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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 뽕나무의 어린 가지인 상지에 배양한 상황버섯 균사체 유래 다당류를 추출하였고, 분리 및 정제를 통해 얻은 분획물의 면역증강 효과를 확인하기 위해 nitric oxide 및 이와 관련된 cytokine인 TNF-α, IL-6 생성 량과 유전자 발현 정도를 분석하여 면역증진 기능성식품 소재로서의 활용 가능성을 조사하였다.
- 본 연구에서는 상지에 배양한 상황버섯 균사체 유래 다당류의 기능성 식품 소재로의 활용 가능성을 확인하기 위해 조다당류의 분리 및 정제를 통해 분획을 얻었으며, 다양한 면역 증강 효과를 확인하였다. 건조된 조다당류를 DEAE-sepharose CL-6B를 이용하여 크로마토그래피한 후 340 nm 에서의 흡광도, 단백질, 당 및 uronic acid 함량을 분석한 결과, 증류수로 용출되는 비흡착 분획(PF-1, 분획번호 3~ 15)과 흡착된 후 NaCl 용액에 의해 용출되는 분획(PF-2, 분획번호 24~33)을 얻었다.
제안 방법
- TNF-α 및 IL-6 생성량은 kit에 포함된 TNF-α 및 IL-6의 농도별 표준곡선을 이용하여 계산하였다.
- 배양된 세포를 모아 원심분리 (1,000×g, 3분, Gyro 1236 MG, Gyrozen, Daejeon, Korea) 하여 상층액을 제거하고, PBS로 cell을 세척한 후 pellet을 얻어 Rneasy mini kit(Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 얻은 RNA(1 μg)를 Revertaid first strand cDNA synthesis kit(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)으로 cDNA를 합성하여 RT-PCR(Mastercycler® nexus, Eppendorf, Hamburg, Germany)을 수행하였다.
- 배양이 완료된 후 상등액 50 μL에 동량의 Griess 시약(Sigma-Aldrich Co.)을 혼합하여 10분간 반응시킨 후 microplate reader(UVM-340, ASYS Co.)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으 며, nitric oxide 생성량은 sodium nitrite(Sigma-Aldrich Co.)의 농도별 표준곡선을 이용하여 계산하였다.
- 배양이 완료된 후 상등액을 이용하여 TNF-α 및 IL-6 생성량을 ELISA kit(Pepro Tech Inc., Rocky Hill, NJ, USA)으로 측정하였다.
- 사용된 primers sequence는 Table 1과 같으며, PCR 조건은 94 °C-30초(denaturation), 55°C-30초(annealing), 72°C-1 분(extension)으로 28회 증폭 후 72°C(re-extension)로 PCR 산물을 획득하였고, Eco view(Dae Myung Science Co., Ltd., Seoul, Korea)를 포함한 1% agarose gel 상에서 전기 영동(Mupid-ex, Advance, Tokyo, Japan) 한 다음, 밴드의 강도를 Image J(National Institutes of health, Bethesda, MD, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석 정량하였다.
- 상지에 배양한 상황버섯 균사체 유래 조다당류의 추출은 열풍 건조된 30 g의 상황버섯 균사체 분말에 증류수를 고형분 대비 20배 첨가하여 121°C, 1.2기압에서 3시간 동안 추출하였다.
- 상지에 배양한 상황버섯 균사체에서 추출 및 분리한 물질이 다당류임을 확인하기 위하여 DEAE-sepharose CL-6B column chromatography를 수행하였으며, 분리한 조다당류를 칼럼에 loading 한 결과는 Fig. 1과 같다. 흡착되지 않은 F1 분획(분획번호 3~15)과 흡착된 후 NaCl 용액에 의해 용출되는 F2 분획(분획번호 24~33)의 340 nm에서의 흡광 도, 총단백질, 총당 및 uronic acid 함량을 분석한 결과 두개의 elution pattern을 보여주었다.
- 세포독성은 MTT assay(26)로 측정하였으며, RAW 264.7 세포를 5×104 cells/well이 되도록 96-well plate에 처리하여 배양기에서 24시간 배양한 후, 각 well에 농도별로 제조한 다당류 시료 및 lipopolysaccharide(LPS 100 ng/mL, Sigma-Aldrich Co.)를 처리하고 22시간 배양하였다.
- 0)로 평형화한 후 0~1 M NaCl로 농도구배를 주어 유속 1 mL/min으로 10 mL씩 분취하여 340 nm에서의 흡광도, 총단백질, 총당 및 uronic acid를 측정한 후 용출 양상에 따라 획분을 수집하고 증류수로 투석 및 농축한 다음 동결 건조하여 -70°C에 보관하면서 실험에 사용하였다. 수율은 동결 건조(FreeZone 2.5, Labconco Co.)한 후 건물 중량을 구하였고 시료 조제에 사용한 원료 건물량에 대한 백분율로 나타내었다.
- 일반적으로 대식세포 에서 TNF-α, IL-6 및 LPS와 같은 염증성 자극으로 iNOS 및 COX-2를 발현시켜 NO와 PGE2를 생성한다(17-19). 시료를 대식세포주와 함께 배양한 후 total RNA를 추출하여 역전사 효소로 cDNA를 합성하고 primer를 이용하여 중합 효소연쇄반응(PCR)으로 mRNA 발현량을 증폭시켜 나타내었다. 그 결과 무처리군에서는 iNOS 및 TNF-α의 발현이 나타나지 않았고, P를 제외한 PF-1 및 PF-2에서 iNOS, COX-2, TNF-α 및 IL-6의 발현이 높게 나타났다.
- 여과된 용액은 감압농 축기(N-1N, Eyela Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 감압 농축한 뒤, 농축액 대비 5배량의 에탄올을 첨가하여 24시간 교반하고 원심분리(3,000×g, 20분) 하여 조다당류를 회수 하였고, 동결건조기(Free Zone 2.5, Labconco Co., Kansas, MO, USA)로 건조하여 -70°C 이하의 암소에 보관하면서 분리 및 정제용 시료로 사용하였다.
- 이에 대식세포주에 대한 세포독성이 없는 것으로 판단되는 1~100 μg/mL 농도에서 상황버섯 균사체 다당류 분리정제물의 대식세포주에 대한 in vitro 기능적 특성을 확인하였다(Fig. 2B).
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 상황버섯 균사체(Phellinus linteus mycelium)는 국내에서 생산한 것을 (주)류충현약용버섯 (Andong, Korea)에서 제공받아 이용하였다. 즉 균사체의 배양은 상지를 음지에서 자연 건조하여 수분이 30~40%일때 절단 및 분쇄한 뒤, 121°C, 1.
- 상지 고체배지에 액체 종균 5%를 접종하고 25°C에서 15일간 정치 배양하여 상황버섯 균사체를 얻었으며, 균사체는 50°C에서 24시간 열풍 건조 하였고, 분쇄기(FM-909W, Hanil, Co., Sejong, Korea)로 분쇄하여 60 mesh 표준망체(Chung Gye Sang Gong Sa, Seoul, Korea)를 통과한 분말을 -20°C 이하의 암소에 보관 하면서 추출용 시료로 사용하였다.
- 40071) 세포는 한국세포주은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포배양은 DMEM 배지(Welgene, Daegu, Korea)를 이용하여 각각 10% fetal bovine serum(Gibco BRL Co., Grand Island, NY, USA), 2% penicillin streptomycin(Gibco BRL Co.)을 첨가하여 배양하였다. 세포는 모두 37°C, 5%로 조절된 CO₂incubator(MCO-18AIC, SANYO Co.
- 실험에 사용한 대식세포주인 RAW 264.7(KCTC No. 40071) 세포는 한국세포주은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포배양은 DMEM 배지(Welgene, Daegu, Korea)를 이용하여 각각 10% fetal bovine serum(Gibco BRL Co.
데이터처리
- 실험결과는 3회 반복실험의 평균±표준편차로 나타내었고 SPSS(version 19.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 분산분석(ANOVA)을 시행하였으며, 각 측정 평균 값의 유의성(P<0.05)은 Duncan’s multiple range test로 검정하였다.
이론/모형
- β-Glucan 함량은 Choi 등(25)의 방법으로 betaglucan assay kit(Megazyme International Ireland Limited, Bray, Ireland)으로 측정하였으며, total glucan과 glucan 이외의 당 함량을 구한 다음 α-glucan과 glucan 이외의 당 함량 간의 차이로부터 함량을 계산하였다.
- Cytokine 생성량은 Cho 등(28)의 방법으로 RAW 264.7 세포를 5×105 cells/well이 되도록 24-well plate에 처리하여 배양기에서 24시간 배양한 후, 각 well에 농도별로 제조한 다당류 시료 및 LPS(100 ng/mL, Sigma-Aldrich Co.) 를 처리하고 22시간 배양하였다.
- Nitric oxide 생성량은 Han 등(27)의 방법으로 RAW 264.7 세포를 5×104 cells/well이 되도록 96-well plate에 처리하여 배양기에서 24시간 배양한 후, 각 well에 농도별로 제조한 다당류 시료 및 LPS(100 ng/mL, Sigma-Aldrich Co.)를 처리하고 22시간 배양하였다.
- RT-PCR은 Lee와 Hong(29)의 방법으로 RAW 264.7 세포를 1.5×106 cells/well이 되도록 6-well plate에 처리하여 배양기에서 24시간 배양한 후, 각 well에 농도별로 제조한 다당류 시료 및 LPS(100 ng/mL, Sigma-Aldrich Co.)를 처리하고 6시간 배양하였다.
- )을 이용하여 작성한 표준 곡선으로부터 함량을 계산하였다. Uronic acid 함량은 Cesaretti 등(24)의 방법으로 microplate reader(UVM-340, ASYS Co., Eugendorf, Austria)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, galacturonic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 계산하였다. β-Glucan 함량은 Choi 등(25)의 방법으로 betaglucan assay kit(Megazyme International Ireland Limited, Bray, Ireland)으로 측정하였으며, total glucan과 glucan 이외의 당 함량을 구한 다음 α-glucan과 glucan 이외의 당 함량 간의 차이로부터 함량을 계산하였다.
- 다당류의 분리 및 정제는 Jung 등(21)의 방법으로 조다당류를 50 mM sodium phosphate buffer(pH 6.0)에 용해(50 mg/mL) 및 원심분리(3,000×g, 20분, VS-6000CFN, Vision Scientific Co., Ltd., Bucheon, Korea) 하여 불용성 물질을 제거한 다음 DEAE-sepharose CL-6B(Amersham Biosciences Co., Piscataway, NJ, USA)를 충진제로 이용하여 column(2.5×30 cm)에 충진시키고, 50 mM sodium phosphate buffer(pH 6.0)로 평형화한 후 0~1 M NaCl로 농도구배를 주어 유속 1 mL/min으로 10 mL씩 분취하여 340 nm에서의 흡광도, 총단백질, 총당 및 uronic acid를 측정한 후 용출 양상에 따라 획분을 수집하고 증류수로 투석 및 농축한 다음 동결 건조하여 -70°C에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- Louis, MO, USA)를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 계산하 였다. 총단백질 함량은 Lowry 등(23)의 방법으로 분광광도계(Ultraspec-2100pro, Amersham Co.)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준물질로는 bovine serum albumin(Sigma-Aldrich Co.)을 이용하여 작성한 표준 곡선으로부터 함량을 계산하였다. Uronic acid 함량은 Cesaretti 등(24)의 방법으로 microplate reader(UVM-340, ASYS Co.
- 총당 함량은 phenol-sulfuric acid 방법(22)으로 분광광도계(Ultraspec-2100pro, Amersham Co., Uppsala, Sweden)를 사용하여 470 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 표준 물질로는 glucose(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 계산하 였다. 총단백질 함량은 Lowry 등(23)의 방법으로 분광광도계(Ultraspec-2100pro, Amersham Co.
성능/효과
- 반면 TNF-α가 지나치게 다량 분비되면 염증 반응에 관여하는데, 이에 식품과 관련된 연구에서는 양성대조군인 LPS 증가 수준의 상승을 지표로 보고 있다(41). IL-6 생성량은 무처리군 및 P에서는 IL-6가 18.54~21.95%로 미미하게 생성되었으나, 분획물 처리군에서는 농도 의존적으로 생성됨을 확인하였다. 특히 분획물 처리군의 경우 100 μg/mL 농도에서 PF-1 및 PF-2에서 각각 42.
- Nitric oxide 생성량은 PF-1 100 μg/mL에서는 nitric oxide 생성량이 23.11 μM로 나타나 양성대조군으로 사용된 LPS 100 ng/mL 처리군(30.30 μM)의 약 76%의 효과가 있는 것으로 확인되었으며, cytokine 생성량(TNF-α 및 IL-6) 또한 무처리군에 비하여 높은 생성량을 나타내었다.
- DEAE-sepharose CL-6B column chromatography를 통해 분리된 분획물을 투석 후 동결 건조하여 유용성분의 함량을 분석한 결과는 Table 2와 같다. P, PF-1 및 PF-2의 총당 함량은 각각 39.17%, 75.51% 및 52.38%로 DEAEsepharose CL-6B에 흡착되지 않은 중성당 분획물인 PF-1에서 가장 많이 함유되어 있었다. 총단백질 함량은 P에서 9.
- PF-1 및 PF-2에 대해 대식세포주에 처리하여 세포생존율을 확인한 결과 100 μg/mL 농도까지 유의적으로 세포사멸이 나타나지 않아 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다.
- 30 μM)의 약 76%의 효과가 있는 것으로 확인되었으며, cytokine 생성량(TNF-α 및 IL-6) 또한 무처리군에 비하여 높은 생성량을 나타내었다. Polymerase chain reaction을 통한 면역 관련 유전자 발현 분석 결과, iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6에서 PF-1 분획에서 높은 발현량을 나타내어 면역 증강을 목적으로 한 기능성 식품 개발에 활용 가능하다고 판단된다.
- TNF-α 생성량은 무처리군(8.64%)에 비하여 높은 TNF-α를 생성하였으며, 3종의 다당류를 1~100 μg/mL의 농도로 처리한 경우 농도 의존적으로 TNF-α의 생성이 증가 하였다.
- 이는 DEAE-sepharose CL-6B regin이 단백질을 대부분 흡착시키기 때문으로 판단된다. Uronic acid 함량은 대부분이 당으로 구성된 PF-1에서 17.53%로 가장 많이 함유되어 있었고, PF-2 및 P에서 각각 15.04% 및 12.25%로 PF-1보다 적게 함유되어 있었다. Uronic acid 함량이 높은 다당류는 면역 및 항보체 활성 등을 갖는 것으로 보고되어 (30), 대식세포에서 cytokine 생성 및 면역 관련 유전자 발현에 효과가 있을 것으로 판단된다.
- 본 연구에서는 상지에 배양한 상황버섯 균사체 유래 다당류의 기능성 식품 소재로의 활용 가능성을 확인하기 위해 조다당류의 분리 및 정제를 통해 분획을 얻었으며, 다양한 면역 증강 효과를 확인하였다. 건조된 조다당류를 DEAE-sepharose CL-6B를 이용하여 크로마토그래피한 후 340 nm 에서의 흡광도, 단백질, 당 및 uronic acid 함량을 분석한 결과, 증류수로 용출되는 비흡착 분획(PF-1, 분획번호 3~ 15)과 흡착된 후 NaCl 용액에 의해 용출되는 분획(PF-2, 분획번호 24~33)을 얻었다. 분획물 PF-1 및 PF-2의 유용 성분 함량으로 총당 함량은 각각 75.
- 그 결과 무처리군에서는 iNOS 및 TNF-α의 발현이 나타나지 않았고, P를 제외한 PF-1 및 PF-2에서 iNOS, COX-2, TNF-α 및 IL-6의 발현이 높게 나타났다.
- 대식세포 주에 대한 세포생존율을 확인한 결과 모든 시료의 농도 0.1~100 μg/mL에서 100% 이상의 생존율을 나타내어 양성 대조군으로 사용된 LPS 100 ng/mL 처리구(92.82%)보다 높은 생존율을 나타내었다(Fig. 2A).
- 2B). 무처리 대조군에 비하여 다당류 분획물 시료 농도가 증가함에 따라 nitric oxide 생성량이 증가하였으며, 모든 농도에서 PF-1이 가장 높은 함량을 나타내었다. 특히 PF-1 100 μg/mL에 서는 nitric oxide 생성량이 23.
- Uronic acid 함량이 높은 다당류는 면역 및 항보체 활성 등을 갖는 것으로 보고되고 있는데(30), Table 2에서 나타낸 것 처럼 본 연구에서도 uronic acid 및 항암 및 면역 활성 물질로 인정되고 있는 β-glucan의 함량이 상대적으로 높은 PF-1 에서 면역 관련 유전자 발현이 높은 것을 확인하였다. 반면 P는 모든 면역 관련 유전자에서 무처리구 대비 0.95~1.96 으로 낮은 발현량을 보여 조다당류 추출물보다 다당류 정제 물에서 유전자 발현이 강하게 나타남을 확인하였다. 이를 통해 상황버섯 균사체 다당류 분획물의 면역 활성이 조다당류 추출물보다 유의적으로 높은 발현을 나타냄을 확인하였 으며, 특히 대식세포를 스스로 활성화함으로써 외부 항원으로부터 자극받지 않아도 면역반응이 일어나는 초기에 생체 방어에 유리한 작용을 할 것으로 판단된다.
- 분획물 PF-1 및 PF-2의 유용 성분 함량으로 총당 함량은 각각 75.51%, 52.38%, 총단백질 함량은 1.63%, 8.41%, uronic acid 함량은 17.53%, 15.04% 및 β-glucan 함량은 28.33%, 25.04%로 나타났다.
- 흡착되지 않은 F1 분획(분획번호 3~15)과 흡착된 후 NaCl 용액에 의해 용출되는 F2 분획(분획번호 24~33)의 340 nm에서의 흡광 도, 총단백질, 총당 및 uronic acid 함량을 분석한 결과 두개의 elution pattern을 보여주었다. 상지에 배양한 상황버섯 균사체로부터 추출된 조다당류(P)의 수율은 1.87%였고 조다당류로부터 분리 정제된 분획물은 각각 17.88%(PF-1) 및 15.55%(PF-2)였다(Table 2).
- 96 으로 낮은 발현량을 보여 조다당류 추출물보다 다당류 정제 물에서 유전자 발현이 강하게 나타남을 확인하였다. 이를 통해 상황버섯 균사체 다당류 분획물의 면역 활성이 조다당류 추출물보다 유의적으로 높은 발현을 나타냄을 확인하였 으며, 특히 대식세포를 스스로 활성화함으로써 외부 항원으로부터 자극받지 않아도 면역반응이 일어나는 초기에 생체 방어에 유리한 작용을 할 것으로 판단된다.
- 92%라고 보고하였다. 이에 본 연구의 상황버섯 균사체로부터 분리 정제된 분획물에는 고분자인 단백질과 다당이 대부분을 차지하고 있는 것으로 판단된다. Han 등(35)의 연구에서 영지버섯 추출물은 6.
- 38%로 DEAEsepharose CL-6B에 흡착되지 않은 중성당 분획물인 PF-1에서 가장 많이 함유되어 있었다. 총단백질 함량은 P에서 9.63%로 가장 많이 함유되어 있었고, 두 개의 분획물 중 PF-2에서 8.41%로 PF-1(1.63%)에 비해 많이 함유되어 있었다. 이는 DEAE-sepharose CL-6B regin이 단백질을 대부분 흡착시키기 때문으로 판단된다.
- 특히 50 μg/mL 이상 농도에서 분획물의 TNF-α 생성량이 99.62~100.76%로 양성대조군으로 사용된 LPS 100 ng/mL와 유사한 수준으로 대식세포를 활성화해 TNFα 생성이 증가함을 확인하였다.
- 특히 PF-1 100 μg/mL에 서는 nitric oxide 생성량이 23.11 μM로 나타나 양성대조군 으로 사용된 LPS 100 ng/mL 처리군(30.30 μM)의 약 76% 의 효과가 있는 것으로 확인되었다.
- 특히 무처리군 대비 TNF-α의 발현 정도는 PF-1 및 PF-2에서 각각 1.72 및 1.63으로 LPS 100 ng/mL(1.63)보다 높은 발현을 나타내어 TNF-α 생성량과 유사한 결과를 나타내었다.
- 항암 및 면역 활성 물질로 인정되고 있는 β-glucan 함량은 PF-1 및 PF-2에서 각각 28.33% 및 25.04%로 나타나 분획물에서 생리활성 효과가 기대되었다.
- 1과 같다. 흡착되지 않은 F1 분획(분획번호 3~15)과 흡착된 후 NaCl 용액에 의해 용출되는 F2 분획(분획번호 24~33)의 340 nm에서의 흡광 도, 총단백질, 총당 및 uronic acid 함량을 분석한 결과 두개의 elution pattern을 보여주었다. 상지에 배양한 상황버섯 균사체로부터 추출된 조다당류(P)의 수율은 1.
후속연구
- 또한, Lee 등(39)의 보고에 따르면 상황버섯 균사체 추출물이 면역계에 주요한 세포인 비장세포의 활성화에 미치는 영향을 검토한 결과 T세포 증식에 영향을 주는 면역 활성을 가지고 있음을 확인하였다. 따라서 분리된 상황버섯 균사체 다당류 분획물은 단독으 로도 대식세포의 nitric oxide 생산을 유도하여 면역 활성 물질로의 이용 가능성이 기대된다.
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