한의학에서 승마(Cimicifuge dahurica, C. dahurica), 황련(Coptis chinensis, C. chinensis), 황백(Phellodendri amurense, P. amurense) 추출물은 해독작용을 하며 후박(Magnol obovata, M. obovata) 추출물은 항균 효과가 있다고 알려져 있다. 본 연구에서는 승마, 황련, 황백, 후박 추출물을 혼합하여 기능성 화장품 소재로써의 이용 가능성을 검토하였다. MTT assay를 이용한 세포 독성평가와 DPPH와 ABTS를 이용한 항산화 효과를 측정한 결과, 단일 추출물보다 추출혼합물이 더 안전함을 확인 하였으며 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가됨을 확인하였다. 뿐만 아니라 NO 생성을 억제함으로써 우수한 항염증 효과가 있을 것으로 예상되며, 섬유아세포에서 UVB로 유도된 세포 손상을 보호하면서 type 1 pro-collagen 합성량이 증가되는 것을 관찰하였다. 또한 추출 혼합물은 melanin 합성과 tyrosinase 활성 및 melanin 합성 관련 인자 및 효소들(MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2)의 발현을 효과적으로 억제하였다. 이러한 연구결과로 보아 승마, 황련, 황백, 후박 추출 혼합물은 항노화 및 미백 등 기능성 화장품 소재로써 개발 가능성이 높을 것으로 사료된다.
한의학에서 승마(Cimicifuge dahurica, C. dahurica), 황련(Coptis chinensis, C. chinensis), 황백(Phellodendri amurense, P. amurense) 추출물은 해독작용을 하며 후박(Magnol obovata, M. obovata) 추출물은 항균 효과가 있다고 알려져 있다. 본 연구에서는 승마, 황련, 황백, 후박 추출물을 혼합하여 기능성 화장품 소재로써의 이용 가능성을 검토하였다. MTT assay를 이용한 세포 독성평가와 DPPH와 ABTS를 이용한 항산화 효과를 측정한 결과, 단일 추출물보다 추출혼합물이 더 안전함을 확인 하였으며 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가됨을 확인하였다. 뿐만 아니라 NO 생성을 억제함으로써 우수한 항염증 효과가 있을 것으로 예상되며, 섬유아세포에서 UVB로 유도된 세포 손상을 보호하면서 type 1 pro-collagen 합성량이 증가되는 것을 관찰하였다. 또한 추출 혼합물은 melanin 합성과 tyrosinase 활성 및 melanin 합성 관련 인자 및 효소들(MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2)의 발현을 효과적으로 억제하였다. 이러한 연구결과로 보아 승마, 황련, 황백, 후박 추출 혼합물은 항노화 및 미백 등 기능성 화장품 소재로써 개발 가능성이 높을 것으로 사료된다.
Cimicifuge dahurica (C. dahurica), Coptis chinensis (C. chinensis) and Phellodendri amurense (P. amurense) extracts has an detoxification effect and Magnol obovata bark (M. obovata) extracts has an antibacterial effect in oriental medicine. This study investigated the possibility of the extract mixt...
Cimicifuge dahurica (C. dahurica), Coptis chinensis (C. chinensis) and Phellodendri amurense (P. amurense) extracts has an detoxification effect and Magnol obovata bark (M. obovata) extracts has an antibacterial effect in oriental medicine. This study investigated the possibility of the extract mixture as a functional cosmetic ingredient by mixing C. dahurica, C. chinensis, P. amurense and M. obovata extracts. MTT assay was carried out for toxicity test and DPPH/ABTS experiments for antioxidant effects of the extract mixture. Results show that the extract mixture was safer and antioxidant effects in a dose-dependent manner than single extract of the mixture. The mixture effectively inhibited NO (nitric oxide) production, which indicate good efficacy for anti-inflammation. The mixture also protected UVB-induced cell damage and increased type 1 pro-collagen synthesis in fibroblast. In addition, it's treatment inhibited the melanin synthesis and tyrosinase activity by lowering expression of MITF, tyrosinase and TRPs in B16F10 melanoma cell. These results suggest that medicinal herbal extract mixture may be useful as a functional ingredient for anti-aging and skin whitening cosmetic formula.
Cimicifuge dahurica (C. dahurica), Coptis chinensis (C. chinensis) and Phellodendri amurense (P. amurense) extracts has an detoxification effect and Magnol obovata bark (M. obovata) extracts has an antibacterial effect in oriental medicine. This study investigated the possibility of the extract mixture as a functional cosmetic ingredient by mixing C. dahurica, C. chinensis, P. amurense and M. obovata extracts. MTT assay was carried out for toxicity test and DPPH/ABTS experiments for antioxidant effects of the extract mixture. Results show that the extract mixture was safer and antioxidant effects in a dose-dependent manner than single extract of the mixture. The mixture effectively inhibited NO (nitric oxide) production, which indicate good efficacy for anti-inflammation. The mixture also protected UVB-induced cell damage and increased type 1 pro-collagen synthesis in fibroblast. In addition, it's treatment inhibited the melanin synthesis and tyrosinase activity by lowering expression of MITF, tyrosinase and TRPs in B16F10 melanoma cell. These results suggest that medicinal herbal extract mixture may be useful as a functional ingredient for anti-aging and skin whitening cosmetic formula.
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문제 정의
UVB는 염증 유발과 산화적 스트레스로 인한 주름생성을 촉진 시켜 노화가 진행 되게 하는 역할을 한다. 따라서 UVB로 유도된 섬유아세포 손상에 대한 추출 혼합물의 보호효과를 측정하기 위해 UVB를 조사한 세포에 추출 혼합물을 처리하여 세포에 미치는 영향을 살펴보았다. 그 결과 Figure 5과 같이 세포에 UVB를 80 mJ/cm2 조사하였을 때 UVB를 처리하지 않은 무처리군에 비해 세포 생존율이 47%정도 감소되었으며,Mix3, Mix4, Mix5를 50 µg/mL 처리할 경우 UVB 처리군에 비해 각각 98%, 99%, 104% 정도 증가되었다.
이와 같이 승마, 황련, 황백, 후박은 승마황련탕 및 황련해독탕 등 약용으로도 많이 이용되어 왔으며 다양한 생리활성 효과가 있다고 알려져 있지만 이들 혼합물에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 국내 자생하는 천연 한방원료인 승마, 황련, 황백, 후박의 단일 추출물과 이들 각 추출물을 혼합한 추출혼합물의 항산화, 항염 및 자외선에 의한 피부 손상과 주름개선, 미백효과 등의 생리활성을 조사하여 기능성 화장품 소재로써의 사용 가능성을 조사하였다.
본 연구에서는 한의학에서 피부발진, 해독작용에 많이 사용되는 승마, 황련, 황백과 항균작용이 있는 후박 추출물을 다양한 혼합비로 혼합한 뒤, 이 추출 혼합물에 대한 항산화, 항염증, 주름개선 및 미백 효과에 대해 연구하여 기능성 한방 화장품 소재로서의 이용 가능성을 검토하였다.
제안 방법
DPPH 라디칼 소거능에 대한 실험은 Blois의 방법[26]을 변형하여 각각의 희석한 추출물 2 mL를 0.2mM DPPH 2 mL과 혼합한 후 약 37 ℃에서 30 min간 방치시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
UVB 조사 기기로는 UV crosslinker(BLX-312, Vilber Lourmat, France)를 사용하였다. DPPH와 ABTS 흡광도 측정은 UV/vis spectrophotomater(Optizen 2120 UV, Mecasys, Korea)를 사용하였다. 세포배양에 사용된 배지는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, GE Healthcare, USA), fetal bovine serum (FBS, GE Healthcare, USA), penicillin-streptomycine(Lonza Walkersvile, USA)을 사용하였다.
membrane은 5% skim milk로 1 h 동안 blocking 한 후 1차 항체는 5% skim milk에 희석하여 상온에서 2 h 반응시켰으며 2차 항체는 상온에서 1 h 동안 반응시켰다. membrane 세척은 tris-buffered salin and tween 20(TBST)로 10 min씩 4번 진행하였으며 enhanced chemiluminescense (ECL) kit를 이용하여 단백질 발현 양상을 관찰하였다.
이 후 배양액을 제거하고 추출물 혼합물을 농도별로 처리한 후 48 h 배양하였다. 각 well으로부터 상등액을 회수하여 pro-collagen type C-peptide EIA kit를 통해 측정하였다.
각각의 추출물을 농도별(25, 50 µg/mL)로 1 h 전처리 후 염증 반응유도 인자인 LPS 1 µg/mL를 처리하여 24 h 동안 배양하였다.
이러한 collagen이 감소할 경우 피부 주름을 유발하여 피부 노화를 진행시킨다[30]. 따라서 섬유아세포주인 CCD-986sk 세포를 이용하여 추출 혼합물의 세포 내 pro-collagen 합성효과를 알아보았다. 그 결과 세포 내 pro-collagen 합성이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 50 µg/mL 농도의 Mix3,Mix4, Mix5 처리군은 대조군에 비해 53%, 26%, 12% 정도 pro-collagen 합성이 증가되는 것을 확인하였다(Figure 6).
따라서 이 후 실험에서는 단일 추출물과 추출 혼합물 모두 세포에 크게 자극을 일으키지 않는100 µg/mL 이하 농도에서 실험을 진행하였다.
따라서 추출 혼합물이 멜라닌 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 B16F10melanoma 세포에 α-MSH와 추출 혼합물 또는 arbutin을 함께 처리하여 멜라닌 생성 억제능을 비교하였다.
멜라닌은 몇 가지 세포 내 신호전달 기전을 통하여 합성되는데 그중 MITF는 멜라닌 합성과정에서 중요한 전사 조절 인자로서 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 전사를 촉진시킨다. 따라서 추출 혼합물이 멜라닌 합성에 관여하는 전사인자와 효소들의 발현을 조절하는지 확인하기 위해 western blot을 이용하여 단백질 발현량을 관찰하였다. 추출 혼합물은 이전 실험들을 통해 전체적으로 효과가 좋았던 Mix3과 Mix4를 사용하였다.
생성된 NO의 양은 세포 배양 상등액 50 µL와Griess 시약 1% (w/v) sulfanilamide 50 µL를 첨가하여 차광 시킨 뒤 10 min 동안 실온에 방치한 후 2.5% (v/v) phosphoric acid에 녹인 N-1-napthylethylenediamine을 50µL 혼합하여 10 min간 차광하여 반응시키고, ELISAreader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
이러한항산화 효과를 평가하기 위해 추출 혼합물을 25-100µg/mL로 처리하여 DPPH radical 소거활성을 측정하였다.
추출 후 여과지(Advantec No. 2)로 여과한 후 회전감압 농축기(N-1000, Eyela, Japan)를 이용하여 감압 농축 후, 각 시료를 동결건조하여 얻은 분말은 DMSO로 용해하여 0.45 µm 필터에 필터링한 후 사용하였다.
항산화 효과를 평가할 수 있는 방법 중 하나인 ABTS 라디칼 소거활성 측정은 Re 등의 방법[27]을 변형하여 측정하였다. 추출혼합물에 의한 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과 DPPH 결과와 마찬가지로 농도 의존적으로 소거활성이 증가되는 패턴을 보였으며 100 µg/mL에서는 각각 46%, 39%, 37%, 44%, 40% 정도의 소거 활성을 보였다(Figure 3).
대상 데이터
효능 평가 기기로는 ELISA reader (Biochrom, England)를 사용하였다. UVB 조사 기기로는 UV crosslinker(BLX-312, Vilber Lourmat, France)를 사용하였다. DPPH와 ABTS 흡광도 측정은 UV/vis spectrophotomater(Optizen 2120 UV, Mecasys, Korea)를 사용하였다.
그 외 실험에 사용된 시약은 dimethyl sulfoxide (DMSO), 1, 1-diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH), 2, 2’-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) diammonium salt, 3 (4,5-demethylthiazol-2-yl)-2,5-dipehenyltetrazolium bromide (MTT),lipopolysaccharide (LPS), Griess reagent, sulfanilamide,phosphoric acid, N-1-napthylethylenediamine 등은 Sigma(USA)에서 구입하여 사용하였다.
본 실험에서 사용된 승마, 황련, 황백, 후박 한약재는 전남 화순 한방유통센터에서 구입하여 사용하였다. 건조된 시료는 파쇄하여 분말로 사용하였으며 시료 100 g에 70% 발효주정을 첨가하여 80 ℃에서 4 h 추출하고 6-10 h 숙성과정을 걸쳐 추출하였다.
본 실험에서 사용한 CCD-986sk, RAW 264.7 세포는ATCC에서 구입하여 사용하였다. 구입한 세포는DMEM 배지에 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin-streptomycine을 첨가하여 37 ℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
세포배양에 사용된 배지는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, GE Healthcare, USA), fetal bovine serum (FBS, GE Healthcare, USA), penicillin-streptomycine(Lonza Walkersvile, USA)을 사용하였다.
따라서 추출 혼합물이 멜라닌 합성에 관여하는 전사인자와 효소들의 발현을 조절하는지 확인하기 위해 western blot을 이용하여 단백질 발현량을 관찰하였다. 추출 혼합물은 이전 실험들을 통해 전체적으로 효과가 좋았던 Mix3과 Mix4를 사용하였다. 그 결과 추출 혼합물 처리시 α-MSH에 의해 증가된 MITF,tyrosinase, TRP-1, TRP-2 모두 발현량이 대폭 감소됨을 확인하였다(Figure 9).
세포 독성 평가는 MTT assay로 측정하였다. 세포를 96-well plate에 1 × 10⁴cells/well의 농도로 분주한 후 37 ℃, 5% CO2 하에서 24 h 동안 배양하여 승마, 황련,황백, 후박 혼합 추출물을 농도별로 처리하고 다시 24 h 동안 배양한 후 PBS로 세척해주었다.
효능 평가 기기로는 ELISA reader (Biochrom, England)를 사용하였다. UVB 조사 기기로는 UV crosslinker(BLX-312, Vilber Lourmat, France)를 사용하였다.
성능/효과
RAW 264.7 세포와 B16F10 melanoma 세포에 단일추출물과 추출 혼합물을 50-200 µg/mL 농도로 처리하여 세포독성을 측정한 결과 승마, 후박 추출물은 100µg/mL 이상 농도에서 세포독성이 나타났으며 황련, 황백 추출물과 추출 혼합물은 동일 농도에서 세포 생존율이 90% 이상으로 세포독성이 나타나지 않았다(Figure 1).
각각의 단일 추출물과 추출 혼합물의 세포 독성 평가에서 승마, 후박 추출물은 RAW 264.7 세포와 B16F10 세포에서 독성이 나타났으며 황련, 황백 추출물과 추출 혼합물들은 200 µg/mL 농도까지 세포독성을 보이지 않았다.
결론적으로 승마, 황련, 황백, 후박 추출 혼합물은 단일 추출물에서 나타났던 세포독성을 완화시켰으며 보다 더 우수한 항산화 효과를 나타내었다. 또한 우수한 항염증, 주름개선, 미백 효과가 있어 이후 다양한 피부 질환 치료 및 기능성 화장품 소재로서 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
그 결과 α-MSH 처리군과 비교했을 때 Mix3, Mix4, Mix5 처리군은 각각 44%, 40%, 48% 정도 멜라닌이 크게 감소되는 것으로 나타났으며, 저농도에서도 양성대조군인 arbutin 보다 뛰어난 억제효과를 보였다(Figure 7).
그 결과 Figure 5과 같이 세포에 UVB를 80 mJ/cm2 조사하였을 때 UVB를 처리하지 않은 무처리군에 비해 세포 생존율이 47%정도 감소되었으며,Mix3, Mix4, Mix5를 50 µg/mL 처리할 경우 UVB 처리군에 비해 각각 98%, 99%, 104% 정도 증가되었다.
그 결과 세포 내 pro-collagen 합성이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 50 µg/mL 농도의 Mix3,Mix4, Mix5 처리군은 대조군에 비해 53%, 26%, 12% 정도 pro-collagen 합성이 증가되는 것을 확인하였다(Figure 6).
그 결과 추출 혼합물 처리시 α-MSH에 의해 증가된 MITF,tyrosinase, TRP-1, TRP-2 모두 발현량이 대폭 감소됨을 확인하였다(Figure 9).
단일 추출물과 추출 혼합물의 항산화 효과를 평가하기 위해 DPPH와 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 항산화 활성이 농도 의존적으로 증가되는 것을 볼 수 있었으며 특히 후박 추출물과 추출 혼합물이 단일추출물에 비해 비교적 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보였다. 이는 후박 추출물에 비해 효과가 미비했던 단일추출물들을 항산화 효과가 뛰어난 후박 추출물과 혼합함으로써 상승효과를 낸 것으로 사료된다.
따라서 추출 혼합물을 멜라닌 생성 저해 실험과 동일한 조건으로 25µg/mL 농도로 처리하여 세포내 tyrosinase 억제효과를측정한 결과 Figure 8와 같이 α-MSH 처리군과 비교했을 때 Mix3, Mix4, Mix5 처리군은 각각 39%, 40%, 41% 정도 tyrosinase의 활성을 우수하게 억제하는 것으로 나타났으며, arbutin 보다 뛰어난 억제효과를 보였다.
또한 추출 혼합물은 LPS 처리군 대비 NO 생성량을 최대 280% 정도 우수하게 감소시켰으며 CCD-986sk 섬유아세포에서의 UVB 보호효과를 측정한 결과 UVB로 인해 손상된 세포가 추출 혼합물에 의해 뛰어나게 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
본 연구의 실험 결과는 3회 반복하였으며, 실험결과를 mean ± S.D.로 나타내었다.
뿐만 아니라 추출 혼합물은 pro-collagen 합성을 농도 의존적으로 증가시키면서 주름개선에 탁월한 효과를 보였으며 α-MSH로 유도된 멜라닌 생성과 tyrosinase 활성을 저해하고 더 나아가 멜라닌 생성에 관여하는 전사인자와 효소들인 MITF, tyrosinase, TRP-1,TRP-2의 발현을 대폭 감소시키는 것을 확인하였다.
이러한 NO 생성 억제효과를 측정하기 위하여 RAW 264.7 세포에 LPS로 자극을 주고, Griess 시약을 사용하여 NO 생성량을 측정한 결과 추출 혼합물은 농도 의존적으로 NO 생성량을 감소시켰으며, 50 µg/mL 농도로 처리하였을 때 LPS 처리군 대비 260% 이상 감소시키면서 우수한 NO 억제효과를 보였다(Figure 4).
추출혼합물에 의한 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과 DPPH 결과와 마찬가지로 농도 의존적으로 소거활성이 증가되는 패턴을 보였으며 100 µg/mL에서는 각각 46%, 39%, 37%, 44%, 40% 정도의 소거 활성을 보였다(Figure 3).
특히 후박은 100 µg/mL에서95%의 소거활성을 나타내면서 L-ascorbic acid와 유사하게 우수한 소거 활성을 보였으며 추출 혼합물 역시각각 94%, 91%, 86%, 87%, 85% 정도로 승마, 황련, 황백의 단일 추출물에 비해 높은 소거활성을 보임으로써추출 혼합물의 상승효과를 확인하였다.
후속연구
결론적으로 승마, 황련, 황백, 후박 추출 혼합물은 단일 추출물에서 나타났던 세포독성을 완화시켰으며 보다 더 우수한 항산화 효과를 나타내었다. 또한 우수한 항염증, 주름개선, 미백 효과가 있어 이후 다양한 피부 질환 치료 및 기능성 화장품 소재로서 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
외인성 노화 중 자외선에 의한 광노화는 어떤 문제를 일으키는가?
피부노화는 일반적으로 피부의 구조적, 생리적인 기능이 감소하는 내인성 노화와 광노화와 같은 외부 스트레스에 의해 발생하는 외인성 노화가 있다. 지속적으로 자외선에 노출되면 피부에 색소침착과 홍반, 광 독성, 광알레르기 같은 질병을 유발시키고, 자유 라디칼을 생성하여 만성적 광노화를 일으킨다. 또한 세포 내 collagen 및 elastin fiber 등의 기질 단백질이 손상되어 collagen양이 부족해지고, elastin fiber가 변성되어 주름을 생성하는 등 피부 노화를 촉진한다. 뿐만 아니라 피부가 자외선에 노출되면 염증 반응을 일으켜 홍반, 수포 및 소양증 증상이 관찰될 수 있으며, 과도한 멜라닌 생성으로 기미, 주근깨 같은 피부 색소 침착,피부암을 유발할 수 있다. 이러한 반응이 지속되고 과도하게 발현이 되면 피부에 2차적인 손상을 입히는데 그때 생성되는 NO는 피부조직의 손상 및 유전자 변이를 일으켜 피부 속에 존재하는 콜라겐 섬유와 탄력 섬유를 분해하여 염증반응에 의한 광노화를 촉진시킨다[1-5].
승마의 성분과 효능은 무엇인가?
승마(C. dahurica)는 phenylpropanoid 계열의 화합물 중 isoferulic acid, ferulic acid, caffeic acid 등이 함유되어 있으며 한방에서는 진통작용을 나타내고 청열 해독작용을 가지고 있어 발한, 해열, 해독 소염제로 분류되며 화농성 질환에 사용된다.
피부노화의 종류에는 어떤 것들이 있는가?
피부노화는 일반적으로 피부의 구조적, 생리적인 기능이 감소하는 내인성 노화와 광노화와 같은 외부 스트레스에 의해 발생하는 외인성 노화가 있다. 지속적으로 자외선에 노출되면 피부에 색소침착과 홍반, 광 독성, 광알레르기 같은 질병을 유발시키고, 자유 라디칼을 생성하여 만성적 광노화를 일으킨다.
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