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문제 정의
- CCA의 다분화능 세포와 조골세포에 대한 분화 효과에 대하여 조사하였다. 결과에서 나타나듯 CCA는 조골세포 분화의 표지 유전자들을 상향 조절하였고, 그중 Runx2의 전사활성을 높였다.
- 따라서 본 연구에서는 마가목에서 추출한 CA의 생물전환 물질인 CCA에 의한 조골세포 분화 효능을 검증하고자 하였다. 이를 위하여 다분화능 세포 C3H10T1/2와 조골전구세포 MC3T3-E1에 CCA 처리 후 조골세포 분화 마커 유전자의 발현 패턴을 분석하여 결과를 도출하였으며, 이 결과는 CCA의 골 관련 질환의 예방 및 치료 관련 소재로서의 이용가능성을 시사한다.
- 본 연구에서는 마가목 열매에서 추출한 chlorogenic acid의 유사체인 cryptochlorogenic acid(CCA)가 조골세포 분화에 미치는 영향에 대해서 알아보았다. 먼저 세포독성 여부를 확인하기 위해 MTT assay를 수행하였고 독성이 없다고 확인된 5 μM의 농도에서 실험을 진행하였다.
제안 방법
- 4 μg의 plasmid를 형질 도입하였다. 24시간 후에 세포를 회수하여 Dual Luciferase Reporter Assay System(Promega Co., Madison, WI, USA)을 이용하여 확인하였다.
- 3 μg RNA를 TOP scriptTMRT DryMIX(Enzynomics, Daejeon, Korea)를 이용하여 complementary DNA(cDNA)를 합성하였다.
- C3H10T1/2 세포와 MC3T3-E1 세포에 Runx2-luc reporter plasmid를 형질 도입하여 CCA에 의한 Runx2의 전사활성을 확인해보았다. 세포는 24-well test plate에 1×105의 수로 접종하였고 Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 0.
- Emerald Amp GT PCR Master Mix(TaKaRa Bio Inc., Tokyo, Japan)와 primer가 포함된 혼합물 19 μL와 cDNA 1 μL를 polymerase chain reaction(PCR) 사이클을 30회 수행하였다.
- EtOAc 가용분획 7.2 g을 H2O-MeOH 혼합용매를 용출용매로 사용하여 Toyopearl HW-40(coarse grade; 1.5 cm i.d.×60 cm)을 사용한 column chromatography를 실시하여 총 6개의 용리액[SC-1,H2O-MeOH(100:0); SC-2, H2O-MeOH(7:3); SC-3, H2OMeOH(1:1); SC-4, H2O-MeOH(3:7); SC-5, H2O-MeOH (0:10); SC-6, H2O-Me2CO(3:7)]을 얻었으며, YMC gel ODS AQ 120S(1.1 cm i.d.×40 cm, YMC Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 이용한 칼럼크로마토그래피 및 ODS column(YMC gel ODS A-323, 4.6 mm×150 mm, YMC Co., Ltd.)을 이용한 SEi-preparative HPLC를 수행하여 cryptochlorogenic acid(17.2 mg)를 분리하였다.
- MC3T3-E1 cell과 C3H10T1/2 cell을 48-well plate에 well당 1×104개로 접종하고, 24시간 배양 후 CCA를 1, 2, 5, 10 μM의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- C3H10T1/2는 mouse embryo 유래의 다분화능 줄기세포로부터 여러 가지 사이토카인의 작용을 통해 조골세포로 분화한다(18-22). MTT 시험법을 통해 C3H10T1/2 세포와 MC3T3-E1 세포에서 CCA의 독성 여부를 확인하였다(Fig. 2). 1, 2, 5, 10 μM의 농도에서 세포독성 여부를 알아본 결과 1, 2, 5 μM의 농도에서는 독성을 나타내지 않았지만 10 μM의 농도에서 독성을 나타내었다.
- PCR 반응 조건은 95°C에서 10분 후 95°C에서 30초, 어닐링 온도에서 30초, 72°C에서 30초 후 72°C에서 5분을 수행하였다.
- Tri-solution(Bioscience Technology, Gyeongsan, Korea)을 이용하여 MC3T3-E1 세포와 C3H10T1/2 세포로 부터 전체 RNA를 추출 및 분리하였다. 3 μg RNA를 TOP scriptTMRT DryMIX(Enzynomics, Daejeon, Korea)를 이용하여 complementary DNA(cDNA)를 합성하였다.
- qPCR은 AmpiGene™ qPCR Green Mix HiROX(Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA)와 primer가 포함된 혼합물 19 μL와 cDNA 1 μL를 polymerase chain reaction(PCR) 사이클을 40회 수행하였다.
- 0 g)에 유기용매를 사용하여 극성에 따른 분획은 80% MeOH 추출물을 감압농축하여 MeOH을 제거하고 물에 현탁된 추출시료를 저극성 용매인 n-hexane으로 먼저 추출한 후 수용층을 다시 ethyl acetate(EtOAc), n-butyl alcohol(n-BuOH)을 이용하여 각각 순차적으로 3회 분획하여 추출하였다. 각 용매추출분획을 감압 농축하여 건조시킨 후 n-hexane 가용분획(4.1g), EtOAc 가용분획(7.2 g), n-BuOH 가용분획(8.2 g), H2O가용분획(25.5 g)을 각각 얻었다. EtOAc 가용분획 7.
- Dlx5 또한 뼈에 의해 유도되며 Runx2의 프로모터에 직접적으로 결합하여 전사를 조절하고(26),조골세포 분화의 후기 표지 유전자인 OC의 유전자 발현을 조절함으로써 조골세포 분화를 조절한다(27). 그리고 조골세포 분화에 있어 중요한 조절자로 많이 알려진 Runx2의 발현량 차이를 측정하였다. Runx2는 runt domain 유전자의 종류이며 다분화능세포 또는 조골전구세포에서 ALP, OC 그리고 bone sialoprotein과 같은 유전자를 조절함으로써 조골세포 분화를 촉진하는 유전자이다(8,28,29).
- 먼저 세포독성 여부를 확인하기 위해 MTT assay를 수행하였고 독성이 없다고 확인된 5 μM의 농도에서 실험을 진행하였다. 그리고 조골세포로 분화할 수 있는 다분화능 세포인 C3H10T1/2와 조골세포인 MC3T3-E1에 CCA를 처리하여 표지 유전자인 Id1, Dlx5, Runx2의 발현을 확인하였다. 확인한 결과 표지유전자들의 발현이 대조군에 비교해서 증가한 것을 확인하였고, 그중 조골세포의 핵심 전사조절인자인 Runx2의 전사활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 promoter assay를 수행하여 Runx2의 전사활성이 증가하는 것을 재확인하였다.
- 먼저 세포독성 여부를 확인하기 위해 MTT assay를 수행하였고 독성이 없다고 확인된 5 μM의 농도에서 실험을 진행하였다.
- 울릉도 자생의 신선한 마가목 열매 1.0 kg을 분쇄기로 잘게 마쇄하고 80% methyl alcohol(MeOH) 3 L로 3일간 3회 반복 추출한 후 얻어진 결과물(47.0 g)에 유기용매를 사용하여 극성에 따른 분획은 80% MeOH 추출물을 감압농축하여 MeOH을 제거하고 물에 현탁된 추출시료를 저극성 용매인 n-hexane으로 먼저 추출한 후 수용층을 다시 ethyl acetate(EtOAc), n-butyl alcohol(n-BuOH)을 이용하여 각각 순차적으로 3회 분획하여 추출하였다. 각 용매추출분획을 감압 농축하여 건조시킨 후 n-hexane 가용분획(4.
- 2 mg)를 분리하였다. 이동상 용매로는 1% HCOOH (solvent A)와 acetonitrile(solvent B)을 92:8의 비율로 혼합하여 isocratic mode로 분석하였으며, 이동상의 유속은 1.0 mL/min을 유지하였고 280 nm에서 화합물을 검출하였다.
- 따라서 본 연구에서는 마가목에서 추출한 CA의 생물전환 물질인 CCA에 의한 조골세포 분화 효능을 검증하고자 하였다. 이를 위하여 다분화능 세포 C3H10T1/2와 조골전구세포 MC3T3-E1에 CCA 처리 후 조골세포 분화 마커 유전자의 발현 패턴을 분석하여 결과를 도출하였으며, 이 결과는 CCA의 골 관련 질환의 예방 및 치료 관련 소재로서의 이용가능성을 시사한다.
대상 데이터
- Mouse calvaria 유래 조골세포인 MC3T3-E1 세포는 ATCC CRL-2593(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)을 구입하여 사용하였다. 유지 시에는 α-minimum essential medium(α-MEM, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 배지에 10% fatal bovine serum(FBS, Atlas Biologicals, Fort Collins, CO, USA)과 1% 항생제[100 U/mL penicillin-100 μg/mL streptomycin(Gibco BRL)]를 첨가하여 37°C, 5% CO2 조건인 incubator에서 배양하였다.
- 유지 시에는 α-minimum essential medium(α-MEM, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 배지에 10% fatal bovine serum(FBS, Atlas Biologicals, Fort Collins, CO, USA)과 1% 항생제[100 U/mL penicillin-100 μg/mL streptomycin(Gibco BRL)]를 첨가하여 37°C, 5% CO2 조건인 incubator에서 배양하였다. Mouse embryo 유래 다분화능 세포인 C3H10T1/2 세포는 ATCC CCL-266(American Type Culture Collection)을 구입하여 사용하였다. 유지 시에는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(Gibco BRL)과 10% FBS 및 1% 항생제를 혼합하여 37°C, 5% CO2 조건인 incubator에서 배양하였다.
데이터처리
- 본 연구에서 얻은 결과는 표준편차로 표시하였고, 통계처리는 Student’s t-test를 이용하였으며, P<0.05, P<0.01, P<0.001인 경우 대조군과 CCA 처리군 사이에 유의성이 있음을 인정하였다.
이론/모형
- CCA가 조골세포 및 다분화능 세포의 중식에 미치는 영향을 알아보기 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay를 실시하였다. MC3T3-E1 cell과 C3H10T1/2 cell을 48-well plate에 well당 1×104개로 접종하고, 24시간 배양 후 CCA를 1, 2, 5, 10 μM의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
성능/효과
- 1, 2, 5, 10 μM의 농도에서 세포독성 여부를 알아본 결과 1, 2, 5 μM의 농도에서는 독성을 나타내지 않았지만 10 μM의 농도에서 독성을 나타내었다.
- Runx2는 runt domain 유전자의 종류이며 다분화능세포 또는 조골전구세포에서 ALP, OC 그리고 bone sialoprotein과 같은 유전자를 조절함으로써 조골세포 분화를 촉진하는 유전자이다(8,28,29). RT-PCR과 qPCR에서 모두 대조군에 비해 높은 발현량을 나타내었고 유의적인 차이를 보였다(Fig. 3).
- CCA의 다분화능 세포와 조골세포에 대한 분화 효과에 대하여 조사하였다. 결과에서 나타나듯 CCA는 조골세포 분화의 표지 유전자들을 상향 조절하였고, 그중 Runx2의 전사활성을 높였다. 아직 어떠한 분자적 기전을 통하여 CCA가 조골세포 분화를 촉진시키는지에 대해서는 추후 연구가 필요할 것이다.
- 확인한 결과 표지유전자들의 발현이 대조군에 비교해서 증가한 것을 확인하였고, 그중 조골세포의 핵심 전사조절인자인 Runx2의 전사활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 promoter assay를 수행하여 Runx2의 전사활성이 증가하는 것을 재확인하였다. 이러한 결과들을 토대로 CCA는 조골세포 분화를 촉진한다는 것을 알게 되었고, 골 질환 관련 제제로 CCA가 이용 가능할 수 있다고 생각된다.
- 그리고 조골세포로 분화할 수 있는 다분화능 세포인 C3H10T1/2와 조골세포인 MC3T3-E1에 CCA를 처리하여 표지 유전자인 Id1, Dlx5, Runx2의 발현을 확인하였다. 확인한 결과 표지유전자들의 발현이 대조군에 비교해서 증가한 것을 확인하였고, 그중 조골세포의 핵심 전사조절인자인 Runx2의 전사활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 promoter assay를 수행하여 Runx2의 전사활성이 증가하는 것을 재확인하였다. 이러한 결과들을 토대로 CCA는 조골세포 분화를 촉진한다는 것을 알게 되었고, 골 질환 관련 제제로 CCA가 이용 가능할 수 있다고 생각된다.
후속연구
- 아직 어떠한 분자적 기전을 통하여 CCA가 조골세포 분화를 촉진시키는지에 대해서는 추후 연구가 필요할 것이다. 그 외에도 기존에 보고된 항산화능이 조골세포 분화에 어떠한 영향을 미치는지에 대해서도 추가적인 실험이 필요할 것이다.
- 결과에서 나타나듯 CCA는 조골세포 분화의 표지 유전자들을 상향 조절하였고, 그중 Runx2의 전사활성을 높였다. 아직 어떠한 분자적 기전을 통하여 CCA가 조골세포 분화를 촉진시키는지에 대해서는 추후 연구가 필요할 것이다. 그 외에도 기존에 보고된 항산화능이 조골세포 분화에 어떠한 영향을 미치는지에 대해서도 추가적인 실험이 필요할 것이다.
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