이황화결합(Disulfide Bond)은 다양한 생리학적 혹은 병리학적 과정 중 단백질번역 후 변형(Post-Translational Modifications) 과정 중에 형성된다. 그러므로 이황화결합에 대한 정보는 단백질의 화학적 구조를 보다 종합적으로 이해하는데 매우 중요한 일이다. 질량분석기를 이용한 이황화결합 분석은 매우 효과적이며, 현재까지 질량 분석기를 활용한 다양한 이황화결합 분석법들이 개발되었다. 그러나, 대부분의 이황화결합 분석법의 경우, 이황화결합 분석 시 자유-시스테인잔기(Free Thiol Residues) 분석을 고려하지 않았다. 본 연구에서는 이황화결합에 관여하는 시스테인/자유-시스테인에 초점을 두고 총 4단계(1단계: 아미노산 서열을 통한 이황화결합 가능 부위를 예측, 2단계: 자유시스테인의 존재 유무의 확인, 3단계: 질량 분석기를 활용한 이황화결합 분석, 4단계: 이황화결합 분석법의 종합적인 검증)의 분석법을 개발하였다. 나아가, 본 연구에서 개발된 분석 기법을 실제 휴먼 유래 재조합 단백질(HRPE1)에 적용함으로써 개발된 이황화결합 분석법의 효용성을 확인하였다. HRPE1의 경우, 총 6개의 이황화결합(Inter-chain 형태: 1, Intra-chain 형태: 5)으로 구성된 것을 최종 확인하였다.
이황화결합(Disulfide Bond)은 다양한 생리학적 혹은 병리학적 과정 중 단백질번역 후 변형(Post-Translational Modifications) 과정 중에 형성된다. 그러므로 이황화결합에 대한 정보는 단백질의 화학적 구조를 보다 종합적으로 이해하는데 매우 중요한 일이다. 질량분석기를 이용한 이황화결합 분석은 매우 효과적이며, 현재까지 질량 분석기를 활용한 다양한 이황화결합 분석법들이 개발되었다. 그러나, 대부분의 이황화결합 분석법의 경우, 이황화결합 분석 시 자유-시스테인잔기(Free Thiol Residues) 분석을 고려하지 않았다. 본 연구에서는 이황화결합에 관여하는 시스테인/자유-시스테인에 초점을 두고 총 4단계(1단계: 아미노산 서열을 통한 이황화결합 가능 부위를 예측, 2단계: 자유시스테인의 존재 유무의 확인, 3단계: 질량 분석기를 활용한 이황화결합 분석, 4단계: 이황화결합 분석법의 종합적인 검증)의 분석법을 개발하였다. 나아가, 본 연구에서 개발된 분석 기법을 실제 휴먼 유래 재조합 단백질(HRPE1)에 적용함으로써 개발된 이황화결합 분석법의 효용성을 확인하였다. HRPE1의 경우, 총 6개의 이황화결합(Inter-chain 형태: 1, Intra-chain 형태: 5)으로 구성된 것을 최종 확인하였다.
The determination of disulfide bonds is important for comprehensive understanding of the chemical structure of protein. So far, many strategies for the disulfide bond analysis have been suggested in terms of speed and sensitivity. However, most of these strategies have not considered free thiol resi...
The determination of disulfide bonds is important for comprehensive understanding of the chemical structure of protein. So far, many strategies for the disulfide bond analysis have been suggested in terms of speed and sensitivity. However, most of these strategies have not considered free thiol residues in the target protein in the process of determining the disulfide bond. We suggested the strategy which was composed of four steps for the identification of disulfide bonds; the first step was the prediction of possible disulfide bonds, the second step was the determination of free cysteine residues, the third step was the analysis of disulfide bond using a high-resolution mass spectrometry, and the final step was the determination of disulfide bonds based on the comprehensive verification. In this study, we performed the characterization of disulfide bonds for the recombinant protein (HRPE1), where 1 and 5 inter- and intra-chain disulfide bonds were identified, respectively.
The determination of disulfide bonds is important for comprehensive understanding of the chemical structure of protein. So far, many strategies for the disulfide bond analysis have been suggested in terms of speed and sensitivity. However, most of these strategies have not considered free thiol residues in the target protein in the process of determining the disulfide bond. We suggested the strategy which was composed of four steps for the identification of disulfide bonds; the first step was the prediction of possible disulfide bonds, the second step was the determination of free cysteine residues, the third step was the analysis of disulfide bond using a high-resolution mass spectrometry, and the final step was the determination of disulfide bonds based on the comprehensive verification. In this study, we performed the characterization of disulfide bonds for the recombinant protein (HRPE1), where 1 and 5 inter- and intra-chain disulfide bonds were identified, respectively.
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문제 정의
본 연구에서는 1차적으로 이황화결합 분석을 위한 분석기법을 개발하고 2차로 개발된 분석기법을 휴먼유래 재조합 단백질(HRPE1)에 적용함으로써 본 연구에서 개발된 이황화결합 분석기법의 효용성을 확인하고자 하였다. HRPE1 단백질의 경우, 총 58개의 아미노산으로 구성되었으며, 이 중 9개의 아미노산이 시스테인으로 구성되었다.
제안 방법
6A에 나타내었다. Asp-N 유래 이황화결합 분석결과 1개의 Inter-chain과 5개의 Intra-chain의 이황화결합 부위가 규명되었으며, 6개의 이황화결합 부위를 팹타이드 맵핑 분석을 통해 확인하였다(Fig. 6B). 분석된 상세한 이황화결합 정보를 Table 2에 나타내었다.
HRPE1 내 자유 시스테인을 확인하기 위해 NEM을 처리하였다. NEM을 이용한 전처리 실험을 직접 HRPE1에 수행하기 전에, 먼저BSA를 이용하여 양성 대조군 실험을 진행하였다.
HRPE1의 자유-시스테인 분석을 위해 NEM 알킬화 반응 처리한것과 하지 않은 것으로 나뉘어 자유-시스테인의 존재여부를 검증하였다. NEM 처리는 2차 알킬화(Carbamidomethy)처리 전에 수행하였으며, HRPE1에 자유-시스테인이 존재한다면, 해당 자유-시스테인은, NEM (125.
MS/MS 질량분석 조건은, 시작MS 조건은 100 M/Z이며, 해상도는 17,500 FWHM, AGC는 5×104, 최대 충전 시간이 60밀리 초, 표준화 충돌 에너지 NCE 27%, 동적 제외 30초로 설정하여 분석을 진행하였다.
HRPE1 내 자유 시스테인을 확인하기 위해 NEM을 처리하였다. NEM을 이용한 전처리 실험을 직접 HRPE1에 수행하기 전에, 먼저BSA를 이용하여 양성 대조군 실험을 진행하였다. 각각의 샘플에 50 mM NEM을 처리한 후 37 °C에서 2시간 동안 반응시켰다.
NanoLC-MS/MS 실험은 Waters사의 NanoAcquity 초고성능 액체크로마토그래피와 Thermo사의 나노 전자분무방식 질량분석기(Q-Exactive)를 이용하였다. 펩타이드는 자동 샘플러를 통하여 시료로딩 컬럼(2 cm long; ID, 180 µm; particle size, 5 µm)과 C18 역상분석컬럼(10 cm long; ID, 150 µm; particle size, 1.
Top12 데이터에 의존 취득법을 사용하였으며, full-scan에서의 MS (m/z) 범위는 350~1,600,해상도는 70,000 FWHM, AGC는 5×104, 최대 충전 시간은 60밀리초로 설정하여 분석을 진행하였다.
첫 번째 단계에서는 아미노산 서열을 기반으로 한 이황화결합 생성가능부위를 예측하였다. 두 번째 단계에서는 이황화결합 시스테인과 자유-시스테인에 각각 다른 알킬화 반응을 적용하여 자유 시스테인의 유무를 확인하였다. 자유-시스테인은 NEM의 유무에 따른 modification 차이를 이용하여 최종 이황화결합-시스테인과 구분 지을 수 있었다.
첫번째로 아미노산 서열을 통해 가능한 이황화결합 부위를 예측하였다. 두 번째로 이황화결합 시스테인과 자유-시스테인에 환원 및 알킬화 반응을 적용하여 자유-시스테인 유무를 확인하였다. 자유-시스테인은 NEM의 유무에 따른 modification 차이를 이용하여 이황화결합 시스테인과 구분지을 수 있었다.
또한, 모든 가능한 이황화결합에 대한 위치 확인을 위해, 3가지의 가수분해효소(Asp-N, Chymotrypsin, Asp-N&Chymotrypsin)를 사용하여 총 39번의 LC-MS/MS 분석을 진행하였다(Asp-N: 10회, Chymotrypsin: 10회, Asp-N&Chymotrypsin: 19회).
보다 정확한 이황화결합 분석을 위해서, Asp-N&Chymotrypsin 가수분해효소 유래 이황화결합 분석도 함께 수행하였다.
본 연구에서는 이황화결합에 관여하는 시스테인/자유-시스테인에 초점을 두고, 총 4단계의 분석법 개발에 대한 전략을 세웠다. 첫 번째 단계에서는 아미노산 서열을 기반으로 한 이황화결합 생성가능부위를 예측하였다.
본 연구에서는 이황화결합을 이루고 있는 시스테인과 자유-시스테인 모두에 초점을 두고 4단계의 분석법 전략을 마련하였다. 첫번째로 아미노산 서열을 통해 가능한 이황화결합 부위를 예측하였다.
본 연구에서는 휴먼유래 재조합 단백질(HRPE1)의 이황화결합을 분석하고 두가지 종류(Inter-chain 이황화결합, Intra-chain 이황화결합)의 이황화결합 형태로 구분하였다. HRPE1의 경우는 1개의Inter-chain, 5개의 Intra-chain 이황화결합으로 이루어져 있음을 확인하였다.
3)을 활용하여 실제 이황화결합 부위를 규명하였다. 분석은 1단계-타겟 단백질 및 데이터 설정, 2단계-데이터 프로세싱, 3단계-리포트 생성의 총 3단계로 나누어 진행하였다.
이동상의 유속을 분당 300 nL/min로 설정하였고, 분리된 펩타이드는 전자분무 방식을 이용한 질량분석기인 Q-Exactive로 주입되었다. 샘플 분석 전 용매 및 컬럼에 의한 간섭 여부를 판단하기 위한 blank 분석을 수행하였다.
이황화결합 시스테인은 비환원 및 DTT를 이용한 환원과 IAA를 이용한 알킬화 반응 후 세 가지의 가수분해효소(Asp-N, Chymotrypsin, Asp-N&Chymotrypsin) 분해방법을 통해 분석을 진행하였다. 세 번째로는 초고분해능 질량 분석기(HRMS)를 통해 얻은 분석데이터를 이황화결합 부위 예측 프로그램(PepFinder)과 펩타이드 맵핑(Peptide Mapping) 분석기법을 적용하여 이황화결합 부위를 규명하였다. 마지막으로, 이황화결합 분석법의 종합적인 검증단계를 거쳤다.
자유-시스테인은 NEM의 유무에 따른 modification 차이를 이용하여 최종 이황화결합-시스테인과 구분 지을 수 있었다. 세 번째로는 초고분해능 질량분석기(High-Resolution Mass Spectrometry)를 통해 얻은 분석 데이터를 이황화결합 부위예측 프로그램(PepFinderTM Software)과 펩타이드 맵핑(Peptide Mapping) 분석 기법을 적용하여 이황화결합 부위를 규명하였다. 마지막으로 이황화결합 분석법의 종합적인 검증단계를 거쳤다.
알킬화된 샘플은 Chymotrypsin, Asp-N, Chymotrypsin&Asp-N을 이용해 37 °C에서 16시간 동안 반응시켰다.
최종 제안된 HRPE1의 이황화결합 부위 분석은 3개(Asp-N, Chymotrypsin, Asp-N&Chymotrypsin)의 가수분해효소에 따른 결과를 바탕으로, 다음의 조건을 만족시키는 이황화결합 부의를 선정하여 최종결론을 내렸다. 우선적으로 이황화결합 분석을 위하여 분석된 아미노산서열(DISULFIND 프로그램) 및 질량분석데이터(PepFinderTM Software) 기반 분석결과를 바탕으로, 3가지 가수분해효소 유래 이황화결합에 대한 분석결과에서 공통적으로 규명된 이황화결합 부위를 우선적으로 선정하였다. 이황화결합에 대한 이론적인 질량 값과 실제 확인된 질량 값과의 차이(Accuracy: 정확도)가 가장 낮은 것을 선정하였다.
1% 포름산을 포함하는 아세토니트릴을 5%에서 60%까지 상온에서 60분 동안 일정한 기울기로 증가시키는 방법을 통해 분리시켰다. 이동상의 유속을 분당 300 nL로설정하였고, 분리된 펩타이드는 전자분무 방식을 이용한 질량분석기인 Q-Exactive (Thermo ScientificTM)로 주입하였다.
이황화결합 시스테인은 비환원 및 DTT를 이용한 환원과 IAA를 이용한 알킬화 반응 후 세 가지의 가수분해효소(Asp-N, Chymotrypsin, Asp-N&Chymotrypsin) 분해방법을 통해 분석을 진행하였다.
이황화결합 패턴 분석을 위해서 1차로 비환원조건과 환원조건에서의 MS 스펙트럼 데이터를 얻고, 2차로 이황화결합 예측 프로그램인 PepFinderTM 2.0 (Thermo Scientific, Version: 2.0.15.3)을 활용하여 실제 이황화결합 부위를 규명하였다. 분석은 1단계-타겟 단백질 및 데이터 설정, 2단계-데이터 프로세싱, 3단계-리포트 생성의 총 3단계로 나누어 진행하였다.
자유-시스테인의 존재유무확인법의 경우, 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin) 시료를 활용하여 실제 존재하는 자유-시스테인의존재 유무를 정확히 규명할 수 있는지에 대한 검증을 수행하였다. 전체적인 실험방법은 NEM 알킬화 반응 처리한 것과 하지 않은 것으로 나누어 자유-시스테인의 존재 여부를 검증하였다.
자유-시스테인의 존재유무확인법의 경우, 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin) 시료를 활용하여 실제 존재하는 자유-시스테인의존재 유무를 정확히 규명할 수 있는지에 대한 검증을 수행하였다. 전체적인 실험방법은 NEM 알킬화 반응 처리한 것과 하지 않은 것으로 나누어 자유-시스테인의 존재 여부를 검증하였다. Fig.
5 µg)를 C18 컬럼을 통하여 분리하였다. 주입한 펩타이드를 0.1% 포름산을 포함하는 아세토니트릴을 5%에서 60%까지 상온에서 60분 동안 일정한 기울기로 증가시키는 방법을 통해 분리시켰다. 이동상의 유속을 분당 300 nL로설정하였고, 분리된 펩타이드는 전자분무 방식을 이용한 질량분석기인 Q-Exactive (Thermo ScientificTM)로 주입하였다.
7 µm)으로 주입되었다. 주입한 펩타이드를 0.1% 포름산을 포함하는 아세토니트릴을 5%에서 60%까지 상온에서 60분 동안 일정한 기울기로 증가시키는 방법을 통해 분리하였다. 이동상의 유속을 분당 300 nL/min로 설정하였고, 분리된 펩타이드는 전자분무 방식을 이용한 질량분석기인 Q-Exactive로 주입되었다.
본 연구에서는 이황화결합에 관여하는 시스테인/자유-시스테인에 초점을 두고, 총 4단계의 분석법 개발에 대한 전략을 세웠다. 첫 번째 단계에서는 아미노산 서열을 기반으로 한 이황화결합 생성가능부위를 예측하였다. 두 번째 단계에서는 이황화결합 시스테인과 자유-시스테인에 각각 다른 알킬화 반응을 적용하여 자유 시스테인의 유무를 확인하였다.
본 연구에서는 이황화결합을 이루고 있는 시스테인과 자유-시스테인 모두에 초점을 두고 4단계의 분석법 전략을 마련하였다. 첫번째로 아미노산 서열을 통해 가능한 이황화결합 부위를 예측하였다. 두 번째로 이황화결합 시스테인과 자유-시스테인에 환원 및 알킬화 반응을 적용하여 자유-시스테인 유무를 확인하였다.
최종 제안된 HRPE1의 이황화결합 부위 분석은 3개(Asp-N, Chymotrypsin, Asp-N&Chymotrypsin)의 가수분해효소에 따른 결과를 바탕으로, 다음의 조건을 만족시키는 이황화결합 부의를 선정하여 최종결론을 내렸다.
본 연구를 통해 분석된 재조합 단백질의 이황화결합 위치를 확인한 결과 9개의 시스테인에서는 자유-시스테인이 없는 것으로 확인되었으며, 1개의 Inter-chain과 5개의 Intra-chain 이황화결합 부위가 최종적으로 규명되었다. 특히, 본 연구에서는 이황화결합 분석을 위해 자유-시스테인 분석법, 아미노산서열(DISULFIND) 및 질량분석데이터(PepFinderTM Software) 기반 분석법을 적용함으로써 이황화결합의 확실성(Confidence) 및 정확성(Accuracy)에 대한 평가를 수행할 수 있었다. 본 연구에서 개발된 이황화결합 분석법은 의약품 개발에서의 이황화결합에 대한 효율적인 패턴분석과 관련한 유용한 자료로 활용될 것으로 기대된다.
환원 및 알킬화 과정을 제외한 효소 전처리에서는, 동일한 샘플을8 M urea를 처리하여 변성시킨 후 환원, 알킬화 과정을 생략하고, Chymotrypsin, Asp-N, Chymotrypsin&Asp-N을 이용해 37 °C에서 16시간 동안 반응시켰다.
효과적인 이황화결합 분석을 위하여, 본 연구에서는 1차로 비환원조건과 환원조건에서 HRPE1의 질량분석 스펙트럼을 얻고, 2차로 이황화결합 예측프로그램(PepFinderTM software)을 활용하여 실제 이황화결합 부위를 규명하였다. 또한, 모든 가능한 이황화결합에 대한 위치 확인을 위해, 3가지의 가수분해효소(Asp-N, Chymotrypsin, Asp-N&Chymotrypsin)를 사용하여 총 39번의 LC-MS/MS 분석을 진행하였다(Asp-N: 10회, Chymotrypsin: 10회, Asp-N&Chymotrypsin: 19회).
대상 데이터
본 연구는 오송첨단의료산업진흥재단 신약개발지원센터의 연구장비 및 인력지원을 받아 수행되었습니다. 본 연구에 사용된 휴먼유래 재조합 단백질(HRPE1)은 아이진(주)에서 제공하였습니다.
우선적으로 이황화결합 분석을 위하여 분석된 아미노산서열(DISULFIND 프로그램) 및 질량분석데이터(PepFinderTM Software) 기반 분석결과를 바탕으로, 3가지 가수분해효소 유래 이황화결합에 대한 분석결과에서 공통적으로 규명된 이황화결합 부위를 우선적으로 선정하였다. 이황화결합에 대한 이론적인 질량 값과 실제 확인된 질량 값과의 차이(Accuracy: 정확도)가 가장 낮은 것을 선정하였다. 이황화결합의 경우, 단백질의 3차원구조를 형성하는데 매우 중요한 역할을 담당하기 때문에, 이황화결합의 구조적인 유효성여부도 함께 고려하였다.
데이터처리
HRPE1 단백질의 아미노산 서열분석을 통한 이황화결합 가능부위예측을 위해 “DISULFIND”프로그램을 사용하였다(http://disulfind.dsi.unifi.it/).
성능/효과
또한, 모든 가능한 이황화결합에 대한 위치 확인을 위해, 3가지의 가수분해효소(Asp-N, Chymotrypsin, Asp-N&Chymotrypsin)를 사용하여 총 39번의 LC-MS/MS 분석을 진행하였다(Asp-N: 10회, Chymotrypsin: 10회, Asp-N&Chymotrypsin: 19회). 3가지 가수분해효소를 활용한 이황화결합 분석을 통하여 모든 가능한 이황화결합 부위를 예측할 수 있었다.
Asp-N&Chymotrypsin에 의한 이황화결합 분석결과, 2개의 Inter-chain과 3개의 Intra-chain의 이황화결합 부위가 규명되었다.
7A에 Chymotrypsin 가수분해효소 유래 이황화결합 분석결과를 나타내었다. Chymotrypsin에 의한 이황화결합 분석결과, 4개의 Intra-chain의 이황화결합 부위가 규명되었으며, Inter-chain 이황화결합 형태는 나타나지 않았다. 규명된 4개의 이황화결합 부위를 팹타이드 맵핑 분석을 통해 확인하였으며(Fig.
02146 Da)로 modification된다. HRPE1의 자유-시스테인 분석결과, 9개 모두 Carbamidomethyl (57.02146 Da)로 modification됨을 확하였다. 따라서, HRPE1에는자유-시스테인이 없는 것으로 확인되었다.
02146 Da)로 modification됨을 확하였다. 따라서, HRPE1에는자유-시스테인이 없는 것으로 확인되었다. Fig.
세 번째로는 초고분해능 질량 분석기(HRMS)를 통해 얻은 분석데이터를 이황화결합 부위 예측 프로그램(PepFinder)과 펩타이드 맵핑(Peptide Mapping) 분석기법을 적용하여 이황화결합 부위를 규명하였다. 마지막으로, 이황화결합 분석법의 종합적인 검증단계를 거쳤다.
세 번째로는 초고분해능 질량 분석기(HRMS)를 통해 얻은 분석데이터를 이황화결합 부위 예측 프로그램(PepFinder)과 펩타이드 맵핑(Peptide Mapping) 분석기법을 적용하여 이황화결합 부위를 규명하였다. 마지막으로, 이황화결합 분석법의 종합적인 검증단계를 거쳤다.
2에 자유-시스테인 검증을 위한 실험절차를 나타내었다. 본 실험을 통하여 자유-시스테인의 경우, NEM (125.04768 Da)로 modification된 것을 확인할 수 있었고, 이황화결합의 시스테인의 경우, Carbamidomethyl (57.02146 Da)로 modification된 것을 확인할 수 있었다. Fig.
본 연구를 통해 분석된 재조합 단백질의 이황화결합 위치를 확인한 결과 9개의 시스테인에서는 자유-시스테인이 없는 것으로 확인되었으며, 1개의 Inter-chain과 5개의 Intra-chain 이황화결합 부위가 최종적으로 규명되었다. 특히, 본 연구에서는 이황화결합 분석을 위해 자유-시스테인 분석법, 아미노산서열(DISULFIND) 및 질량분석데이터(PepFinderTM Software) 기반 분석법을 적용함으로써 이황화결합의 확실성(Confidence) 및 정확성(Accuracy)에 대한 평가를 수행할 수 있었다.
질량분석장비를 이용한 분석법은 펨토몰(Femtomole) 단위의 높은감도를 구현하기 때문에 샘플의 양이 제한된 상황에서 시스테인 잔기를 분석할 수 있는 우수한 방법 중 하나이다[13,14]. 본 연구에서 사용된 질량분석장비는 초고분해능 질량분석기(High-Resolution Mass Spectrometry: Q-Exactive)로 기존의 분석법보다 높은 감도로 샘플 분석이 가능하다는 장점을 가진다. 질량분석장비를 이용한 분석법의 샘플준비단계는 TCEP (Tris-2-Carboxyethlphosphine Hydrochloride), DTT (Dithiothreitol)를 이용하여 시스테인 간의 이황화결합을 절단해주는 환원반응과 IAA (Iodoacetamide), NEM (N-Ethylmaleimide), M-biotin을 이용한 알킬화 반응을 통해 -SH기 간의 이황화결합이 다시 이루어지는 것을 방지하는 과정으로 이루어진다.
it/). 분석결과 총 4개(Bond 1: 2~10, Bond 2: 16~36 Bond3:17~20, Bond4:29~42)의 이황화결합부위가 예측되었다(Connection Confidence: 0.293). Fig.
본 연구를 통해서최종 제안된 HRPE1의 이황화결합 부위를 그림9에 나타내었다. 이황화결합 분석결과 1개의 Inter-chain과 5개의 Intra-chain 이황화결합 부위가 최종적으로 규명되었다.
후속연구
HRPE1의 경우는 1개의Inter-chain, 5개의 Intra-chain 이황화결합으로 이루어져 있음을 확인하였다. 본 연구를 통해 제시된 이황화결합 분석법은 자유-시스테인의 존재여부의 확인을 통해 보다 정확한 단백질의 화학적 구조를 파악하는데 매우 효과적이며, 나아가 의약품 개발에서의 이황화결합의 패턴분석을 보다 효율적으로 이해하는데 도움이 될 것으로 기대한다.
특히, 본 연구에서는 이황화결합 분석을 위해 자유-시스테인 분석법, 아미노산서열(DISULFIND) 및 질량분석데이터(PepFinderTM Software) 기반 분석법을 적용함으로써 이황화결합의 확실성(Confidence) 및 정확성(Accuracy)에 대한 평가를 수행할 수 있었다. 본 연구에서 개발된 이황화결합 분석법은 의약품 개발에서의 이황화결합에 대한 효율적인 패턴분석과 관련한 유용한 자료로 활용될 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
기존에 연구된 질량 분석기를 활용한 다양한 이황화결합 분석법의 문제점은 무엇인가?
질량분석기를 이용한 이황화결합 분석은 매우 효과적이며, 현재까지 질량 분석기를 활용한 다양한 이황화결합 분석법들이 개발되었다. 그러나, 대부분의 이황화결합 분석법의 경우, 이황화결합 분석 시 자유-시스테인잔기(Free Thiol Residues) 분석을 고려하지 않았다. 본 연구에서는 이황화결합에 관여하는 시스테인/자유-시스테인에 초점을 두고 총 4단계(1단계: 아미노산 서열을 통한 이황화결합 가능 부위를 예측, 2단계: 자유시스테인의 존재 유무의 확인, 3단계: 질량 분석기를 활용한 이황화결합 분석, 4단계: 이황화결합 분석법의 종합적인 검증)의 분석법을 개발하였다.
시스테인의 -SH간 이황화결합의 역할은 무엇인가?
그 중에서도 시스테인은 20개의 아미노산 중 유일하게 -SH기를 포함한다[3,4]. 이러한 시스테인의 -SH간 이황화결합은 단백질의 다양한 생리학적, 병리학적 과정의 번역 후 수정을 통해 형성되며 구조 변화를 이루며 단백질의 2차, 3차 구조를 결정하는데 중요한 역할을 한다[5,6].
이황화결합은 어떤 생체대사 과정에서 형성되는가?
이황화결합(Disulfide Bond)은 다양한 생리학적 혹은 병리학적 과정 중 단백질번역 후 변형(Post-Translational Modifications) 과정 중에 형성된다. 그러므로 이황화결합에 대한 정보는 단백질의 화학적 구조를 보다 종합적으로 이해하는데 매우 중요한 일이다.
참고문헌 (14)
Rietsch, A. and Beckwith, J., "The Genetics of Disulfide Bond Metabolism," Annu. Rev. Genet., 32, 163-84(1998).
Seiwert, B. and Karst, U., "Simultaneous LC/MS/MS Determination of Thiols and Disulfides in Urine Samples Based on Differential Labeling with Ferrocene-Based Maleimides," Anal. Chem., 79, 7131-7138(2007).
Xu, H., Zhang, L. and Freitas, M. A., "Identification and Characterization of Disulfide Bonds in Proteins and Peptides from Tandem MS Data by use of the MassMatrix MS/MS Search Engine," J. Proteome Res., 7, 138-144(2008).
Yen, T. Y., Yan, H. and Macher, B. A., "Characterizing Closely Spaced, Complex Disulfide Bond Patterns in Peptides and Proteins by Liquid Chromatography/electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry," J. Mass Spectrom., 37, 15-30(2002).
Yen, T. Y., Joshi, R. K., Yan, H., Seto, N. O. L., Palcic, M. M. and Macher, B. A., "Characterization of Cysteine Residues and Disulfide Bonds in Proteins by Liquid Chromatography/electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry," J. Mass Spectrom., 35, 990-1002(2000).
John, H. and Forssmann, W.G., "Determination of the Disulfide Bond Pattern of the Endogenous and Recombinant Angiogenesis Inhibitor Endostatin by Mass Spectrometry," Rapid Commun. Mass Spectrom., 15, 1222-1228(2001).
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