Enterococcus faecium SA5의 기능적 특성과 인삼 ginsenoside Rb1의 전환 Functional Characteristics of Enterococcus faecium SA5 and Its Potential in Conversion of Ginsenoside Rb1 in Ginseng원문보기
본 연구는 몽골 마유로부터 분리한 유산균 Enterococcus faecium SA5의 이화학 특성을 파악하고 유산균 E. faecium SA5의 ${\beta}$-glucosidase의 활성과 이를 통한 ginsenoside 전환을 확인하는 것을 목표로 진행되었다. E. faecium SA5는 내산성, 내담즙성을 나타내었으며 4종의 병원성 미생물(Salmonella typhimurium KCTC 3216, Listeria monocytogenes KCTC 3710, Bacillus cereus KCTC 1012, Staphylococcus aureus KCTC 1621)에 항균 활성을 가질 뿐만 아니라 항생물질 colistin, gentamycin, neomycin에 내성을 나타내었다. 또한, E. faecium SA5는 bile salt hydrolase 활성을 나타내어 혈액 내 콜레스테롤 수준 감소 효과가 있다고 사료되며 10% skim milk에서 배양하였을 때, pH가 감소하고 산도 및 생균수가 증가하는 것으로 보아 발효유 스타터로써의 활성을 갖는 것으로 판단되었다. 또한 E. faecium SA5의 ${\beta}$-glucosidase에 의해 ginsenoside $Rb_1$이 ginsenoside $Rg_3-s$와 $Rg_3-r$으로 전환되었음을 TLC 분석을 통해 확인하였다. 따라서 E. faecium SA5는 잠재적인 probiotics로 이를 이용하여 발효유 제조 및 ginsenoside 전환 관련 건강기능식품 개발에 응용할 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구는 몽골 마유로부터 분리한 유산균 Enterococcus faecium SA5의 이화학 특성을 파악하고 유산균 E. faecium SA5의 ${\beta}$-glucosidase의 활성과 이를 통한 ginsenoside 전환을 확인하는 것을 목표로 진행되었다. E. faecium SA5는 내산성, 내담즙성을 나타내었으며 4종의 병원성 미생물(Salmonella typhimurium KCTC 3216, Listeria monocytogenes KCTC 3710, Bacillus cereus KCTC 1012, Staphylococcus aureus KCTC 1621)에 항균 활성을 가질 뿐만 아니라 항생물질 colistin, gentamycin, neomycin에 내성을 나타내었다. 또한, E. faecium SA5는 bile salt hydrolase 활성을 나타내어 혈액 내 콜레스테롤 수준 감소 효과가 있다고 사료되며 10% skim milk에서 배양하였을 때, pH가 감소하고 산도 및 생균수가 증가하는 것으로 보아 발효유 스타터로써의 활성을 갖는 것으로 판단되었다. 또한 E. faecium SA5의 ${\beta}$-glucosidase에 의해 ginsenoside $Rb_1$이 ginsenoside $Rg_3-s$와 $Rg_3-r$으로 전환되었음을 TLC 분석을 통해 확인하였다. 따라서 E. faecium SA5는 잠재적인 probiotics로 이를 이용하여 발효유 제조 및 ginsenoside 전환 관련 건강기능식품 개발에 응용할 수 있을 것으로 사료된다.
The fermentation of Panax ginseng can yield many compounds from ginsenosides that have a wide variety of biological functions. Lactic acid bacteria (LAB) strains are capable of converting ginsenosides. The purposes of this study were to: (1) characterize Enterococcus faecium SA5, an isolated LAB fro...
The fermentation of Panax ginseng can yield many compounds from ginsenosides that have a wide variety of biological functions. Lactic acid bacteria (LAB) strains are capable of converting ginsenosides. The purposes of this study were to: (1) characterize Enterococcus faecium SA5, an isolated LAB from Mongolian mare milk, (2) identify the existence of extracellular ${\beta}$-glucosidase activity in the milk, and (3) ascertain if the ${\beta}$-glucosidase has the capacity of converting ginsenoside in Korean ginseng. The results revealed that E. faecium SA5 was acid-resistant, bile salt-resistant, and has antibiotic activities against 4 pathogenic microorganisms (Salmonella typhimurium KCTC 3216, Listeria monocytogenes KCTC 3710, Bacillus cereus KCTC 1012, Staphylococcus aureus KCTC 1621). In addition, E. faecium SA5 had tolerance against some antibiotics such as colistin, gentamycin and neomycin. It was also found that E. faecium SA5 possessed bile salt hydrolase activity, which could lower blood cholesterol level. When incubated in 10% (w/v) skim milk as a yogurt starter, E. faecium SA5 caused to decrease pH of the medium as well as increase in viable cell counts. Using TLC and HPLC analysis on the samples incubated in MRS broth, our study confirmed that E. faecium SA5 can produce ${\beta}$-glucosidase, which was capable of converting ginsenoside $Rb_1$ into new ginsenosides $Rg_3-s$ and $Rg_3-r$. It was concluded that E. faecium SA5 possessed a potential of probiotic activity, which could be applied to yogurt manufacture as well as ginsenoside conversion in ginseng.
The fermentation of Panax ginseng can yield many compounds from ginsenosides that have a wide variety of biological functions. Lactic acid bacteria (LAB) strains are capable of converting ginsenosides. The purposes of this study were to: (1) characterize Enterococcus faecium SA5, an isolated LAB from Mongolian mare milk, (2) identify the existence of extracellular ${\beta}$-glucosidase activity in the milk, and (3) ascertain if the ${\beta}$-glucosidase has the capacity of converting ginsenoside in Korean ginseng. The results revealed that E. faecium SA5 was acid-resistant, bile salt-resistant, and has antibiotic activities against 4 pathogenic microorganisms (Salmonella typhimurium KCTC 3216, Listeria monocytogenes KCTC 3710, Bacillus cereus KCTC 1012, Staphylococcus aureus KCTC 1621). In addition, E. faecium SA5 had tolerance against some antibiotics such as colistin, gentamycin and neomycin. It was also found that E. faecium SA5 possessed bile salt hydrolase activity, which could lower blood cholesterol level. When incubated in 10% (w/v) skim milk as a yogurt starter, E. faecium SA5 caused to decrease pH of the medium as well as increase in viable cell counts. Using TLC and HPLC analysis on the samples incubated in MRS broth, our study confirmed that E. faecium SA5 can produce ${\beta}$-glucosidase, which was capable of converting ginsenoside $Rb_1$ into new ginsenosides $Rg_3-s$ and $Rg_3-r$. It was concluded that E. faecium SA5 possessed a potential of probiotic activity, which could be applied to yogurt manufacture as well as ginsenoside conversion in ginseng.
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문제 정의
의 전환[26] 등이 있다. 따라서 본 연구는 몽골 마유로부터 분리한 Enterococcus faecium SA5에 대한 이화학적 특성을 조사하고 Enterococcus faecium SA5가 생산하는 효소를 이용하여 ginsenoside 전환을 밝히고 이를 이용한 건강기능식품 소재 개발을 위한 기초자료를 제공하기 위하여 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
0로 조정한 MRS broth에 각각 2% 첨가하여 37℃에서 4시간 배양하였다. 1시간 간격으로 각각의 배양액을 1 ml씩 무균적으로 채취하여 0.85% NaCl 용액 9 ml에 분주하고 10진 희석법으로 희석하여 MRS agar에 접종한 뒤, 37℃에서 24시간 배양하고 생균수를 측정하여 내산성을 조사하였다.
DNA를 PCR로 확보하였고, DNA 염기서열 분석 및 이를 바탕으로 한 동정은 BIOFACT Co. (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 수행하였다. 사용한 primer는 27F: 5'-AGAGTTTGATCAC TGGCTCAG-3'와 1,492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' 를 사용하였다.
E. faecium SA5를 MRS agar에 평판도말한 후 37℃에서 18시간 배양 후 균체를 취하여 API ZYM enzyme system (Bio Merieux, France)의 API Suspension medium (2 ml, Bio Meriux, France)에 5.0~6.0 McFarland standard (Bio Meriux, France)로 탁도를 맞추었다. API ZYM 스트립 각각의 큐플에 Suspension medium을 65 ul씩 분주하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다.
E. faecium SA5를 MRS broth에 접종하여 37℃에서 18시간 배양한 후 10% (w/v) skim milk 배지에 배양하여 0, 4, 12, 24, 48, 72시간째의 산도 및 pH, 생균수를 측정하였다. 적정산 도는 phenolphtalein을 지시약으로 0.
E. faecium SA5에 의한 ginsenoside Rb1의 전환을 확인하기 위하여 MRS broth에 ginsenoside Rb1과 E. faecium SA5를 접종하고 7일 동안 반응시킨 배양액을 시료로 TLC를 수행한 결과는 Fig. 6A, HPLC를 수행한 결과는 Fig. 6B에 나타난 바와 같다. Fig.
Ginsenoside Rb1 용액이 첨가된 MRS broth에 E. faecium SA5를 접종하고 30℃ 진탕 배양기에서 7일 동안 반응시킨 배양액을 시료로 HPLC (high press liquid chromatography) (LC-6AD, Shimadzu, Japan)를 수행하였다. Prontosil 120-5- C18 ACE-EPS column을 사용하였으며, 이동상으로 사용한 용매 A는 CH3CN:H2O=20:80, 용매 B는 CH3CN:H2O=80:20이었다.
Ginsenoside Rb1을 0.2 mg/ml 첨가하고 MRS broth에 E. faecium SA5를 접종하고 30℃ 배양기에서 7일 동안 반응시켜 TLC (thin layer chromatography)를 수행하였다. 배양액을 취해 원심분리 (6,000× g, 3 min)한 상등액 500 ul와 1-butanol 500 ul를 충분히 혼합한 후 다시 원심분리 (6,000×g, 10 min)한 상등액을 시료로 사용하여 TLC plate (TLC silicagel 60 F254, Merck, Germany)에 3 ul 점적하고 TLC plate를 mobile phase (n-butanol : ethylacetate : H2O = 5 : 1 : 4, upper layer)로 전개시키고 건조한 다음 10% H2SO4 용액으로 발색시켰다.
MRS broth에 E. faecium SA5를 2% 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 배양액을 0.1%, 0.2%, 0.3% oxgall bile salt (Oxoid, UK)를 첨가한 MRS broth에 각각 2% 첨가하여 37℃에서 4시간 배양하였다. 배양 1시간 간격으로 각각의 배양 시료를 1 ml씩 무균적으로 채취하여 0.
MRS broth에 E. faecium SA5를 접종하고 37℃에서 24시간 배양한 배양액 1%를 MRS agar 배지에 접종한 후 MRS agar에서 굳힌 뒤 항생제가 포함되어 있는 paper disc (Sensi-Disc, BBL™, BD, USA)를 배지 위에 올려놓고 37℃에서 24시간 배양하여 disc 주변에 환형성 여부를 확인하였다.
MRS broth에 E. faecium SA5를 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 배양액을 1N HCl로 보정하여 pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0로 조정한 MRS broth에 각각 2% 첨가하여 37℃에서 4시간 배양하였다. 1시간 간격으로 각각의 배양액을 1 ml씩 무균적으로 채취하여 0.
2 um syringe filter로 여과 후 시료로 사용하였다. 각각의 병원성 미생물을 tryptic soy agar 배지에 접종하고 tryptic soy agar 배지에 부어 굳힌 후 멸균한 paper disc (8 mm)를 배지 위에 올려놓고 시료를 50 ul씩 주입하고 각각의 병원성 미생물의 배양 조건에서 48시간 동안 배양한 다음 clear zone의 형성 여부를 확인하였다.
3% oxgall bile salt (Oxoid, UK)를 첨가한 MRS broth에 각각 2% 첨가하여 37℃에서 4시간 배양하였다. 배양 1시간 간격으로 각각의 배양 시료를 1 ml씩 무균적으로 채취하여 0.85% NaCl 용액 9 ml에 분주하고 10진 희석법으로 희석하여 MRS agar에 접종한 뒤, 37℃에서 24시간 배양 후 생균수를 측정하여 내담즙성을 조사하였다.
유산균 또는 SA5는 몽골 마유로부터 MRS agar를 이용하여 분리하였고, Perry 등[21]의 방법에 따라 MRS agar에서 배양한 colony를 Esculin iron agar (Sigma Aldrich, USA)에 streaking하여 37℃에서 24시간 동안 CO2 incubator에서 배양 후 배지 내 갈색 또는 검은색 환의 형성여부를 확인하였다. 갈색 또는 검은색 환을 형성할 경우 β-glucosidase 활성을 나타내고 ginsenoside 전환능을 가지는 것으로 판단하였다.
대상 데이터
faecium SA5를 접종하고 30℃ 진탕 배양기에서 7일 동안 반응시킨 배양액을 시료로 HPLC (high press liquid chromatography) (LC-6AD, Shimadzu, Japan)를 수행하였다. Prontosil 120-5- C18 ACE-EPS column을 사용하였으며, 이동상으로 사용한 용매 A는 CH3CN:H2O=20:80, 용매 B는 CH3CN:H2O=80:20이었다. 용매는 gradient elution system으로 0분(0% B), 0-10분(5% B), 10-30분(15% B), 30-60분(35% B), 60-70분(50% B), 70-95분 (100% B), 95-140분(100% B), 140-142분(0% B), 142-150분(0% B)으로 조절하였다.
Salmonella typhimurium KCTC 3216, Listeria monocytogenes KCTC 3710, Bacillus cereus KCTC 1012, Staphylococcus aureus KCTC 1621의 병원성 미생물을 KTCT, Escherichia coli KCCM 11234 (Daejeon, Korea)로부터 분양받았고 paper disc agar diffusion method [7]를 이용하여 항균활성을 수행하였다. 각각의 병원성 미생물은 tryptic soy broth (Oxoid, UK)에 접종 하여 37℃에서 24시간 배양하여 사용하였고 E.
사용한 primer는 27F: 5'-AGAGTTTGATCAC TGGCTCAG-3'와 1,492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' 를 사용하였다.
성능/효과
0.1% oxgall을 처리한 경우는 배양 4시간 동안 대조구와 동일한 3.2×108 CFU/ml를 나타내었고 0.3% oxgall의 경우도 0.1% oxgall처리 보다는 생균수가 낮았으나 배양 4시간째에 9.6×107 CFU/ml로 나타나 담즙산에 대해 내성이 있는 것으로 확인되었다.
0.5% bile salt (Oxoid, UK)와 0.035% CaCl2를 첨가한 MRS agar에 E. faecium SA5와 음성 대조구 E. coli KCCM 11234를 각각 streaking하고 anaerobic system (Anaerocult®, MERCK, Germany)을 이용하여 37℃에서 72시간 배양한 다음 colony 주변에 불투명한 물질이 생성될 경우 bile salt hydrolase 효소 활성이 있는 것으로 판단하였다.
10% skim milk에 E. faecium SA5 2%를 접종하여 72시간 배양 후 산도 및 pH, 생균수를 측정한 결과, 산도는 배양 시작 때는 0.18%, 4시간째는 0.23%, 12시간째는 0.33%, 24시간째는 0.43%, 48시간째는 0.50%, 종료시점인 72시간째는 산도는 0.57%까지 증가하였으며, pH는 배양 시작 때는 6.6, 4시간째는 6.4, 12시간째는 5.9, 24시간째는 5.5, 48시간째는 5.1, 종료시 점인 72시간째는 4.9까지 낮아짐을 확인하였다(Fig. 5A). 생균수는 배양 시작때는 4.
Bile salt hydrolase (BSH) 효소 활성이 없는 것으로 알려진 E. coli KCCM 11234와 E. faecium SA5를 비교하여 실험을 수행한 결과, E. faecium SA5의 colony 주변에 불투명한 물질이 생성됨을 확인하였는데, 이러한 결과는 bile salt hydrolase 효소활성이 있는 것으로 판단되었다(Fig. 4B). 간에서 콜레스테롤로부터 만들어진 담즙산은 glycine 또는 taurine과 결합되어 십이지장으로 배출된다.
E. faecium SA5는 pH 2.0에서 배양 1시간째 생균수는 2.2×104 CFU/ml로 배양 0시간에 1.4×107 CFU/ml에 비해 급격히 떨어졌고 이후 배양 시간에는 유산균을 확인할 수 없었다.
Kaur 등[9]은 유산균이 유기산, H2O2 등의 과산화물질, 박테리오신 등의 2차 대사산물을 통해 유해한 균, 특히 병원성 미생물을 저해한다고 보고하고 있다. E. faecium SA5는 중화시키지 않은 상등액 뿐만 아니라 pH 7.0의 중화 상등액에서도 항균활성을 나타내는 것으로 보아 유기산 이외의 박테리오신과 같은 항균 활성을 갖는 대사산물을 생성하는 것으로 판단되었다.
E. faecium SA5를 배양하여 얻은 상등액과 중화 상등액을 각각 적하한 paper disc에서 B. cereus에 대해 강한 항균활성을 나타냈으며, L. monocytogenes KCTC 3710에 대해서는 약한 항균활성을 나타내었다. 그러나 Salmonella typhimurium KCTC 3216와 Staphylococcus aureus KCTC 1621에 대해서는 항균활성이 없는 것으로 나타났다(Fig.
2B에 나타내었다. Oxgall bile salt 첨가량이 낮을수록 대조구와 유사한 수준의 생균수를 나타냈으나 처리구 모두 배양 2시간 이후에는 배양 0시간 보다 생균수가 증가하였다. 0.
갈색 또는 검은색 환을 형성할 경우 β-glucosidase 활성을 나타내고 ginsenoside 전환능을 가지는 것으로 판단하였다.
3% 정도라고 알려져 있다. 따라서 E. faecium SA5는 실제 소장을 통과할 때, 담즙산에 크게 영향을 받지 않고 소장을 통과하여 대장에 도달할 수 있을 것이라 사료되었다.
McAuliffe 등[19]에 따르면 체내에는 일정량의 담즙산이 유지되어야 하기 때문에 분변으로 배출된 양만큼의 담즙산 생성이 필요하고, 이때 담즙산의 전구체인 콜레스테롤을 이용하게 되므로 장내 미생물의 bile salt hydrolase 활성은 혈중 콜레스테롤 수치를 낮추는 역할을 할 수 있다고 보고하였다. 따라서 bile salt hydrolase 효소 활성을 나타내는 E. faecium SA5의 섭취를 통해 혈중 콜레스테롤 수치를 낮출 수 있을 것으로 사료되었다.
0에서의 생존율이 중요하다고 하였다. 따라서 음식물이 위에서 체류되는 시간인 1~4시간 동안 E. faecium SA5의 생존이 가능하다고 판단되었다.
생균수는 배양 시작때는 4.25×106 CFU/ul, 4시간째는 1.46×108 CFU/ul, 12시간째는 3.06×108 CFU/ul, 24시간째는 3.20×108 CFU/ul, 48시간째는 3.44×108 CFU/ul로 증가하였으며 이후 서서히 감소하여 배양 종점인 72시간째는 2.07×108 CFU/ul을 확인할 수 있었다(Fig. 5B).
유당 분해에 관여하는 β-galactosidase는 가장 높은 40 nmol의 활성을 나타내었으며, ginsenoside 전환에 필요한 β -glucosidase의 활성은 10 nmol로 확인되었다.
유산균 SA5의 분리 동정 몽골 마유에서 분리된 SA5의 16S rDNA 염기서열을 1,400개를 분석한 결과는 E. faecium D01과는 99%의 상동성을 나타내어 E. faecium SA5로 명명하였다(Fig. 1).
항생제 ampicillin, colistin, erythromycin, gentamycin, neomycin, tetracycline에 대한 E. faecium SA5의 감수성을 확인한 결과, E. faecium SA5는 colistin, gentamycin, neomycine에 내성을 나타내었다(Fig. 4A). 항생물질 colistin은 장염 및 이질, 요로감염증, 호흡기감염증 치료 등에 사용되고 gentamycin은 기관지염, 수막염, 세균에 의한 피부 감염 등에 사용된다.
후속연구
그러나 이러한 효능은 사람 개개인에 따라 다르게 나타나는데, 이는 대장세균의 분포 및 활성이 사람마다 다르기 때문이다[11]. 이러한 장내 미생물의 차이로 나타날 수 있는 효능과 흡수율의 차이를 최소화하기 위해 ginsenoside를 미리 가수분해함으로써 체내 흡수력을 증진시키고, 효능을 나타낼 수 있는 연구가 필요하다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
유산균을 이용한 ginsenoside 전환의 장점은 무엇인가?
인간의 장내미생물 가운데 유산균은 대표적으로 가장 많이 이용되고 있는 probiotics로 장 운동 조절, 병원성 세균의 성장 억제, 소화 흡수의 촉진, 변비 설사 방지 등의 영양생리적인 건강 증진과 더불어 발효유제품, 자연발효식품, 가축의 사료 및 제약 분야에서 다양하게 사용되고 있으며[1] 유산균의 건강 증진 효과로 항암효과, 혈중 콜레스테롤 저하, 면역증강 효과 등의 효능이 보고되면서 광범위하게 연구가 진행되고 있다[7]. 최근 유산균을 이용한 ginsenoside 전환에 대한 연구가 활발 하게 진행되고 있는데, 유산균과 효소의 종류에 따라 ginsenoside 전환 경로와 그에 따른 유용 ginsenoside 산물을 다양하게 얻을 수 있고 특정한 ginsenoside만을 선택적으로 또는 다량으로 생산할 수 있는 장점이 있기 때문이다[10].
인간의 장내미생물 가운데 유산균은 대표적으로 가장 많이 이용되고 있는 것은 무엇인가?
인간의 장내미생물 가운데 유산균은 대표적으로 가장 많이 이용되고 있는 probiotics로 장 운동 조절, 병원성 세균의 성장 억제, 소화 흡수의 촉진, 변비 설사 방지 등의 영양생리적인 건강 증진과 더불어 발효유제품, 자연발효식품, 가축의 사료 및 제약 분야에서 다양하게 사용되고 있으며[1] 유산균의 건강 증진 효과로 항암효과, 혈중 콜레스테롤 저하, 면역증강 효과 등의 효능이 보고되면서 광범위하게 연구가 진행되고 있다[7]. 최근 유산균을 이용한 ginsenoside 전환에 대한 연구가 활발 하게 진행되고 있는데, 유산균과 효소의 종류에 따라 ginsenoside 전환 경로와 그에 따른 유용 ginsenoside 산물을 다양하게 얻을 수 있고 특정한 ginsenoside만을 선택적으로 또는 다량으로 생산할 수 있는 장점이 있기 때문이다[10].
ginsenoside의 약리작용은 어떠한 효과를 내는가?
PPD계열의 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 PPT 계열의 Re, Rg1을 포함한 6종 major ginsenoside가 총 ginsenoside의 90%를 차지한다[20]. Ginsenoside가 갖는 약리작용은 매우 다양하여 항암작용[11], 항당뇨작용[17], 혈압조절기능[26], 항스트레스작용[15], 고지혈증 개선 작용[27], 알레르기 조절작용[31], 중추신경조정기능[12], 신경세포보호[13] 등이 보고되고 있다. 그러나 이러한 효능은 사람 개개인에 따라 다르게 나타나는데, 이는 대장세균의 분포 및 활성이 사람마다 다르기 때문이다[11].
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