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문제 정의
- 최근 연구에서는 streptozotocin으로 유발한 당뇨에서 얌빈 추출물의 혈당 저하 효과 10) , 면역 조절활성효과11) 등이 보고되어 있지만 얌빈 추출 물과 분획물의 항산화효능 및 미백 활성에 관한 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 얌빈의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능, 페놀, 플라보노이드 함량 및 미백 기능성을 연구하였고 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이후 도파퀴논은 효소의 촉매작용 없이 세포 내의 pH 조건에 의해 멜라닌을 생성한다18) . 본 연구에서는 2가지 기질 모두에서 티로시나제 저해활성을 평가하였다. L-DOPA를 기질로 하였을 때 얌빈 열수 추출물은 8 ㎎/㎖에서 46.
- 본 연구에서는 얌빈 열수 추출물의 항산화 및 미백소재로 서의 가능성을 알아보기 위하여 DPPH, ABTS radical 소거 활성 및 mushroom tyrosinase 저해활성, B16F10 세포 생존율, melanin 생합성 억제 효능을 평가하였다.
제안 방법
- 1 ㎛ α-MSH와 100 ㎛ IBMX를 처리하여 멜라닌 생성을 유도한 후, 얌빈 추출물을 농도 별로 72시간 동안 처리하였다.
- 생성된 pellet을 200 ㎕ NaOH와 10% DMSO에 용해하여 100℃에서 10분간 고정 하였다. 405 nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 생합성 억제효과를 확인하였다.
- B16F10 melanoma 세포를 이용하여 얌빈 추출물의 멜라닌 생성 억제효과를 측정하였다. 1 ㎛ α-MSH와 100 ㎛ IBMX를 처리하여 멜라닌 생성을 유도한 후, 얌빈 추출물을 농도 별로 72시간 동안 처리하였다.
- 마우스 melanoma 세포인 B16F10에 대한 얌빈 70% 에탄올 추출물 및 분획물의 세포 생존율을 평가하였다. 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 B16F10세포를 배양 한 후, 세포를 취하여 96well microplate에 각 well에 세포수가 5×103이 되도록 100 ㎕씩 분주하였다.
- 먼저, 얌빈 열수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 DPPH, ABTS 라디칼 소거능을 측정하였다. ABTS 라디칼은 극성과 비극성 시료의 소거활동 모두를 측정할 수 있어 DPPH 라디칼 소거법보다 적용범위가 넓다고 알려져 있다.
- 24시간 배양 후, 배지 교환없이 MTT를 PBS에 5 ㎎/㎖이 되도록 녹인 용액을 각 well에 20 ㎕씩 넣은 후, 3시간 더 배양하였다. 배지를 제거하고, 각 well에 DMSO를 100 ㎕씩 넣어 생성된 formazan을 녹인 후, microplate reader (Tecan, Switzerland)를 이용하여 570 nm에서 흡광 도를 측정하여 세포 생존율(%)을 계산하였다.
- 시료 20 ㎕ 에 증류수 1.58 ㎖, Folin-Ciocalteu′s phenol reagent 100 ㎕를 혼합하여 실온에서 1분간 반응시킨 후 300 ㎕ 의 20% Na2CO3 를 첨가하였다.
- 이 반응액을 UVspectrophotometer (UV1800, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 517nm에서 흡광도를 사용하여 측정한 후, 전자공 여능을 계산하여 산출하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 50% 감소시키는데, 필요한 시료의 양을 IC50 (50% inhibition concentration)으로 하여 나타내었으며 대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였다.
- 따라서 tyrosine 산화저해 활성 결과는 L-DOPA 산화 활성 저해 실험 결과와 일치하게 얌빈을 70% 에탄올에 추출하였을 때 높은 티로시나제 억제활성을 나타냈다. 얌빈 70% 에탄올 추출물이 열수 추출물에 비교하여 우수한 라디칼 소거능을 나타냈을 뿐 아니라, L-tyrosine, L-DOPA 모두에서 뛰어난 티로시나제 억제활성을 보여 이후 B16F10 세포를 활용한 멜라닌 생합성 효능 평가 실험에서는 얌빈 70% 에탄올 추출물 및 분획물을 시료로 하여 실험을 진행하였다.
- 얌빈 분획 추출물은 얌빈 70% ethanol 추출물에 20배의 증류수를 가하여 녹인 후 동량의 n-Hexane을 첨가하여 5회 반복 추출하고 분획하였다. 계속하여 잔여 H 2O층에 ethyl acetate 및 butanol을 순차적으로 이용하여 5회 반복 추출하였고 이를 감압 농축하여 남은 유기용매를 휘발시킨 뒤, 동결 건조하여 실험에 사용하였다.
- 얌빈 추출물의 항산화 효과를 평가하기 위하여 ABTS 라디칼 소거활성을 측정하였다. 7 mM ABTS와 2.
- 얌빈 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여 DPPH, ABTS 라디칼 소거능 및 페놀, 플라보노이드 함량을 측정하 였다. 얌빈 열수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과, 얌빈 열수 추출물의 IC50 값은 1215.
- 얌빈의 미백활성을 평가하기 위하여 버섯에서 유래한 티로 시나제에 기질로 L-tyrosine과 L-DOPA를 사용하여 티로시 나제 억제활성을 평가하였다. L-DOPA 산화 저해 활성은 얌빈 열수 추출물 8 ㎎/㎖에서 46.
- 일정농도의 시료 100 ㎕과 60 ㎛ DPPH 용액을 100 ㎕넣고 혼합한 후, 실온에서 30분간 반응시켰다. 이 반응액을 UVspectrophotometer (UV1800, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 517nm에서 흡광도를 사용하여 측정한 후, 전자공 여능을 계산하여 산출하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도를 50% 감소시키는데, 필요한 시료의 양을 IC50 (50% inhibition concentration)으로 하여 나타내었으며 대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였다.
- 티로시나제 실험 결과를 토대로 얌빈 70% 에탄올 추출물의 분획물을 제조하여 B16F10세포에 처리하여 멜라닌 생합성 억제 활성을 측정하였다. 버섯에서 유래한 티로시나제는 인간의 티로시나제와 아미노산 서열이 23% 동일하며, 마우스에서 유래한 티로시나제는 서열동일성 (identity)이 인간의 티로시나 제와 82%에 이를 만큼 유사하기 때문에 실험의 정확성이 더 높다19) .
- 20℃에서 2시간후 UV spectrophotometer (Infinite M200, Tecan, Salzburg, Austria)를 이용하여 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질 gallic acid를 사용하여 표준 검량선을 구하고, 얌빈 추출물의 총 페놀 함량을 산출하였다14)
- 1 mL의 diethylene glycol과 시료추출물 100 ㎕ 및 1N NaOH 10 ㎕를 잘 혼합시켜 37 ℃의 water bath에서 1시간 동안 반응시킨 후 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 naringin를 사용하였으며, 표준 검량 선을 구하여 얌빈 추출물의 플라보노이드 함량을 구하였다.
대상 데이터
- FBS (fetal bovine serum)은 Gibaco BRL. (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였고, 마우스 melanoma인 B16F10 세포는 한국세포 주은행 (Seoul, Korea)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용된 2.2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), 7 mM 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, gallic acid, Folin-Ciocalteu's phenol reagent, diethylene glycol, sodium hydroxide, naringin, 3, 4 Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA), (S)-2-Amino-3-(4-hydroxyphenyl) propionic acid, 3-(4-Hydroxyphenyl)-L-alanine (L-tyrosine), thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT), L-ascorbic acid, mushroom tyrosinase, sodium carbonate, 3-isobutyl- 1-methylxanthine (IBMX), alpha-melanocyte stimulating hormone (α-MSH)는 Sigma Aldrich (St Luis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였고, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)은 WELGENE Inc. (Daegu, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 얌빈은 경상북도 상주시에서 채취하여 실험의 재료로 사용하였다. 얌빈 열수 추출물은 건조한 얌빈 50g을 파쇄하여 증류수 500 mL에 넣고 100 ℃에서 2시간 동안 가열한 후, 이를 여과지 (Whatman No.
- 5 mM tyrosine을 50 ㎕ 넣고 37℃에서 5분간 반응 시킨 후 microplate reader를 이용하여 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 L-DOPA 산화 저해 활성 평가 실험과 동일하게 kojic acid를 사용하였다.
데이터처리
- 데이터는 평균±표준편차로 표현하였으며, SPSS (Version 22.0, IBM, Armonk, NY, USA)을 사용하여 one-way analysis of variance (ANOVA) test를 실시한 후 Student’s t-test방법에 의하여 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다 ( * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001).
이론/모형
- 얌빈 추출물의 총 페놀 함량 측정은 Folin-Denis법에 의해 측정하였다. 시료 20 ㎕ 에 증류수 1.
- 얌빈 추출물의 총 플라보노이드 함량은 Lister 등의 방법에 의해 구하였다15) . 1 mL의 diethylene glycol과 시료추출물 100 ㎕ 및 1N NaOH 10 ㎕를 잘 혼합시켜 37 ℃의 water bath에서 1시간 동안 반응시킨 후 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 전자공여능 (electron donating ability)은 Blosis 등의 방법에 의한 DPPH free radical 소거법으로 측정되었다12) . DPPH 라디칼 소거 활성 측정은 시료 중에 포함된 항산화 물질의 양을 측정하는데 사용되는 대표적인 실험법이다.
성능/효과
- 1. 얌빈 열수 추출물 및 70% 에탄올 추출물은 항산화 효과를 나타내었다.
- 2. 얌빈 열수 추출물과 70% 에탄올 추출물은 유사한 페놀 함량을 나타내고 열수 추출하였을 때 플라보노이드 함량이 다소 증가하였다.
- 3. 티로신 억제 활성은 L-tyrosine, L-DOPA를 기질로 하였을 때 얌빈 열수 추출물보다 얌빈 70% 에탄올추출 물이 우수한 효과를 나타내었다.
- 4. B16F10 세포에 얌빈 70% 에탄올 추출물 및 분획물을 처리하였을 때 500 ㎍/㎖ 이하에서 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다.
- 5. B16F10 세포를 IBMX 및 α-MSH로 자극하였을 때, 얌빈 70%에탄올 추출물 및 에틸 아세테이트 층에서 우수한 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내었다.
- ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과, 얌빈 열수 추출물의 IC50 값은 1825.16 ± 22.87 ㎍/㎖으로 나타났고, 얌빈 70%에탄올추출물의 IC50 값은 1711.71±58.09 ㎍/㎖으로 나타나 DPPH 라디칼 소거능 결과와 일치하게 얌빈 열수 추출물에 비교하였을 때 얌빈 70% 에탄올 추출물의 뛰어난 라디칼 소거능을 확인하였다 (Table 1).
- L-DOPA 산화 저해 활성은 얌빈 열수 추출물 8 ㎎/㎖에서 46.3 ± 0.58%의 활성이 나타 났고 얌빈 70% 에탄올 추출물은 61.87 ± 0.76%의 활성을 보였다 (Fig. 1B).
- L-DOPA를 기질로 하였을 때 얌빈 열수 추출물은 8 ㎎/㎖에서 46.3 ± 0.58%의 저해 활성이 나타났고 얌빈 70% 에탄올 추출물은 61.87 ± 0.76%의 저해 활성을 보였다.
- 1A). 따라서 tyrosine 산화저해 활성 결과는 L-DOPA 산화 활성 저해 실험 결과와 일치하게 얌빈을 70% 에탄올에 추출하였을 때 높은 티로시나제 억제활성을 나타냈다. 얌빈 70% 에탄올 추출물이 열수 추출물에 비교하여 우수한 라디칼 소거능을 나타냈을 뿐 아니라, L-tyrosine, L-DOPA 모두에서 뛰어난 티로시나제 억제활성을 보여 이후 B16F10 세포를 활용한 멜라닌 생합성 효능 평가 실험에서는 얌빈 70% 에탄올 추출물 및 분획물을 시료로 하여 실험을 진행하였다.
- 09 ㎍/㎖으로 나타 났다. 따라서 얌빈을 열수 추출하였을 때보다 70% 에탄올으로 추출하였을 때 라디칼 소거능이 증가하였음을 확인하였다.
- 14%의 활성을 보였다. 따라서 티로신 저해 활성 결과는 L-DOPA 산화 활성 저해 실험 결과와 일치하게 얌빈을 70% 에탄올에 추출하였을 때 티로시나제 억제활성이 뛰어난 것으로 확인되었다.
- 마우스 유래 melanoma인 B16F10 세포에서 얌빈 70% 에 탄올 추출물과 분획물의 멜라닌 생성량을 살펴본 결과, 얌빈 70% 에탄올추출물은 100 ㎍/㎖에서 80.52±3.96 (% of control)의 멜라닌 생성량을 보인데 비하여 H2O 분획물에서는 73.35 ± 2.27으로 멜라닌 생성이 감소함을 확인하였다.
- 따라서 추후의 연구는 500 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 진행되었다. 멜라닌 생합성 억제 효능을 평가하기 위하여 B16F10세포를 IBMX 및 a-MSH로 자극하였을 때 control 군에서는 멜라닌 함량이 유의하게 증가하였으나, 얌빈 70% 에탄올 추출물 처리 시 감소하였으며 특히 에틸 아세테이트층에서 뛰어난 멜라닌 생성 억제 효능을 나타내었다.
- 반면, hexane 분획물과 butanol 분획물은 100 ㎍/㎖ 농도에서 각각 87.55 ± 5.90, 97.65 ± 5.17의 멜라닌 생성량을 보여 ethyl acetate 분획물에 비해 다소 떨어지는 효능을 나타내었다(Fig. 3,4).
- 본 결과를 종합해보았을 때, 얌빈 70% 에탄올 추출물 분획물 중 ethyl acetate 분획물은 100 ㎍/㎖ 농도에서 B16F10 세포에 세포 독성 없이 멜라닌 합성을 억제함으로서 미백활성을 가지는 것으로 사료된다.
- 얌빈 70% 에탄올 추출물 및 H2O, butanol, hexane, ethyl acetate분획물의 B16F10 세포에서의 독성을 평가한 결과, 얌빈 70% 에탄올추출물 및 H2O, butanol 분획물에서는 1000 ㎍/㎖ 농도에서 세포독성을 보이지 않는 것을 확인하였다.
- 얌빈 열수 추출물, 얌빈 70% 에탄올 추출물의 tyrosine 산화 저해 활성을 확인한 결과, 양성대조군인 kojic acid는 4 ㎎/㎖ 에서 100.01 ± 0.05%라는 높은 tyrosinase 억제활성을 보였고 얌빈 열수 추출물은 8 ㎎/㎖에서 63.33 ± 0.42%의 활성을 나타낸 반면 얌빈 70% 에탄올 추출물은 94.87 ± 0.14% 의 활성을 보였다 (Fig. 1A).
- 얌빈 열수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과, 얌빈 열수 추출물과 얌빈 70% 에탄올 추출물의 IC50 값은 각각 1215.65 ± 65.99 ㎍/㎖, 998.10 ± 117.71 ㎍/㎖으로 나타났고, ABTS 라디칼 소거능은 각각 1825.16 ± 22.87 ㎍/㎖, 1711.71 ± 58.09 ㎍/㎖으로 나타 났다.
- 얌빈 열수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과, 얌빈 열수 추출물의 IC50 값은 1215.65± 65.99 ㎍/㎖으로 나타났고, 얌빈 70%에탄올추출물의 IC50 값은 998.10±117.71 ㎍/㎖으로 L-ascorbic acid (0.96 ± 0.02 ㎍/㎖)보다는 낮은 효과를 나타내었지만, 얌빈을 열수 추출하였을 때보다 70% 에탄올으로 추출하였을 때 DPPH 라디칼 소거능이 증가하였음을 확인하였다.
- 얌빈 열수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 총 페놀함 량은 각각 1.18 ± 0.03 ㎎/g, 1.16 ± 0.01 ㎎/g으로 나타났고, 플라보노이드 함량은 3.55 ± 0.06 ㎎/g, 1.78 ±0.03 ㎎/g으로 나타나 페놀 함량은 유사한 것으로 확인하였고 플라보노이드 함량은 얌빈을 열수 추출하였을 때 더 높은 것으로 나타났다.
- 03 ㎎/g 으로 나타났다. 얌빈 열수 추출물과 70% 에탄올 추출물의 페놀 함량은 유사하게 나타났으나 플라보노이드 함량은 얌빈을 열수 추출하였을 때 더 증가하는 것으로 나타났다 (Table 2).
- 특히 ethyl acetate 분획물은 100 ㎍/㎖ 농도에서 18.16±2.54의 멜라닌 생성량을 보여 뛰어난 멜라닌 생성억제효과를 나타내 었다.
- 티로신을 기질로 하여 티로시나아제 억제활성을 평가한 결과, 얌빈 열수 추출물 8 ㎎/㎖에서 63.33 ± 0.42%의 활성을 나타낸 반면 얌빈 70% 에탄올 추출물에 서는 94.87 ± 0.14%의 활성을 보였다.
후속연구
- 실험에 앞서 B16F10 세포에 얌빈 70% 에탄올 추출물및 분획물을 24시간 동안 처리하였을 때의 세포독성을 측정한 결과, 500 ㎍/㎖ 이하에서 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다. 따라서 추후의 연구는 500 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 진행되었다. 멜라닌 생합성 억제 효능을 평가하기 위하여 B16F10세포를 IBMX 및 a-MSH로 자극하였을 때 control 군에서는 멜라닌 함량이 유의하게 증가하였으나, 얌빈 70% 에탄올 추출물 처리 시 감소하였으며 특히 에틸 아세테이트층에서 뛰어난 멜라닌 생성 억제 효능을 나타내었다.
- 이상의 결과들로 얌빈 추출물은 항산화효과를 가지고 있고, 얌빈 70% 에탄올 추출물 및 분획물은 티로시나제 억제효과및 B16F10 세포에서 멜라닌 생합성 억제 효과가 뛰어나 항산화및 미백용 소재로서의 활용가능성이 높다고 사료된다.
- 이와 같은 결과로 미루어 보아 얌빈 70% 에탄올 추출물이 얌빈 열수 추출물 보다 높은 라디칼 소거능을 가지는 것을 확인하였으며, 페놀 및 플라보노이드 함량이 라디칼 소거능을 증가시키는 것에 기인하지 않은 것으로 나타나 추후 연구가 필요한 부분으로 판단하였다.
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