[논문]부저병 원인균 Paenibacillus larvae 특이 유전자 분석을 통한 진단마커 발굴

나한흠; 김근철

doi:10.5352/jls.2017.27.1.67

초록
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부저병이란 Paenibacillus larvae감염에 의하여 꿀벌 유충의 괴사를 유도하는 질병이다. 우리나라에서는 2008년 봄, 국내에 처음으로 대량 발병 사례가 보고되었으며, 지속적인 2차 피해로 큰 후유증을 앓고 있다. 본 연구에서는 부저병을 효율적으로 관리할수 있는 진단방법을 조사하고자 하였다. 따라서 부저병의 원인균인 P. larvae에서 특이적으로 발현되고 있는 유전자들을 동정하고자 하였으며, 이 유전자들은 주로 부저병균의 독성을 유발하는 것으로 알려진 Toxin1, Toxin2A & 2B, SplA, CBP49, SevA&SevB 들이다. 이들은 1차 PCR 에서는 검출하기 어려웠지만, 2차 nested PCR방법을 이용하여 검출이 용이함을 알 수 있었다. 한편 여러가지 식물 추출물을 혼합한 배지에서 부저병균을 배양하였을 때, 부저병균의 성장저해와 일치하게 우리가 검증한 유전자들의 발현이 감소하는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과들은 부저병 원인균의 특이 유전자들은 향후 PCR진단마커로서 활용 가능성이 있을 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Foulbrood disease is infected by Paenibacillus larvae on larval stage of honeybee, and is lethal disease to result in population death. This disease was manifested in 2008 in Korea, is still suffered by the secondary damages. In this study, we are to examine diagnostic PCR approaches to manage the F...

Foulbrood disease is infected by Paenibacillus larvae on larval stage of honeybee, and is lethal disease to result in population death. This disease was manifested in 2008 in Korea, is still suffered by the secondary damages. In this study, we are to examine diagnostic PCR approaches to manage the Foulbrood disease. PCR amplification of 16S rRNA is generally using for microbial infection, but the specificity is little poor for the correct diagnosis. Therefore, we are to identify specific genes expressed in Paenibacillus larvae, and perform PCR analysis. We selected five distinct genes from literature references. Those genes are commonly known as toxic genes for host infection, and include Toxin1, Toxin2A & 2B, SplA, CBP49, and SevA&SevB. PCR amplification for these genes is difficult to detect at the first time. So, we performed the second PCR using the first PCR product as a template. This approach using the nested PCR was very useful for detecting large marker genes. When Paenibacillus larvae was cultured in the medium containing plant extracts, PCR amplification of the identified genes is correlated with the microbial growth inhibition. Therefore, these results suggest that the identified genes might be useful to study diagnostic PCR markers for honeybee Foulbrood disease.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 양봉산업의 부산물이 우리 경제에 차지하는 큰 비중에도 불구하고 아직 연구가 활발히 진행되어 있지 않은 꿀벌의 부저병을 효율적으로 관리하고, 진단할수 있는 방법을 조사하고자 하였다. 그 과정으로 PCR방법을 이용하여 부저병의 원인균인 P.

제안 방법

본 연구에서는 양봉산업의 부산물이 우리 경제에 차지하는 큰 비중에도 불구하고 아직 연구가 활발히 진행되어 있지 않은 꿀벌의 부저병을 효율적으로 관리하고, 진단할수 있는 방법을 조사하고자 하였다. 그 과정으로 PCR방법을 이용하여 부저병의 원인균인 P. larvae에서 특이적으로 발현되고 있는 유전자들에 대해 nested PCR방법을 사용하여 마커를 발굴하고, 항생작용에 대한 진단 마커로서의 가능성 여부를 적용 분석하고자 하였다.

대상 데이터

P. larvae 균주 시료는 국립농업과학원으로부터 동결건조 상태로 분양 받았으며, R2A 배지(Yeast extract, Proteose poptone No.3, Casamino acid, Glucose, Soluble Starch, Na-pyruvate)에 시료를 넣어 25℃에서 배양하였다.
토끼풀(Trifolium repens), 민들레(Taraxacum platycarpum),쑥(Artemisia princeps), 두충(Eucommia ulmoides) 등은 춘천 재래시장에서 유통되고 있는 재료를 구입하여 잘 말린 후, g 당 100 ml의 물을 넣어 5시간 열수 추출의 방법으로 추출물을 얻었으며, 배지를 제작할 때 10%(v/v) 추출물 용액을 넣어 배양하였다. 배양후 UV/VIS 광학분석기를 사용하여 흡광도 560 nm에서 성장저해 정도를 측정하였다.

데이터처리

제작된 프라이머를 이용하여 nested 방식의 PCR반응을 수행하였다. PCR 반응은10 ng DNA template, 10 pmol 의 primer 각각 1 μl, 2 mM dNTP 1 μl, 1 mg/ml BSA 1 μl, Mg²⁺ 10X buffer 2.

성능/효과

한편 식물 추출물을 혼합한 배지에서 부저병균을 배양하였을 때 부저병 특이 유전자들의 발현 양상을 비교 분석 하였다. 이를 위하여 1:100 희석된 토끼풀(Trifolium repens), 민들레(Taraxacum platycarpum), 쑥(Artemisia princeps), 두충(Eucommia ulmoides) 추출물을 넣고 27시간까지 배양을 유도하여 추출물이 부저병 균 성장에 미치는 영향을 조사한 결과 민들레, 쑥, 두충 추출물 배양에서 부저병 균의 성장이 저해됨을 알수 있었다(Fig. 4). 이때 우리가 조사했던 부저병 특이 유전자들의 발현을 분석한 결과 부저병균의 성장저해와 일치하게 해당 유전자들의 발현이 감소하는 것을 알 수 있었다.

후속연구

일부 미생물 배양을 통한 진단방법, 우유를 이용한 임상진단방법, rDNA를 이용한 PCR진단법이 사용되고 있지만, 특정 환경이 아니면 사용하기가 까다롭다. 본 연구를 통해 발굴된 진단 마커들은 부저병 원인균의 성장과 일치하여 발현의 변화가 잘 나타나는 것으로 보아 향후 더 많은 연구를 통하여 진단 키트 개발을 위한 진단마커로 활용될 가능성이 높을 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	부저병이란 어떤 질병인가?	부저병은 그람양성균인 Paenibacillus larvaer가 꿀벌 유충에 감염된 후, 부패되어 최종적으로 죽음에 이르는 질병이다[2]. P.
	지금까지 알려진 부저병 진단방법은 무엇인가?	지금까지 알려진 부저병 진단방법은 미생물학적 배양을 통한 PCR 진단 마커를 이용하는 방법과 임상증상으로 확인하는 방법이 있다[3]. PCR 마커를 이용하는 방법으로는 미국 부저병의 16S rRNA유전자를 표적하여 진단하는 방법이 알려져 있다[13].
	우리나라에서 부저병의 대량 발병 사례는 언제 처음으로 보고되었는가?	부저병이란 Paenibacillus larvae감염에 의하여 꿀벌 유충의 괴사를 유도하는 질병이다. 우리나라에서는 2008년 봄, 국내에 처음으로 대량 발병 사례가 보고되었으며, 지속적인 2차 피해로 큰 후유증을 앓고 있다. 본 연구에서는 부저병을 효율적으로 관리할수 있는 진단방법을 조사하고자 하였다.

참고문헌 (14)

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