격하게 감소하였다. 이후 발효가 진행됨에 따라 모든 샘플의 pH는 3.
- 본 연구의 결과도 사용된 균주의 종류에 따라 항산화력이 다른 것은 대사산물 및 발효생성물의 차이에 따른 결과로 생각하며, 특히 총페놀 함량은 항산화 활성과 높은 상관관계를 보이는 것으로 생각된다. 꽃송이버섯을 항산화력이 가장 높았던 분리균주 M. guilliermondii FM으로 발효 시 항산화력을 증가시킬 수 있을 것으로 생각한다.
- 또한, 꽃송이버섯 발효물 투여에 따라 TNF-α, IL-2, IgE의 수치는 대조군보다 감소하였으며, IL-10은 증가하였으나 꽃송이버섯 비발효 추출물과 발효물 투여 사이의 유의적인 차이는 없었다.
- 면역저하가 유발된 rat에 꽃송이버섯 비발효 추출물과 발효물을 투여했을 때의 TNF-α는 비발효 추출물이 12.22 pg/mL로 대조구보다 유의적으로 감소한 함량을 보였으며, 꽃송이 버섯 발효물을 투여한 실험구는 L. plantarum과 M. guilliermondii FM 발효액을 투여한 rat에서 각각 11.31 pg/mL, 11.28 pg/mL로 정상군에 가까운 수치를 보였다.
- 발효 후 총페놀 함량과 DPPH 라디칼 소거능은 유산균보다 유의적으로 높은 값을 나타내었다. 면역저하가 유발된 rat에서 비장 무게는 면역을 저하시킨 대조군보다 꽃송이버섯 비발효 추출물과 발효물 투여군에서 모두 유의적으로 증가하였다. 또한, 꽃송이버섯 발효물 투여에 따라 TNF-α, IL-2, IgE의 수치는 대조군보다 감소하였으며, IL-10은 증가하였으나 꽃송이버섯 비발효 추출물과 발효물 투여 사이의 유의적인 차이는 없었다.
- 면역저하를 유발하지 않은 정상군(Normal)의 비장 무게는 0.80 g/rat으로, MTX에 의해 면역저하된 대조군(Control)의 0.62 g/rat 보다 유의적인 차이를 보였다(P<0.05).
- 발효 전 꽃송이버섯 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 약 24% 정도로 측정되었으나, 총페놀 함량의 결과와 유사하게 발효 후 모든 샘플에서 DPPH 라디칼 소거능이 증가하였다. 특히 M.
- guilliermondii FM은 유산균과 비슷한 생육능력을 보였으며, 5일째에는 오히려 높은 값을 나타내었다. 발효 후 총페놀 함량과 DPPH 라디칼 소거능은 유산균보다 유의적으로 높은 값을 나타내었다. 면역저하가 유발된 rat에서 비장 무게는 면역을 저하시킨 대조군보다 꽃송이버섯 비발효 추출물과 발효물 투여군에서 모두 유의적으로 증가하였다.
- 본 실험 결과 대조군에서는 염증을 일으키는 TNF-α의 함량이 증가하였으나 꽃송이버섯 추출물과 발효물의 투여로 인해 TNF-α의 함량이 억제된 것으로 생각한다.
- 일반적으로 발효를 통해 항산화 활성이 증가하는데, Yang 등(25)은 버섯 발효물에서의 발효생성물과 유산균 대사산물이 효소의 활성을 저해 혹은 활성화시킴에 따라 버섯발효물의 항산화 활성이 증가할 수 있다고 설명하고 있다. 본 연구의 결과도 사용된 균주의 종류에 따라 항산화력이 다른 것은 대사산물 및 발효생성물의 차이에 따른 결과로 생각하며, 특히 총페놀 함량은 항산화 활성과 높은 상관관계를 보이는 것으로 생각된다. 꽃송이버섯을 항산화력이 가장 높았던 분리균주 M.
- guilliermondii FM 발효물을 투여한 군이 가장 높은 값을 보였지만 유의적인 차이는 없었다. 이러한 함량 변화는 호중구(neutrophils), 림프구(lymphocyte), 그리고 단핵구(monocyte)에서도 유사한 변화 패턴을 보였으며, 호중구와 단핵구의 실험 결과에서는 꽃송이버섯 비발효 추출물보다 M. guilliermondii FM을 이용한 발효물이 유의적으로 높은 함량을 보였다. 특히 M.
- 발효 전 꽃송이버섯 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 약 24% 정도로 측정되었으나, 총페놀 함량의 결과와 유사하게 발효 후 모든 샘플에서 DPPH 라디칼 소거능이 증가하였다. 특히 M. guilliermondii FM은 다른 균주에 비하여 발효 전 보다 2배가량의 소거 활성(약 48%)을 보였으며, 이어 L. plantarum, B. longum, L. mesenteroides 순으로 높은 소거능을 보였다. 꽃송이버섯은 항산화제인 비타민 C와 비타민 E의 함량이 아위버섯이나 소나무잔나비버섯보다 1.
- guilliermondii FM을 이용한 발효물이 유의적으로 높은 함량을 보였다. 특히 M. guilliermondii FM을 이용한 발효물은 L. plantarum을 이용한 발효물보다 호중구 함량에서 약 1.32배 높은 값을 보였으며, 단핵구 함량은 정상군보다 높은 함량을 보였다. 주로 과일 표면 등에서 많이 발견되는 자연균주인 M.
후속연구
- 이상의 결과를 종합하면 꽃송이버섯으로부터 분리한 균주인 M. guilliermondii FM은 항산화 및 면역 활성 증가를 위한 꽃송이버섯 발효물 제조 시 스타터로 활용 가능할 것으로 생각한다.
- 수용성 비타민 중 하나인 riboflavin은 인체의 면역체계에서 염증을 유발하는 매개체 생산을 억제하는 역할을 하는데(45,46), 특히 식세포의 포식작용을 향상시키고 호중구를 자극하여 면역력을 향상시키는 역할을 한다(47,48). 혈액 중 백혈구 함량 측정 결과 M. guilliermondii FM을 이용한 꽃송이버섯 발효물을 투여받은 rat에서 백혈구 함량이 높게 나온 것은 M. guilliermondii FM의 발효과정 중 생합성된 riboflavin이 작용한 결과로 판단되며 이에 관한 추가적인 연구가 필요하다고 생각한다.
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