Lipopolysaccaride로 유도된 Raw 264.7 세포에서 큰열매모자반 에탄올 추출물의 항염증 활성 Anti-inflammatory Activities of an Ethanol Extract of Sargassum macrocarpum in Lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 Macrophages원문보기
본 연구에서는 갈조류인 큰열매모자반에탄올 추출물(Ethanol extract of Sargassum Macrocarpum, EESM)의 항염증 활성을 조사하였다. Lipopolysaccharide (LPS)로 염증이 유도된 RAW 264.7 대식세포에서 EESM에 의한 항염증 효과를 조사한 결과 EESM은 nitric oxide (NO)와 prostaglandin$E_2$ ($PGE_2$)의 분비를 억제하는 결과를 보였고, 이는 inducible NO synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 발현 역시 억제하였다. 또한 전염증성 사이토카인인 tumor necrosis factor-alpha ($TNF-{\alpha}$)와 interleukin 1 beta ($IL-1{\beta}$)의 발현도 억제하였다. 이러한 염증반응이 어떤 신호경로를 통해 일어나는지 알아보기 위해 nuclear factor kappa B ($NF-{\kappa}B$), phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/Akt 그리고 mitogen-activated protein kinases (MAPKs)신호전달 경로를 조사한 결과 EESM에 의해 $NF-{\kappa}B$가 세포질에서 핵으로 이동과 Akt 단백질의 인산화가 억제되었고 MAPK에 속하는 kinase 중 ERK의 단백질 인산화가 억제되었다. 따라서 EESM이 $NF-{\kappa}B$ 신호계를 포함한 PI3K/Akt 및 MAPK/ERK 신호경로를 동시에 관여하고 있음을 알 수 있었다. 또한 heme oxygenase-1 (HO-1)과 그 전사 인자인 nuclear factor-E2-related factor 2 (Nrf2)의 단백질 발현에 미치는 영향을 분석한 결과 EESM에 의해 HO-1 및 Nrf2의 발현이 증가됨을 보였다. 본 연구 결과 EESM은 높은 항염증 활성을 갖는 것으로 확인되였으며 향후 잠재적인 기능성 소재로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 갈조류인 큰열매모자반 에탄올 추출물(Ethanol extract of Sargassum Macrocarpum, EESM)의 항염증 활성을 조사하였다. Lipopolysaccharide (LPS)로 염증이 유도된 RAW 264.7 대식세포에서 EESM에 의한 항염증 효과를 조사한 결과 EESM은 nitric oxide (NO)와 prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$)의 분비를 억제하는 결과를 보였고, 이는 inducible NO synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 발현 역시 억제하였다. 또한 전염증성 사이토카인인 tumor necrosis factor-alpha ($TNF-{\alpha}$)와 interleukin 1 beta ($IL-1{\beta}$)의 발현도 억제하였다. 이러한 염증반응이 어떤 신호경로를 통해 일어나는지 알아보기 위해 nuclear factor kappa B ($NF-{\kappa}B$), phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/Akt 그리고 mitogen-activated protein kinases (MAPKs) 신호전달 경로를 조사한 결과 EESM에 의해 $NF-{\kappa}B$가 세포질에서 핵으로 이동과 Akt 단백질의 인산화가 억제되었고 MAPK에 속하는 kinase 중 ERK의 단백질 인산화가 억제되었다. 따라서 EESM이 $NF-{\kappa}B$ 신호계를 포함한 PI3K/Akt 및 MAPK/ERK 신호경로를 동시에 관여하고 있음을 알 수 있었다. 또한 heme oxygenase-1 (HO-1)과 그 전사 인자인 nuclear factor-E2-related factor 2 (Nrf2)의 단백질 발현에 미치는 영향을 분석한 결과 EESM에 의해 HO-1 및 Nrf2의 발현이 증가됨을 보였다. 본 연구 결과 EESM은 높은 항염증 활성을 갖는 것으로 확인되였으며 향후 잠재적인 기능성 소재로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
Sargassum macrocarpum is a widely distributed marine brown algae found in the North Pacific. The objective of this study was to evaluate the anti-inflammatory activity of an ethanol extract of S. macrocarpum (EESM). First, we investigated the anti-inflammatory activities of EESM in lipopolysaccharid...
Sargassum macrocarpum is a widely distributed marine brown algae found in the North Pacific. The objective of this study was to evaluate the anti-inflammatory activity of an ethanol extract of S. macrocarpum (EESM). First, we investigated the anti-inflammatory activities of EESM in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 macrophages. EESM treatment suppressed nitric oxide (NO) and prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) production and inhibited the expressions of the inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) at the mRNA and protein levels. In addition, the expression of pro-inflammatory cytokines, such as tumor necrosis $factor-{\alpha}$ ($TNF-{\alpha}$) and interleukin-1 beta ($IL-1{\beta}$), was decreased in a dose dependent manner. Investigation of the signaling pathways of nuclear factor kappa B ($NF-{\kappa}B$), phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/Akt, and mitogen-activated protein kinases (MAPKs) revealed suppression of $NF-{\kappa}B$ translocation from the cytosol to nucleus by EESM treatment. The phosphorylation of the Akt and ERK proteins was also inhibited by EESM treatment. EESM treatment also stimulated the expression of the heme oxygenase-1 (HO-1) enzyme and its upstream transcription factor, nuclear factor-E2-related factor 2 (Nrf2). These results suggest that EESM has anti-inflammatory activity and could have potential uses in the field of nutraceuticals.
Sargassum macrocarpum is a widely distributed marine brown algae found in the North Pacific. The objective of this study was to evaluate the anti-inflammatory activity of an ethanol extract of S. macrocarpum (EESM). First, we investigated the anti-inflammatory activities of EESM in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 macrophages. EESM treatment suppressed nitric oxide (NO) and prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) production and inhibited the expressions of the inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) at the mRNA and protein levels. In addition, the expression of pro-inflammatory cytokines, such as tumor necrosis $factor-{\alpha}$ ($TNF-{\alpha}$) and interleukin-1 beta ($IL-1{\beta}$), was decreased in a dose dependent manner. Investigation of the signaling pathways of nuclear factor kappa B ($NF-{\kappa}B$), phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/Akt, and mitogen-activated protein kinases (MAPKs) revealed suppression of $NF-{\kappa}B$ translocation from the cytosol to nucleus by EESM treatment. The phosphorylation of the Akt and ERK proteins was also inhibited by EESM treatment. EESM treatment also stimulated the expression of the heme oxygenase-1 (HO-1) enzyme and its upstream transcription factor, nuclear factor-E2-related factor 2 (Nrf2). These results suggest that EESM has anti-inflammatory activity and could have potential uses in the field of nutraceuticals.
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문제 정의
갈조류에 속하는 큰열매모자반(Sargassum macrocarpum)은 국내에는 남해안, 제주도연안에 분포되어 있으며, 현재까지 항균활성[29]과 신경세포보호[26]의 기능이 알려진 바 있으나 항염증 효과에 대한 연구는 부족한 실정이다. 이에 본 연구에서는 큰열매모자반 에탄올 추출물이 LPS로 염증이 유도된 RAW 264.7 대식세포에서 미치는 항염증 효과에 대하여 알아보고자 하였다.
제안 방법
LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 EESM의 농도별 처리에 의한 PGE2및 TNF-α, IL-1β의 전염증성 cytokine의 생성량을 Prostaglandin E2 EIAkit (Cayman, AnnArbor, Michigan, USA)와 Quantikine ELISA kit (R&D systems, Minneapolis, USA)를 사용하여 측정하였다. 동일한 조건에서 배양된 RAW 264.
RAW 264.7 세포에서 EESM의 세포독성을 알아보기 위해 농도별의 EESM처리와 LPS (100 ng/ml)단독 및 LPS 1시간 후 처리한 조건에서 MTT assay를 실시하였다. Fig.
Inducible NOS (iNOS)는 평소에 발현되지 않다가 전염증성 cytokine이나 LPS 등에 의해 자극을 받으면 대식세포에서 과량 발현되면서 많은 양의 NO를 생성하게 되고, 이는 염증을 유발하여 조직의 손상을 가져오는 것으로 알려져 있다[28, 30]. 따라서 EESM 처리에 의한 NO 생성 정도를 측정하기 위하여 RAW 264.7 세포를 LPS로 자극시킨 후, NO와 iNOS 발현 양상을 확인하였다. 그 결과 Fig.
앞선 염증성 매개 물질들이 어떤 기전을 통해 염증효과가 조절되는지 확인하기 위해 NF-ĸB와 PI3K/Akt경로 그리고 MAPKs 신호 경로를 확인하였다. NF-ĸB는 세포 내에서 반응하는 전사 인자로서 염증성 효소와 부착분자의 발현을 조절한다[10].
염증 매개 물질의 전사인 NF-κB의 조절을 알아보기 위하여 핵과 세포질에서의 발현 양상을 NE-PER Nuclear and Cytosplasmic Extraction Reagents kit (Thermo Scientific, IL, USA)를 이용하여 비교하였다. RAW 264.
또한, 세포에서 분비되는 전염증성 cytokine은 염증 반응을 유발하는 면역 조절 물질로 ‘종양괴사인자’인 TNF-α와 정상적인 상태에서 낮은 농도로 생성되어 인체의 항상성유지에 작용하지만, 염증성 cytokine으로 과도하게 분비되면 다양한 질병을 일으키는 IL-1β 등이 존재한다[8, 18, 27]. 이러한 원리에 근거하여 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 PGE2와 TNF-α, IL-1β의 염증성 cytokine의 생성량을 측정하였다. 그 결과 LPS를 단독으로 처리하였을 때 현저하게 증가한 PGE2발현이 EESM을 처리하였을 때 농도 의존적으로 감소되었고, COX-2 발현 양상 역시 mRNA와 단백질 측면에서 비교했을 때 유의하게 억제되는 것으로 나타났으며, TNF-α, IL-1β 역시 같은 양상을 보였다(Fig.
대상 데이터
본 실험에서 사용된 큰열매모자반 70% 에탄올 추출물(Ethanol Extract of Sargassum macrocarpum,EESM)은 2007년 제주도 북촌 다려도에서 채집한 것으로 제주테크노파크 생물종다양성연구소(Jeju Biodiversity Research Institue)에서 구입하여 -20℃에서 저장하며 사용하였다.
염증 반응에 미치는 EESM의 영향을 조사하기 위해 사용된 murine macrophage cell line인 RAW 264.7 세포는 American Type culture collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하여 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, WELGENE, Daegu, Republic of Korea)에 10% Fetal bovine serum (FBS, WELGENE)을 첨가하여 37℃, 5% CO2의 환경에서 48시간 배양하였다.
이론/모형
EESM이 mRNA 수준에서 염증과 관련된 전사 인자들의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 RT-PCR을 실시하였다. 농도별로 EESM을 처리하고 1시간 후 LPS를 처리하여 배지를 제거한 후 trizol (Invitrogen Co.
NF-κB의 핵과 세포질 발현 양상을 시각적으로 확인하기 위해 면역세포화학을 실시하였다. 세포 배양용 4 well cell culture slide (SPL, Gyeonggi-do, Republic of Korea)에 RAW 264.
성능/효과
7 세포에서 PGE2와 TNF-α, IL-1β의 염증성 cytokine의 생성량을 측정하였다. 그 결과 LPS를 단독으로 처리하였을 때 현저하게 증가한 PGE2발현이 EESM을 처리하였을 때 농도 의존적으로 감소되었고, COX-2 발현 양상 역시 mRNA와 단백질 측면에서 비교했을 때 유의하게 억제되는 것으로 나타났으며, TNF-α, IL-1β 역시 같은 양상을 보였다(Fig. 2, Fig.
MAPKs 경우 JNK, p38은 큰 차이를 보이지 않았으며 ERK의 인산화가 LPS 자극에 의해 증가하고 EESM에 의해 인산화가 억제되는 것으로 나타났다. 이상의 결과에서 EESM이 RAW 264.7 세포에서 NF-κB 신호계를 포함한 PI3K/Akt 및 MAPK/ERK 신호경로를 동시에 관여하고 있음을 알 수 있었다.
후속연구
본 연구 결과 갈조류인 큰열매모자반은 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 NF-κB의 활성과 PI3K/Akt 및 MAPK/ERK 신호 경로의 활성화를 통하여 HO-1과 Nrf2의 단백질 발현과 함께 다양한 염증 관련 인자의 감소를 통해 염증을 억제시키는 것으로 나타나, 항염증 건강 기능 식품 소재로서의 활용이 가능할 것이라고 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
RAW 264.7 대식세포는 무엇으로 염증이 유도된 것인가?
본 연구에서는 갈조류인 큰열매모자반 에탄올 추출물(Ethanol extract of Sargassum Macrocarpum, EESM)의 항염증 활성을 조사하였다. Lipopolysaccharide (LPS)로 염증이 유도된 RAW 264.7 대식세포에서 EESM에 의한 항염증 효과를 조사한 결과 EESM은 nitric oxide (NO)와 prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$)의 분비를 억제하는 결과를 보였고, 이는 inducible NO synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 발현 역시 억제하였다.
염증(inflammation)이란?
염증(inflammation)은 조직이나 생채에 물리적 작용 또는 화학 물질, 유해 자극 등 외부 물질이 체내로 유입되었을 때 일어나는 생체 방어 반응이지만 비정상적인 염증 반응이 일어나면 과도한 염증 매개 물질이 생성되고, 그 결과 만성 염증성 질환이 나타난다[2, 14]. 대식세포는 조직과 장기에 존재하는 면역세포로서 손상된 부위를 회복시키기 위해 활성화된다[1].
대식세포는 조직과 장기에 존재하는 면역세포로서 손상된 부위를 회복시키기 위해 활성화되는데 어떤 염증 매개 물질의 분비를 촉진하는가?
대식세포는 조직과 장기에 존재하는 면역세포로서 손상된 부위를 회복시키기 위해 활성화된다[1]. Nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2)와 tumor necrosis factor-α (TNF-α) 및 interleukin-1β (IL-1β)와 같은 cytokines 등의 염증 매개 물질의 분비를 촉진한다. 염증 반응에 의해 생성되는 NO는 매우 반응성이 큰 물질로 inducible NO synthase (iNOS)로부터 생산되며 그 자체로 조직 손상과 염증을 유발시킬 뿐만 아니라 염증 매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 악화시키는 것으로 알려져 있다[1].
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