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문제 정의
- 식초의 원료가 되는 과일의 환경에 미생물이 적응해 있다고 보고, 여러 식초를 실험에 사용하였다. 그리고 그 식초를 과일농축액으로 만든 새로운 배양액에 접종했을 때 질량의 감소량이 측정되었고, 질량 감소량을 이용한 변수를 통계적으로 검정하여 체질별 약재를 분류하고자 하였다 [13]. 특정 환경에 적응한 미생물이 든 식초를 이용하여, 과일을 체질별로 분류하고자 한 시도로, 기존의 연구와 접근하는 방법이 달랐다.
- 한약의 사상의학적 분류를 실험적으로 밝히는 연구는 아직까지 거의 없었다. 본 연구는 사상의학 약재 분류에 대한 실험적 근거를 얻기 위해 진행하였다. 이에 육계와 지모두 한약에 적응시킨 효모를 소음인 약재와 소양인 약재로 만든 배양한약에 접종하고 변수 R과 S를 분석하여 유의한 차이를 보였다.
- 이에 본 연구는 앞서 행해진 연구를 실험실에서 표준화된 방법으로 개선하여 실행하였다. 우선 표준화된 균주를 선택하였다.
가설 설정
- 소음인 약재인 육계에 적응한 효모와 소양인 약재인 지모에 적응한 효모가 소음인 약재 4종에 접종되었을 때 질량 감소량의 차이가 있을 것이라는 가설을 세우고 실험을 진행하였다.
제안 방법
- GG, Zingiber officinale Roscoe; DG, Angelica acutiloba Kitag; BC, Atractylodes macrocephala Koidz; CG, Ligusticum officinale Kitag; YG yeast, Issatchenkia orientalis adapted in Cinnamomum cassia J. Presl medium; GM yeast, Issatchenkia orientalis adapted in Anemarrhena asphodeloides Bunge medium; The result represent the mean±standard error of three independent experiments.
- 표준균주인 Issatchenkia orientalis (KCTC 7277)는 생물자원 센터 (Korean Collection for Type Cultures)에서 분양 받아 사용하였다. PDB (potato starch 4.0 g, dextrose 20.0 g/L, Difco, NJ, USA)에서의 흡광도를 측정하여 그래프로 나타내었다 (Fig. 1).
- 그리고 식초를 대신하여 효모를 ‘적응한약’으로 만들어진 배양액에 적응시켜 사용하였다.
- 기존의 연구에서는 ‘질량 감소량 비율의 변화율’을 변수로 하여 검정하였는데 [13], 본 연구에서는 ‘질량 감소량의 변화율’ 및 ‘질량 감소량 그래프의 볼록한 정도’를 각각 변수 R과 S로 설정하여 검정하였다.
- 적응시킨 효모를 ‘배양한약’ 으로 만들어진 배양액에 접종하여 질량을 측정하였다. 또한, 기존 연구 [13]와 마찬가지로 질량 감소량을 이용한 변수를 검정하여 생물학적 반응의 차이를 찾고자 하였으며, 새로운 사상의학적 약재분류 방법을 탐색하였다.
- 배양 후 12 hr, 24 hr, 36 hr, 48 hr인 시점의 질량을 10-4 g 단위로 측정하고 기록했다. 질량의 측정은 시험관을 배양기에서 실온으로 꺼내고 10분간 질량 안정화를 한 이후에 실시했다.
- 개선된 실험을 위해서는 균의 적응기간도 늘려야 한다. 본 연구에서는 32시간 동안 적응이 이루어진 효모가 쓰였는데, 효모가 특정 환경에 적응하기에는 다소 짧은 시간으로 사료 된다. 앞으로 다양한 효모와 시료를 이용한 정량적 실험이 이어진다면 보다 정확한 사상의약 (四象醫藥)의 실험적 근거를 얻을 수 있을 것이다.
- 소음인 약재, 소양인 약재 각각에 육계적응균과 지모적응균을 접종한 경우의 변수 R과 S의 차이를 통계적으로 검정하였다 (Table 2, 3). 질량감소 그래프에서는 효모가 작용한 것을 확인하기 위해 D(36~46)과 대조군의 차이를 통계적으로 검정하였다 (Fig.
- 소음인 약재와 소양인 약재 각각 4종에 대하여 육계적응균과 지모적응균을 각각 2개의 시험관에 동일하게 접종했으며, 3번의 반복실험을 시행하여 총 6번의 실험결과에 대한 평균과 표준오차 값을 그래프로 나타내었다 (Fig. 2, 3). 단, 대조군 실험은 실험당 한 개의 시험관에서 이루어져 총 3번의 반복실험에 대한 평균과 표준오차를 나타내었다.
- 소음인 약재와 소양인 약재에 대해서 질량 감소량에 따른 차이를 통계적으로 검정하기 위해 기존의 변수를 응용한 변수 두 가지를 설정하였다. 기존의 연구에서는 ‘질량 감소량 비율의 변화율’을 변수로 하여 검정하였는데 [13], 본 연구에서는 ‘질량 감소량의 변화율’ 및 ‘질량 감소량 그래프의 볼록한 정도’를 각각 변수 R과 S로 설정하여 검정하였다.
- 약재 추출을 위해 소음인 약재로 분류된 육계, 백출, 건강, 천궁, 당귀와 소양인 약재로 분류된 지모, 황련, 황백, 지황, 택사를 40 g씩 부직포에 담아서 각각 유리병에 넣었다. 100oC 증류수를 200 mL씩 부어 24시간 동안 추출했다.
- 옌센 부등식을 응용하여 아래와 같이, 배양 후 12시간부터 24시간까지의 질량 감소량의 2배에 0시간부터 12시간까지 의 질량감소량과 24시간부터 36시간까지의 질량 감소량을 빼서 변수 S를 설정하였다. 변수 S는 질량 감소량 그래프에서 D(12~24) 부분의 볼록한 정도와 관련이 있다 (Fig.
- 이에 본 연구는 앞서 행해진 연구를 실험실에서 표준화된 방법으로 개선하여 실행하였다. 우선 표준화된 균주를 선택하였다. 한약에 따라 항균작용 [14]이 있기 때문에 낮은 pH 와 높은 온도 등의 다양한 스트레스에 적응력이 뛰어난 효모인 Issatchenkia orientalis [15,16]를 선택하였다.
- 위 균주를 PDA (potato starch 4.0 g, dextrose 20.0 g, 15.0 g/ L, Difco, NJ, USA) 배지에서 계대배양한 후 단일콜로니를 PDB배지에서 24시간 순수배양을 하고, 500 µL를 각각 육계 배양액 (육계추출액과 14.0°Brix 포도당용액의 1:7 혼합액 8.8 mL)과 지모배양액 (지모추출액과 14.0°Brix 포도당용액 의 1:7 혼합액 8.8 mL)에 접종하여 32시간 동안 적응시켜 육계적응균 (YG yeast)과 지모적응균 (GM yeast)을 만들었다.
- 위와 같은 방법과 동일한 조건으로 서로 다른 날에 세 번의 반복 실험을 시행했다.
- 적응시킨 효모를 ‘배양한약’ 으로 만들어진 배양액에 접종하여 질량을 측정하였다.
- 적응한약인 육계와 지모를 제외한 8개의 배양한약 건강, 당귀, 백출, 천궁, 지황, 택사, 황련, 황백 추출액을 각각 4개의 시험관 (총 32개 시험관, 20×200 mm)에 1 mL씩 분주했다 (효모를 특정 환경에 적응시키는 데 쓰인 한약을 ‘적응한약’, 적응된 균을 배양하는 배양액에 쓰인 한약은 ‘배양한약’이라고 명명하였다).
- 전통의학정보포털 오아시스 [17]를 이용하여 ‘효모’, ‘사상’ 을 키워드로 논문을 검색하여 기존 연구의 동향을 파악하였다.
대상 데이터
- 건강 (KIOM 2-16-0482), 당귀 (KIOM 2-16-0485), 백출 (KIO M 2-16-0475), 육계 (KIOM 2-16-0479), 천궁 (KIOM 2-16- 0484), 지모 (KIOM 2-16-0480), 지황 (KIOM 2-16-0486), 택사 (KIOM 2-16-0487), 황련 (KIOM 2-16-0481), 황백 (KIOM 2- 16-0483)은 광명당제약 한약재로, 한국한의학연구원 한약표준표본관에서 분양받아 사용하였다. 또한 학명은 산림청 국가표준식물목록과 한국한의학연구원 한약표준표본관을 참고하였다 (Table 1).
- 건강 (KIOM 2-16-0482), 당귀 (KIOM 2-16-0485), 백출 (KIO M 2-16-0475), 육계 (KIOM 2-16-0479), 천궁 (KIOM 2-16- 0484), 지모 (KIOM 2-16-0480), 지황 (KIOM 2-16-0486), 택사 (KIOM 2-16-0487), 황련 (KIOM 2-16-0481), 황백 (KIOM 2- 16-0483)은 광명당제약 한약재로, 한국한의학연구원 한약표준표본관에서 분양받아 사용하였다. 또한 학명은 산림청 국가표준식물목록과 한국한의학연구원 한약표준표본관을 참고하였다 (Table 1).
- 최근에 식초를 이용하여 식품을 체질별로 분류하고자 한 시도가 있었다. 식초의 원료가 되는 과일의 환경에 미생물이 적응해 있다고 보고, 여러 식초를 실험에 사용하였다. 그리고 그 식초를 과일농축액으로 만든 새로운 배양액에 접종했을 때 질량의 감소량이 측정되었고, 질량 감소량을 이용한 변수를 통계적으로 검정하여 체질별 약재를 분류하고자 하였다 [13].
- 표준균주인 Issatchenkia orientalis (KCTC 7277)는 생물자원 센터 (Korean Collection for Type Cultures)에서 분양 받아 사용하였다. PDB (potato starch 4.
- 우선 표준화된 균주를 선택하였다. 한약에 따라 항균작용 [14]이 있기 때문에 낮은 pH 와 높은 온도 등의 다양한 스트레스에 적응력이 뛰어난 효모인 Issatchenkia orientalis [15,16]를 선택하였다.
데이터처리
- 정의된 두 개의 변수 R과 S에 대하여 통계적 분석이 이루어졌다. 1, 2, 3차 실험 각각에 대한 분석과 더불어 3번의 반복 실험의 평균을 구해서 통합분석 (Integrated analysis)을 실시하였다.
- 2, 3). 단, 대조군 실험은 실험당 한 개의 시험관에서 이루어져 총 3번의 반복실험에 대한 평균과 표준오차를 나타내었다.
- 정의된 두 개의 변수 R과 S에 대하여 통계적 분석이 이루어졌다. 1, 2, 3차 실험 각각에 대한 분석과 더불어 3번의 반복 실험의 평균을 구해서 통합분석 (Integrated analysis)을 실시하였다.
- 소음인 약재, 소양인 약재 각각에 육계적응균과 지모적응균을 접종한 경우의 변수 R과 S의 차이를 통계적으로 검정하였다 (Table 2, 3). 질량감소 그래프에서는 효모가 작용한 것을 확인하기 위해 D(36~46)과 대조군의 차이를 통계적으로 검정하였다 (Fig. 2, 3). 통계학적 분석을 위해 비모수적 방법인 윌콕슨 순위합 검정 (Wilcoxon rank sum test)을 사용하였으며 [18], 유의수준은 0.
- 2, 3). 통계학적 분석을 위해 비모수적 방법인 윌콕슨 순위합 검정 (Wilcoxon rank sum test)을 사용하였으며 [18], 유의수준은 0.05로 하여 검정하였다.
성능/효과
- 이를, table 2에서는 변수를 이용한 통계적 분석으로 보였다. 1차, 2차, 3차 실험, 통합분석 모두에서 육계적응균을 접종한 경우가 지모적응균을 접종한 경우에 비해, D(0~12)에서 D(12~24)로의 증가율인 R이 유의하게 크게 나타났다 (Table 2, p는 각각 0.028, 0.038, 0.050, 0.001). 또한, 1차, 3차 실험, 통합분석에서 육계적응균을 접종한 경우가 지모적응균을 접종한 경우에 비해 위로 볼록한 정도를 나타내는 변수 S가 유의하게 크게 나타났다 (Table2, p는 각각 0.
- 001). 또한, 1차, 3차 실험, 통합분석에서 육계적응균을 접종한 경우가 지모적응균을 접종한 경우에 비해 위로 볼록한 정도를 나타내는 변수 S가 유의하게 크게 나타났다 (Table2, p는 각각 0.005, 0.028, 0.001). 다만, 2차 실험에서는 변수 S가 유의하지 않았다 (p=0.
- 본 연구는 사상의학 약재 분류에 대한 실험적 근거를 얻기 위해 진행하였다. 이에 육계와 지모두 한약에 적응시킨 효모를 소음인 약재와 소양인 약재로 만든 배양한약에 접종하고 변수 R과 S를 분석하여 유의한 차이를 보였다. 소음인 약재의 경우, 육계적응균을 접종했을 때의 변수 R과 S가 지모적응균을 접종했을 때보다 크게 나타났다 (통합 분석 p=0.
- 소양인 약재에서는 소음인 약재에서와 반대로 지모적응균이 육계적응균에 비해 변수 R과 S가 클 것으로 기대했다. 하지만 검정한 변수 R과 S에 대하여 유의한 차이를 관찰하지는 못했으며, 변수의 평균도 육계적응균에서 대체로 크게 나타났다.
후속연구
- 약재에 대한 반응을 정확하게 비교하기 위해서는 접종하는 균의 수가 같아야 한다. 또한, 본 연구는 Issatchenkia orientalis 단일 효모에 대한 실험의 결과로 일반화하기는 어렵다.
- 본 연구에서는 32시간 동안 적응이 이루어진 효모가 쓰였는데, 효모가 특정 환경에 적응하기에는 다소 짧은 시간으로 사료 된다. 앞으로 다양한 효모와 시료를 이용한 정량적 실험이 이어진다면 보다 정확한 사상의약 (四象醫藥)의 실험적 근거를 얻을 수 있을 것이다.
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