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문제 정의
- 이에 따라 본 연구에서는 치자의 씨의 anthocyanin 함량을 측정하고 70% ethanol, chloroform:methanol (CM, 2:1, v/v) 및 n-butanol의 용매 별로 추출하여 total phenol 함량을 측정한 뒤 질소산화물 소거능(nitric oxide scavenging activity, nitrite scavenging activity), 항산화능(antioxidant activity by β-carotene bleaching assay), 환원력(reducing power), 지질 과산화 저해(lipid peroxidation inhibition)를 측정하여 치자의 추출 용매에 따른 생리활성을 비교하여 생활습관병 예방과 건강기능 식품 개발의 목적으로 이들의 소비 효율성을 높이고 이에 대한 기초자료를 제시함으로써 고부가 가치의 천연 항산화제의 이용 가능성을 검토하고자 하였다.
- 치자 씨의 anthocyanin 함량을 알아보고 70% ethanol, chloroform:methanol (CM, 2:1, v/v) 및 n-butanol의 3가지 용매를 사용한 추출물의 용매 별 total phenol 함량 및 질소 산화물 소거능, 환원력, β-carotene 탈색을 이용한 항산화력 및 지질과산화 저해능 측정을 통하여 치자의 기능성 식품 재료로서의 가치를 검토하기 위하여 본 실험을 수행하였다.
제안 방법
- Nitric oxide (NO) radical 소거능은 Rao의 방법을 변형하여 측정하였다[16]. 용매별 추출물 각 농도의 시료 2.
- 4 mL와 15분간 반응시켜 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control로 BHA를 사용하였으며 백분율로 나타내어 표시하였다.
- 0 mL를 가하여 25℃ water bath에서 30분간 방치하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Positive control은 trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-car boxylic acid, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)를 사용하였으며 치자 씨의 NO 소거능은 백분율로 계산하여 나타내었다.
- Total phenol 함량은 Folin-Denis` 방법을 변형하여 실험하였다[15]. 시료 추출액 1.
- 1 mL를 가하여 3분간 혼합하여 산화 정도에 따른 흡광도 차이를 500 nm에서 측정하였다. positive control로 BHA를 사용하였으며 백분율로 계산하여 지질과산화 저해능을 나타내었다.
- 2, Tokyo, Japan)하였다. 각 추출물은 rotary vacuum evaporator (Hei-VAP Advantage, Heidolph Co., Germany)를 이용하여 40℃에서 감압 농축하여 용매를 제거한 후, 실험에 사용하였으며, 시료의 수율은 추출 전 시료 중량에 대한 추출 후 건조 중량 백분율(%)로 나타내었다[14].
- 치자 씨의 anthocyanin 함량은 pH-differential method를 사용하여 측정하였다[13]. 건조된 치자 씨 분말 0.2 g에 methanol-1M HCl (85:15, v/v) 15.0 mL를 가하여 30분 동안 혼합한 뒤 여과(filter paper, Advantec, No.2, Tokyo, Japan) 하여 분석 시료로 사용하였다. 시료 1.
- 2 mL를 넣어 잘 혼합시켜 10분 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다[19]. 또한 EC50은 positive control 인 BHA를 통하여 계산하였다.
- 시료의 추출은 동결 저장된 치자 씨 분말 100 g 씩 취하여 70% ethanol, chloroform: methanol (CM, 2:1, v/v), n-butanol 용매를 각 10배 가하여(1:10, w/v) 24시간씩 2회 추출한 뒤 여과(filter paper, Advantec, No.2, Tokyo, Japan)하였다. 각 추출물은 rotary vacuum evaporator (Hei-VAP Advantage, Heidolph Co.
- 실험 데이터는 3회 반복 측정하였으며, mean±SD (n=3)으로 표현하였다.
- , Jena, Germany)를 사용하여 510 nm 및 700 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 치자 씨의 anthocyanin 함량은 cyanidin-3-glucoside의 몰 흡광계수(ℇ=26,900 M-1cm-1)를 이용하여 mg/100 g DW (dry weight)로 계산하여 나타하였다.
대상 데이터
- 구입한 치자의 씨를 분리한 뒤 자연 건조시켜 분쇄기(HMF-3250S, Han-Il Co., Seoul, Korea)에 분쇄하여 분말로 만든 다음 deep freezer (DF-8514, Il-Shin BioBase Co., Daegu, Korea)에 –80℃로 저장하여 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 시료인 치자(Gardenia jasminoides Ellis)는 경상남도 남해군에서 2014 년 11월에 수확하여 반 건조 상태로 되어있는 시료를 남해 소재 약재상에서 2015년 1월에 구입하였다. 구입한 치자의 씨를 분리한 뒤 자연 건조시켜 분쇄기(HMF-3250S, Han-Il Co.
- 5 mL을 첨가하여 실온에 1시간 방치한 후 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 caffeic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)를 사용하여 시료 1 g당 mg CAE (mg of caffeic acid equivalents)로 나타내었다.
데이터처리
- 또한 실험 결과 값 간의 유의적인 차이는 one-way ANOVA (analysis of variance)로 분석 한 뒤 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test에 의하여 각 농도 간의 유의성을 검증하였다.
- 05 수준에서 Duncan`s multiple range test에 의하여 각 농도 간의 유의성을 검증하였다. 시료 농도별 결과값에 대한 IC50과 EC50은 선형 회귀분석을 통하여 구하였다. 통계처리에 대한 프로그램은 IBM SPSS statistic ver.
이론/모형
- 치자 씨의 anthocyanin 함량은 pH-differential method를 사용하여 측정하였다[13]. 건조된 치자 씨 분말 0.
성능/효과
- CM 추출물에서 33.53± 0.72%, 36.70±0.08%, 43.23±0.21%, IC50 0.902±0.001 mg/mL로 관찰되었으며, 70% ethanol 추출물에서 농도 별로 32.40±0.28%, 34.30±0.39%, 35.98±0.27%, IC50 2.162± 0.028 mg/mL, n-butanol 추출물 24.72±0.19%, 26.01±0.16%, 28.14±0.28%, IC50 3.173± 0.013mg/mL 순으로 관찰되었다.
- CM 추출물에서 농도 별로 각각 23.73±0.06%, 31.64±0.19%, 44.70±0.09%, IC50 0.717±0.001 mg/mL로 씨 추출 용매 중 유의적인 차이를 보이며 가장 강한 탈색 저해능이 관찰되었으며, 70% ethanol 추출물에서 22.03±0.07%, 30.11±0.20%, 41.32± 0.00%, IC50 0.791±0.009 mg/mL, n-butanol 추출물에서 16.00±0.09%, 18.69±0.06%, 27.87±0.09%, IC50 1.382±0.006 mg/mL 순으로 n-butanol 추출물에서 유의적으로 가장 낮은 탈색 저해능이 관찰되었다.
- CM 추출물에서 농도 별로 각각 53.26±0.22%, 64.80± 0.46%, 76.56±0.16%, IC50 0.145±0.001 mg/mL로 강한 저해능이 관찰되었으며, 70% ethanol 추출물에서 52.94±0.26%, 63.48± 0.22%, 75.20±0.12%, IC50 0.151±0.002 mg/mL로 0.2 mg/mL 농도의 CM과 70% ethanol 추출물의 지질과산화 저해능은 유의적인 차이가 없었다.
- CM 추출물에서 농도 별로 각각 76.97±0.27%, 80.14±0.32%, 84.24±0.09%, IC50 0.003± 0.000 mg/mL로 가장 강한 소거능이 관찰되었으며, 70% ethanol 추출물에서 74.10±0.09%, 77.18±0.18%, 79.99±0.09%, IC50 0.004± 0.000 mg/mL, n-butanol 추출물에서 30.66± 0.23%, 34.39±0.18%, 37.15±0.23%, IC50 1.382±0.028 mg/mL 순으로 NO radical 소거 능이 관찰되었다.
- n-butanol 추출물에서 38.54± 0.38%, 46.28±0.10%, 53.33±0.26%, IC50 0.507±0.002 mg/mL 순으로 n-butanol 추출물에서 유의적으로 가장 낮은 저해능과 IC50이 관찰되었다.
- 치자 씨의 70% ethanol, chloroform:methanol (CM, 2:1, v/v) 및 n-butanol에서의 추출 수율은 Table 1에 나타내었다. 각 용매별 추출 수율은 CM에서 36.39%, 70% ethanol에서 27.32%, n-butanol에서 26.23%로 CM에서 추출 수율이 가장 높게 나타났다.
- 각 추출물의 환원력은 70% ethanol 추출물에서 농도 별로 각각 0.073±0.001, 0.132±0.002, 0.182±0.002, EC50 1.021±0.005 mg/mL로 씨 추출 용매 중 유의적인 차이를 보이며 가장 강한 환원력이 관찰되었으며, CM 추출물 0.057±0.001, 0.113±0.001, 0.154±0.001, EC50 1.184±0.019 mg/mL, n-butanol 추출물에서 0.028±0.001, 0.056± 0.001, 0.079±0.001, EC50 2.310±0.014 mg/mL 순으로 관찰되었다.
- 또한 total phenol, flavonoid 함량이 높아짐에 따라 항산화 활성 증가한다고 알려져 있다[31], 반면 본 실험에서의 total phenol 함량과 질소산화물 소거능은 환원력 분석에서와 같이 70% ethanol 추출물이 아니라 CM 추출물에서 가장 높게 나타났다. 이러한 결과는 치자의 주요 생리활성성분 중 수용성 carotenoid 인 crocin과 본 실험에서 측정한 치자 씨 분말의 anthocyanin 및 그 밖의 flavonoid 성분의 추출된 정도가 환원력 측정에 영향을 준 것으로 사료된다.
- 33%) 순으로 관찰되었다. 이상의 결과를 미루어 볼 때 치자 씨의 용매 별 total phenol 함량 순과 환원력을 제외한 나머지 생리 활성 분석에서의 결과와 마찬가지로 CM 추출물에서 가장 높은 결과가 나타나 phenolic 함량에 따라 여러 생리활성 효과도 증가하는 것을 확인하였으며, 환원력의 경우 70% ethanol 추출물에서 가장 높은 활성을 보여 수용성 carotenoid인 crocin 및 flavonoid가 영항을 준 것으로 사료된다. 본 실험 결과 치자의 씨는 질소산화물 소거능, 항산화능, 지질과산화 저해능이 우수하여 본 실험에서 측정한 anthocyanin 및 phenolic 성분 뿐만 아니라 여러 유익한 생리활성물질을 가지고 있는 것으로 생각되며, 추출 수율과 여러 생리활성을 고려하였을 때 CM과 70% ethanol에서 추출하였을 때 효과가 좋을 것으로 그에 따른 기능성 식품 및 천연항산화제로서의 가치가 매우 기대된다.
- 23%) 로 관찰되었다. 추출 용매 별 항산화 활성은 농도 (0.2, 0.4, 0.6 mg/mL)가 증가할수록 유의적으로 증가하였으며 positive control로 사용된 ascorbic acid, BHA, trolox 보다는 낮은 활성이 관찰되었다. 치자 씨의 total phenol 함량(mg CAE/g)은 CM (32.
- 치자 씨의 anthocyanin 함량을 측정한 결과 2.201±0.516 mg/100 g DW로 나타났으며, 치자 씨의 용매 별 추출 수율은 CM (36.39%), 70% ethanol (27.32%), n-butanol (26.23%) 로 관찰되었다.
- 6 mg/mL)가 증가할수록 유의적으로 증가하였으며 positive control로 사용된 ascorbic acid, BHA, trolox 보다는 낮은 활성이 관찰되었다. 치자 씨의 total phenol 함량(mg CAE/g)은 CM (32.50), 70% ethanol (30.09), n-butanol (11.07) 추출물 순으로 n-butanol 추출물에서 가장 적은 함량을 보였으며, Nitric oxide (NO) radical 소거능에서는 CM (76.97~84.24%), 70% ethanol (74.10~79.99%), n-butanol (30.66~37.15%) 추출물 순으로 관찰되었다. Nitrite (NO2) 소거능은 CM (33.
- 1에 나타내었고, IC50값을 구하여 Table 1에 표시하였다. 치자 씨의 각 용매 별 추출물 0.2, 0.4, 0.6 mg/mL의 농도에서 측정한 결과 농도가 증가함에 따라 NO radical 소거능 또한 유의적으로 증가하였다. CM 추출물에서 농도 별로 각각 76.
- 4에 나타내었고, EC50 값을 구하여 Table 1에 나타내었다. 치자 씨의 각 용매 별 추출물 0.2, 0.4, 0.6 mg/mL의 농도에서 환원력을 측정한 결과 농도가 증가함에 따라 유의적으로 흡광도가 증가하였다. 각 추출물의 환원력은 70% ethanol 추출물에서 농도 별로 각각 0.
- 치자 씨의 용매 별 추출물 각 농도에서 측정한 결과 농도가 증가함에 따라 β-carotene 탈색 저해능이 유의적으로 증가하는 것으로 관찰되었다.
- 치자 씨의 용매 별 추출물에서의 total phenol 함량은 Table 1에 나타내었으며, CM 추출물에서 32.50±0.27 mg CAE/g으로 가장 높은 total phenol 함량이 관찰되었으며, 70% ethanol 추출물에서 30.09±0.23 mg CAE/g, n-butanol 추출물 11.07±0.08 mg CAE/g 순으로 n-butanol 추출물에서 가장 낮은 값으로 측정되었으며 각 용매 추출물에서의 total phenol 함량은 유의적인 차이가 있었다.
후속연구
- 또한 Esterbauer는 산화된 지질을 실험 동물에게 경구 투여하였을 때 죽상 동맥경화증 위험 증가, 간세포, 림프구 및 여러 유전적 독성을 야기하여 산화된 지질 섭취의 위험성을 시사하였다[34]. 본 실험 결과 치자 씨의 추출물 모두에서 높은 지질과산화 저해능이 확인되어 지질 성분에서의 천연 산화방지제로서의 효과가 기대 된다.
- 이상의 결과를 미루어 볼 때 치자 씨의 용매 별 total phenol 함량 순과 환원력을 제외한 나머지 생리 활성 분석에서의 결과와 마찬가지로 CM 추출물에서 가장 높은 결과가 나타나 phenolic 함량에 따라 여러 생리활성 효과도 증가하는 것을 확인하였으며, 환원력의 경우 70% ethanol 추출물에서 가장 높은 활성을 보여 수용성 carotenoid인 crocin 및 flavonoid가 영항을 준 것으로 사료된다. 본 실험 결과 치자의 씨는 질소산화물 소거능, 항산화능, 지질과산화 저해능이 우수하여 본 실험에서 측정한 anthocyanin 및 phenolic 성분 뿐만 아니라 여러 유익한 생리활성물질을 가지고 있는 것으로 생각되며, 추출 수율과 여러 생리활성을 고려하였을 때 CM과 70% ethanol에서 추출하였을 때 효과가 좋을 것으로 그에 따른 기능성 식품 및 천연항산화제로서의 가치가 매우 기대된다.
- 또한 식물에서 유래한 anthocyanin은 인체 내의 다양한 생리활성 중 최근 시각과 뇌 기능의 향상, 비만과 당뇨의 관리, 심혈관 질환 예방에 anthocyanin의 역할에 초점을 두어 종양, 노화방지, 항암, 항염, DNA 손상 방지 등의 효과가 있는 것으로 점차 알려지고 있으며 이에 관련된 연구가 진행되고 있다[22]. 이에 치자씨는 anthocyanin 성분을 함유하고 있는 것으로 확인 되어 그에 따른 여러 생리활성 효과가 기대된다.
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