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문제 정의
- 이상의 결과를 통해 신소재인 겉보리 영지버섯 추출물에는 비극성 혹은 지용성의 기능성 성분이 있을 것으로 기대되며 추후 성분분석과 작용기전에 대한 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다. 따라서 겉보리 영지버섯 에탄올추출물은 항산화 및 항염증 효과를 지닌 기능성 식의약품 신소재로서 가능성을 제시하였다.
- 균주별로 차이는 있었지만 영지버섯 균사체추출물의 항염증 효능을 확인하였다. 따라서 겉보리 영지버섯 에탄올추출물의 항염증 효과가 있음을 시사하는 바이다.
- 따라서, 본 연구는 다양한 생리활성 기능을 가진 겉보리와 영지버섯의 생물전환 (bioconversion)과 추출 용매에 따른 항산화 활성과 항염증을 평가하여 기능성 식의약품 신소재로서의 가능성을 제시하고자 수행하였다.
- 본 연구는 겉보리에 영지버섯 균사체를 생물전환하여 겉보리 영지버섯이라는 신소재를 개발하고 겉보리 영지버섯 추출물의 항산화 및 항염증 효과를 알아보았다. 연구 결과 겉보리 영지버섯 에탄올추출물에서 비교적 높은 항산화 활성을 나타내었고 RAW264.
제안 방법
- 10 mΜ H2DCF-DA를 처리하고 40분 후 600 µM H2O2를 처리하여 1시간 후 fluorescence microplate readers (Soft Max Pro 5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 excitation 485 ㎚, emission 530 ㎚에서 측정하였다.
- 7은 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)로부터 구입하였고 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)과 fetal bovine serum (FBS) 및 penicillin-streptomycin (P/S) 등은 Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA)사의 제품을 사용하여 세포를 배양하였다. 10% FBS와 1% P/S가 포함된 DMEM 배지로 5% CO2, 37℃ incubator에서 3일 간격으로 계대 배양하였다.
- ABTS radical 소거활성은 Yoon 등 (2016)의 방법을 변형하여 측정하였다. 7 mM ABTS 수용액과 2.45 mM potassium persulphate를 혼합하여 암실상태에서 실온에 12 - 16시간 반응시킴으로써 안정적인 ABTS 양이온 용액을 만들었다. 준비한ABTS 양이온 용액을 0.
- DPPH radical 소거능은 Lee 등 (2015)의 방법을 변형하여 측정하였다. 농도 별로 제조한 시료 80 ㎕에 DPPH 용액(0.
- MTT를 이용하여 겉보리 영지 열수추출물이 LPS (1 ㎍/㎖)로 처리된 세포생존율에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, LPS 처리 군에서 약 65%로 세포수가 감소하였고 열수추출물은 농도가 높아질수록 세포생존율이 점점 감소하는 경향을 보였다.
- NO 생성은 아질산이나 아질산이온의 검출 및 정량에 사용되는 Griess 시약을 이용하여 측정하였다. 대조군에 비해 LPS 처리 시 NO는 약 5배 증가하였고, 겉보리 영지 열수추출물은 농도가 높아짐에도 불구하고 NO 생성에는 차이가 없었다.
- Park 등 (2013)은 균주별 영지버섯 균사체 추출물 100 ㎍/㎖에서 LPS를 처리한 세포생존율에서의 영향은 없고 NO 생성을 50 - 80%까지 억제하였다고 보고하였다. 균주별로 차이는 있었지만 영지버섯 균사체추출물의 항염증 효능을 확인하였다. 따라서 겉보리 영지버섯 에탄올추출물의 항염증 효과가 있음을 시사하는 바이다.
- 02이 되도록 희석하였다. 농도 별로 제조한 시료 200 ㎕에 ABTS 양이온 용액 800 ㎕를 혼합한 후 5분간 실온에서 반응시킨 후 734 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 5 ㎖를 첨가하여 centrifuge 에서 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상층액 5 ㎖에 증류수 5 ㎖, 0.1% FeCl3 1 ㎖을 첨가하여 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 세포 내에서 산화 스트레스에 의해 발생하는 ROS에 대한 겉보리 영지버섯 추출물의 억제활성을 알아보기 위해 RAW264.7에 H2O2로 산화 스트레스를 유도한 뒤 DCFH-DA probe를 이용하여 ROS의 양에 따른 형광발생 정도를 측정 하였다. H2DCF-DA는 세포 내 활성산소 (ROS) 표지자 등으로 사용하는 fluorescein이 화학적으로 환원된 형태로서 세포막을 통과하여 확산할 수 있다.
- 7에 대해 TNF-α, IL-6, IL-1β와 같은 proinflammatory cytokine을 증가시키고, NO, PGE2등의 염증매개물질을 분비한다 (Kim and Son, 2014). 이러한 LPS를 통해 RAW264.7에 염증을 유도한 후, 추출물의 각 농도에 대한 세포생존율 및 NO 생성에 대한 억제효과를 평가하였다. 특히 염증과 관련된 실험에서는 추출물 자체의 세포생존율을 참고하여 열수 및 에탄올 추출물의 농도를 다르게 처리하였다.
- 표준물질로 ascorbic acid를 이용하여 표준 검량선을 작성하고 ascorbic acid 함량을 시료 100 g 기준 ㎎•ascorbic acid으로 나타내었다.
- 환원력 측정은 Chung 등 (2005)의 방법을 변형하여 측정하였다. 농도 별로 제조한 시료 1 ㎖에 0.
대상 데이터
- Gallic acid, D-catechin, ascorbic acid, Folin-Ciocalteaureagent, sodium nitrite, metaphosphoric acid, 2,6-dichloroindophenol sodium salt hydrate, citiric acid, sodium citrate, acetic acid, anhydrous sodium phosphate (monobasic), 2,2-azino-bis (3-ethylbenzo thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), potassium persulfate, ferrous sulfate heptahydrate(FeSO4) 등 모든 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)사에서 구입하여 사용하였다.
- 마우스 대식 세포주인 RAW264.7은 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)로부터 구입하였고 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)과 fetal bovine serum (FBS) 및 penicillin-streptomycin (P/S) 등은 Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA)사의 제품을 사용하여 세포를 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 겉보리 (Hordeum vulgare L.)는 충청북도 충주시에서 생산되었으며, 영지버섯 균사체 (KTCT No. 26193)는 한국미생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, Jeongup, Korea)에서 구입하였다. 고압증기멸균기를 이용하여 가열 및 소재화한 겉보리를 배지로 하여 영지버섯 균사체를 접종시킨 후 온도 28℃, 습도 60%에서 40일간 배양하였다.
- 세포 실험을 위한 시약인 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), dimethyl sulfoxide(DMSO)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)사에서 구입하였고 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA)는 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)사에서 구입하여 실험에 이용하였다.
데이터처리
- Two-way analysis of variance followed by Dunnett’s t-test (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
- Two-way analysis of variance followed by Dunnett’s t-test(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
- 각 군 간의 측정치 비교는 Two-way ANOVA를 통해 bonferroni posttests로 유의성을 p< 0.05로 검증하였다.
- 모든 측정값은 3회 이상 반복하여 평균값과 표준편차(means ± SD)로 나타내었고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 Prism 5 GraphPad software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)를 이용 하였다.
이론/모형
- Ascorbic acid 함량은 Klein과 Perry (1982)의 방법으로 측정하였다. 시료 10 ㎎에 10 ㎎/㎖ metaphosphoric acid 1 ㎖을넣고 상온에서 45분간 반응 후 여과하였다.
- Flavonoid 함량은 Kim 등 (2013)의 방법으로 측정하였다. 시료 25 ㎕에 증류수 125 ㎕로 희석한 후 5% NaNO2 8 ㎕를 첨가한 후 5분간 상온에서 반응시켰다.
- Nitrite 소거활성은 Choi 등 (2008)의 방법을 이용하여 측정하였다. 농도 별로 제조한 시료 1 ㎖에 1 mM NaNO2 1 ㎖, 0.
- 총 phenolic compound 함량은 Folin-Ciocalteu’s 방법으로 측정하였다 (Seo et al., 2016).
- 활성 질소종인 nitric oxide (NO)의 생성량은 Green 등(1982)의 방법으로 측정하였다. RAW264.
성능/효과
- DPPH 라디칼 소거능은 DPPH가 비교적 안정한 자유 라디칼로 항산화 물질과 반응하면 산화성 자유 라디칼이 억제되어 안정한 형태로 전환되는 원리를 이용하여 다양한 화합물의 항산화 활성을 평가하기 위해 널리 사용된다 (Hu and Kitts, 2000). 겉보리 영지버섯 물 또는 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 그래프로 나타낸 것으로, 농도 2 ㎎/㎖ 에서 14.07% (GLHB-W), 30.15% (GLHB-E)로 나타났다. 대조군으로 사용한 ascorbic acid는 2 ㎎/㎖에서 101.
- 겉보리 영지버섯 열수 및 에탄올 추출물을 세포생존율을 측정한 결과, 열수 추출물은 50 ㎍/㎖에서 86.55%의 세포 생존율을 보였으며, 100 ㎍/㎖ 농도 이상에서는 농도가 높아짐에 따라 생존율이 낮아짐을 확인하였다. 반면 에탄올 추출물은 고농도인 3,000 ㎍/㎖에서도 92.
- 겉보리 영지버섯 열수 및 에탄올 추출물의 총 phenolic compound 함량은 각각 29.84 ㎎•GAE/100 g과 53.43 ㎎•GAE/100 g이고 flavonoid 함량은 각각 10.32 ㎎•CE/100 g과 13.31 ㎎•CE/100 g이며, ascorbic acid 함량은 각각 7.96 ㎎/100 g과 19.33 ㎎/100 g으로 나타났다.
- , 2008). 겉보리 영지버섯 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 그래프로 나타낸 것으로, 농도 2 ㎎/㎖에서 45.65% (GLHB-W), 71.24%(GLHB-E)로 나타났다. 대조군으로 사용한 ascorbic acid는 2 ㎎/㎖에서 101.
- , 2003). 겉보리 영지버섯 추출물의 환원력 측정한 결과농도 0.25 ㎎/㎖에서 ascorbic acid 다음으로 겉보리 영지버섯 에탄올추출물이 높은 환원력을 나타냈다 (Fig. 1D). Ascorbic acid 같은 reductone의 항산화 반응은 hydrogen atom을 제공하여 자유 라디칼 연쇄를 변환하여 일어나며, 또한 과산화의 일정한 전구물질과 반응하여 과산화의 형성을 방해한다.
- , 2003). 겉보리영지버섯 추출물의 nitrite 소거능을 그래프로 나타낸 것으로, 농도 2 ㎎/㎖에서 10.92%(GLHB-W), 18.74% (GLHB-E)로 나타났다. 대조군으로 사용한 ascorbic acid는 2 ㎎/㎖ 에서 58.
- MTT를 이용하여 겉보리 영지 열수추출물이 LPS (1 ㎍/㎖)로 처리된 세포생존율에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, LPS 처리 군에서 약 65%로 세포수가 감소하였고 열수추출물은 농도가 높아질수록 세포생존율이 점점 감소하는 경향을 보였다. 반면 에탄올추출물 3,000 ㎍/㎖의 농도에서 세포생존율이 유의적으로 증가하였다 (Fig.
- 높은 수율과 총 phenolic compound, flavonoid 및 ascorbic acid 함량을 나타내었던 겉보리 영지버섯 에탄올추출물은 열수 추출물에 비해 높은 DPPH 및 ABTS 라다칼 소거활성을 나타내었다. Ku 등 (2009)과 Park 등 (2016)이 보고한 총 phenolic compound 함량이 높을수록 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보이며, flavonoid 성분과 ABTS 라디칼 사이에도 높은 연관관계가 있다는 것을 확인하였다.
- 대조군에 비해 600 µM H2O2를 1시간 처리한 negative control의 intercellular ROS 생성은 약 1.2 - 1.5배 증가하였으며, 겉보리 영지버섯 추출물을 50 - 3,000 ㎍/㎖의 농도로 전처리한 경우 열수 추출물은 100 ㎍/㎖의 농도부터 ROS 생성이 증가하는 경향을 보였다.
- NO 생성은 아질산이나 아질산이온의 검출 및 정량에 사용되는 Griess 시약을 이용하여 측정하였다. 대조군에 비해 LPS 처리 시 NO는 약 5배 증가하였고, 겉보리 영지 열수추출물은 농도가 높아짐에도 불구하고 NO 생성에는 차이가 없었다. 반면 에탄올추출물은 농도의존적으로 감소하는 경향을 보였으며 3,000 ㎍/㎖의 농도에서 약 63%까지 저해되었다 (Fig.
- Flavonoid에 속하는 flavonol은 free radical과 반응하거나 전자를 제공하여 자유 라디칼의 연쇄반응을 종료한다고 보고되었다 (Wettasinghe and Shahidi, 1999). 따라서 겉보리 영지버섯 에탄올 추출물에서 비교적 높은 flavonoid 및 ascorbic acid 함량을 나타내어 비교적 높은 환원력이 있는 것으로 판단된다.
- 55%의 세포 생존율을 보였으며, 100 ㎍/㎖ 농도 이상에서는 농도가 높아짐에 따라 생존율이 낮아짐을 확인하였다. 반면 에탄올 추출물은 고농도인 3,000 ㎍/㎖에서도 92.82%의 생존율을 보임으로써 겉보리 영지버섯 에탄올추출물이 세포에 미치는 영향이 낮은 것으로 나타났다 (data not shown).
- 대조군에 비해 LPS 처리 시 NO는 약 5배 증가하였고, 겉보리 영지 열수추출물은 농도가 높아짐에도 불구하고 NO 생성에는 차이가 없었다. 반면 에탄올추출물은 농도의존적으로 감소하는 경향을 보였으며 3,000 ㎍/㎖의 농도에서 약 63%까지 저해되었다 (Fig. 4).
- 33 ㎎/100 g으로 나타났다. 비교적 높은 수율을 나타낸 겉보리 영지버섯 에탄올 추출물이 전반적으로 높은 총 phenolic compound, flavonoid 및 ascorbic acid 함량을 나타내었다.
- 이는 세포생존율의 감소로 인해 활성산소의 생성을 억제할 수 있는 능력이 상실되거나 미토콘드리아의 기능이상 등의 문제로 생겨난 활성산소의 증가로 인한 결과로 판단된다. 에탄올 추출물은 negative control(125.85%) 대비 농도의존적으로 92.26%까지 ROS 생성이 저해 되는 것을 확인하였다 (Fig. 2). 이상의 결과는 겉보리 영지버섯 에탄올추출물의 polyphenol 성분의 항산화 활성이 H2O2로 유도한 세포 내 ROS 소거능과 상관관계를 갖고 있는 것으로 사료된다.
- 본 연구는 겉보리에 영지버섯 균사체를 생물전환하여 겉보리 영지버섯이라는 신소재를 개발하고 겉보리 영지버섯 추출물의 항산화 및 항염증 효과를 알아보았다. 연구 결과 겉보리 영지버섯 에탄올추출물에서 비교적 높은 항산화 활성을 나타내었고 RAW264.7에서 H2O2로 유도한 ROS 생성 억제활성 및 LPS로 유도한 NO 생성 억제효과를 보였다. 이상의 결과를 통해 신소재인 겉보리 영지버섯 추출물에는 비극성 혹은 지용성의 기능성 성분이 있을 것으로 기대되며 추후 성분분석과 작용기전에 대한 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 2). 이상의 결과는 겉보리 영지버섯 에탄올추출물의 polyphenol 성분의 항산화 활성이 H2O2로 유도한 세포 내 ROS 소거능과 상관관계를 갖고 있는 것으로 사료된다.
후속연구
- 7에서 H2O2로 유도한 ROS 생성 억제활성 및 LPS로 유도한 NO 생성 억제효과를 보였다. 이상의 결과를 통해 신소재인 겉보리 영지버섯 추출물에는 비극성 혹은 지용성의 기능성 성분이 있을 것으로 기대되며 추후 성분분석과 작용기전에 대한 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다. 따라서 겉보리 영지버섯 에탄올추출물은 항산화 및 항염증 효과를 지닌 기능성 식의약품 신소재로서 가능성을 제시하였다.
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