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문제 정의
- 따라서 오가피 역시 腎을 補益하는 약물이며, 혈관평활근에 대한 이완효과가 검증된 바 있으므로 음경해면체 평활근에서도 이완효과를 나타낼 가능성이 충분한 것으로 예상된다. 이에 저자는 補益腎의 효능을 가진 오가피가 수축된 음경해면체 평활근에 미치는 영향과 작용기전에 대하여 NO와PDE-5를 중심으로 연구를 진행하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 이와 같이 오가피의 면역항진, 항암, 항비만 및 혈관이완, 신부 전개선 등의 다양한 효과에 대하여 보고되었으나 음경해면체 평활근에 미치는 영향에 대한 연구는 아직 보고되지 않았다. 이에 저자는 오가피가 補益腎의 효능으로 음경해면체의 이완에도 효과를 나타낼 것으로 예상하고, 음경해면체 평활근의 이완에 관여한다고 알려진 NO, PDE-5를 중심으로 연구를 진행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
제안 방법
- 0.05% 3,3'-diaminobenzidine과 0.01% HCl이 포함된 0.05M tris-HCl 완충용액 (pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색을 시행하고 영상분석을 통하여 음경해면체내 eNOS와 PDE5의 양성반응 정도를 측정하였다.
- Ca2+-free solution에서 해면체절편에 오가피 추출물(3.0 ㎎/㎖)을 10분간 전처치한 다음 PE 1 µM로 수축시킨 후 Ca2+ 1 mM을 투여하여 오가피를 전처치하지 않은 그룹과 수축의 변화를 비교하였다.
- Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) 배지로 37℃, CO2 5% 조건에서 24시간 동안 배양한 HUVEC에 오가피 추출물을 농도별로 처리하고 다시 24시간 배양한 다음 MTT assay로 세포생존율을 측정하였다26). MTT(methylthiazol-2-yl-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide, 5 ㎎/㎖) 20 ㎕를 넣고, 세포 배양기 내에서 2시간 방치하였다.
- Nitric oxide(NO) 생성은 Griess reaction에 의거하여 microplate reader로 배지에 생성된 nitrite 양을 측정하여 NO 생성 정도를 결정하였다. 오가피 추출물을 24시간 처리한 후에 배양액 50 ㎕에 Griess reagent(1% sulfanilamide, 0.
- Nitrite 양은 sodium nitrite를 농도별로 조제하여 만든 표준곡선을 통하여 산출하였고, 생성된 nitrite의 양은 µM로 환산하여 표시하였으며, 각 실험의 대조군은 세포 배양액을 사용하였다.
- Round flask에 오가피(Acanthopanacis Cortex) 200 g을 증류수 2000 ㎖과 함께 넣고 2시간 동안 가열하여 추출하였다. 추출액은 rotary evaporator(Eyela, Japan)로 감압 농축한 후 동결건조기로 건조시켰으며, 건조된 24.
- 해면체절편을 50~60℃의 Bouin 용액에서 매염 처리를 1시간 동안 시행한 다음 70% 에탄올로 picric acid를 제거하였다. Weigert iron hematoxylin에서 10분간 반응시켜 핵을 염색하였고, Biebrich scalet-acid fuchsin와 phosphomolybdic-phosphotungstic acid에서 각각 15분간, aniline blue에 5분간 처리하여 평활근(적색)과 아교섬유(청색)를 염색하였다. 해면체 절편은 광학현미경(BX50.
- mouse를 ether로 마취한 후 음경을 적출하였으며, 적출한 조직은 4℃의 modified krebs-ringer bicarbonate solution(NaCl 125.4, KCl 4.9, CaCl2 2.8, MgSO4 1.2, NaHCO3 15.8, KH2PO4 1.2, glucose 12.2 mM, pH 7.4)에 담가 음경 주위의 지방조직을 제거하고 2 ㎜ 두께의 해면체절편을 제작하였다. 해면체절편은 정상조직인 control(Ctrl) group과 PE(1 µM)만 처리한 PE group, PE(1 µM)와 오가피(3 ㎎/㎖)를 동시에 처리한 AC group으로 구분하였다.
- 다시 4℃ humidified chamber에서 1차 항체인 mouse anti-eNOS(1:100, Santa Cruz Biotec)와 rabbit anti-PDE5(1:100, Santa Cruz Biotec)에 72시간 동안 반응시켰다. 그 후 실온에서 2차 항체인 biotinylated goat anti-mouse IgG2a(1:100, DAKO, USA)에 24시간 link 한 후 실온에서 avidin biotin complex kit(Vector Lab, USA)에 1시간 동안 반응시켰다. 0.
- 5 g의 피동장력을 가하였다. 다시 1시간 안정시킨 다음 실험을 수행하였으며, 연속되는 실험의 경우 다른 처치를 시행하기 전에 1시간 회복시킨 후 실험을 시행하였다.
- MTT(methylthiazol-2-yl-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide, 5 ㎎/㎖) 20 ㎕를 넣고, 세포 배양기 내에서 2시간 방치하였다. 상층액을 제거한 후 formazan 침전물에 DMSO 200 ㎕를 넣어 15분간 녹인 다음 ELISA microplate reader를 이용하여 540 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하여 세포생존율을 계산하였다.
- 실험을 시작하기 전 모든 해면체절편을 organ bath 내에서 1시간 30분 동안 안정시킨 다음 micromanipulator(Narishige N2, Japan)를 이용하여 1.5 g의 피동장력을 가하였다. 다시 1시간 안정시킨 다음 실험을 수행하였으며, 연속되는 실험의 경우 다른 처치를 시행하기 전에 1시간 회복시킨 후 실험을 시행하였다.
- Nitric oxide(NO) 생성은 Griess reaction에 의거하여 microplate reader로 배지에 생성된 nitrite 양을 측정하여 NO 생성 정도를 결정하였다. 오가피 추출물을 24시간 처리한 후에 배양액 50 ㎕에 Griess reagent(1% sulfanilamide, 0.1% naphtylethylene diamide 및 2.5% 인산)를 동일한 양과 혼합하여 상온에서 10분간 반응시킨 다음 550 nm에서 흡광도 변화를 측정하였다.
- 음경해면체의 endothelial nitric oxide synthases(eNOS)와 phosphodiesterase5(PDE5)의 분포를 관찰하고자 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 해면체절편을 proteinase K(20 ㎍/㎖)에서 5분 간 proteolysis를 거치고 blocking serum인 10% normal goat serum에서 2시간 동안 반응시켰다.
- 음경해면체의 평활근과 아교섬유의 분포를 관찰하고자 Masson trichrome 염색을 실시하였다. 해면체절편을 50~60℃의 Bouin 용액에서 매염 처리를 1시간 동안 시행한 다음 70% 에탄올로 picric acid를 제거하였다.
- 토끼를 urethane(3 ㎎/㎏, 정맥주사)으로 마취하여 음경을 적출하였으며, 적출한 조직을 4℃의 modified krebs-ringer bicarbonate solution(125.4 mM NaCl, 4.9 mM KCl, 2.8 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 15.8 mM NaHCO3, 1.2 mM KH2PO4, 12.2 mM glucose, pH 7.4)에 담가 음경의 백막을 제거한 후 2×2×8 ㎜ 크기의 해면체절편을 만들었다.
- Weigert iron hematoxylin에서 10분간 반응시켜 핵을 염색하였고, Biebrich scalet-acid fuchsin와 phosphomolybdic-phosphotungstic acid에서 각각 15분간, aniline blue에 5분간 처리하여 평활근(적색)과 아교섬유(청색)를 염색하였다. 해면체 절편은 광학현미경(BX50. Olympus, Japan)을 통한 영상분석을 시행하여 음경해면체내의 아교섬유에 대한 평활근의 분포비율을 계산하였다.
- 해면체절편에 L-NNA 10 µM을 15분간 전처치한 다음 PE 1µM로 수축시킨 후 오가피 추출물(0.1, 0.3, 1.0, 3.0 ㎎/㎖)을 투여하여 L-NNA을 처치하지 않은 그룹과 수축의 변화를 비교하였다.
- 해면체절편은 O2 95%와 CO2 5%로 혼합된 가스로 포화시킨 modified krebs-ringer bicarbonate solution(37℃)이 peristaltic pump를 통하여 3 ㎖/min의 속도로 주입되는 organ bath(용량1.5 ㎖)에 현수하였다. 해면체절편의 한쪽 끝은 organ bath의 저부에 고정시키고 다른 한쪽은 force transducer에 연결하여 장력을 측정하였으며, 측정 결과는 physiograph(PowerLab, Australia)를 이용하여 기록하였다.
- 해면체절편은 정상조직인 control(Ctrl) group과 PE(1 µM)만 처리한 PE group, PE(1 µM)와 오가피(3 ㎎/㎖)를 동시에 처리한 AC group으로 구분하였다. 해면체절편은 상온에서 10% NBF에 24시간 동안 고정한 후 통상적인 방법으로 paraffin에 포매하여 3 ㎛ 두께의 연속절편을 제작하였다.
- 해면체절편은 정상조직인 control(Ctrl) group과 PE(1 µM)만 처리한 PE group, PE(1 µM)와 오가피(3 ㎎/㎖)를 동시에 처리한 AC group으로 구분하였다.
- 해면체절편을 PE 1 µM로 수축시킨 후 오가피 추출물을 농도별(0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0 ㎎/㎖)로 투여하여 해면체의 수축 변화를 측정하였다.
- 5 ㎖)에 현수하였다. 해면체절편의 한쪽 끝은 organ bath의 저부에 고정시키고 다른 한쪽은 force transducer에 연결하여 장력을 측정하였으며, 측정 결과는 physiograph(PowerLab, Australia)를 이용하여 기록하였다.
대상 데이터
- 10주령의 ICR계 mouse(샘타코, 한국)와 체중 2.0 kg 내외의 New Zealand white 수컷 토끼(샘타코, 한국)를 실험에 사용하였으며, 동물은 고형사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 하면서 7일간 실험실 환경에 적응시킨 다음 실험에 사용하였다. 본 실험은 세명대학교 동물실험윤리위원회의 승인(smecae 16-05-01) 후 실시되었다.
- 사람의 제대정맥내피세포인 human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)을 CloneticsTM and PoieticsTM (Lonza, USA)에서 구입하여 passage 3~7번까지 사용하였다. 세포배양은 endothelial cell basal medium-2(EBM-2) bullet kit (Lonza, USA)를 사용하여 37℃, CO2 5% 조건아래에서 시행하였다.
- Round flask에 오가피(Acanthopanacis Cortex) 200 g을 증류수 2000 ㎖과 함께 넣고 2시간 동안 가열하여 추출하였다. 추출액은 rotary evaporator(Eyela, Japan)로 감압 농축한 후 동결건조기로 건조시켰으며, 건조된 24.8 g의 분말을 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과는 모두 평균과 표준편차로 나타내었고, 해면체 평활근 수축은 실제 수축의 크기와 PE로 유발된 최고 수축에 대한 백분율로 표시하였다.
- 실험결과의 비교는 SPSS 20.0을 이용하여 one-way ANOVA를 시행하였으며, 사후검정은 Fisher의 LSD를 사용하였다.
이론/모형
- 5 and 1 ㎎/㎖) of AC extracts for 24 hr at 37℃. Cell viability was measured by MTT assay. AC, Acanthopanacis Cortex extract.
성능/효과
- Ca2+이 제거된 상태의 krebs-ringer solution에서 PE로 수축시킨 후 Ca2+을 투여하였을 때 1.21±0.27 g의 수축을 나타내었으나, 오가피를 전처치한 경우 1.03±0.26 g(84.6%)으로 감소되어 오가피는 Ca2+ 투여에 의한 수축의 증가를 유의성 있게 억제시켰다.
- HUVEC에 오가피 추출물을 농도별로 24시간 처치한 후 MTT assay를 통해 세포 생존율을 측정한 결과 오가피 추출물의 농도 0.1, 0.3, 0.5, 1 ㎎/㎖에서 모두 세포 생존율에 변화가 없었다.
- 또한 L-arginine으로부터 NO를 생성시키는 NOS에 대하여 blocker로 작용하는 L-NNA32)를 전처치한 경우에 오가피 추출물의 음경해면체 이완효과는 유의하게 억제되었다. HUVEC에 오가피 추출물을 농도별로 처치하였을 때 NO의 생성이 유의하게 증가되었으며, mouse의 음경해면체 조직에 오가피 추출물을 처리한 후 면역조직화학적 변화를 관찰한 결과, 음경해면체 내 eNOS 양성반응이 PE군에 비하여 AC군에서 증가되어 나타났다. 이 결과들은 오가피가 eNOS 활성화를 통하여 NO의 생성을 증가시킴으로써 음경해면체 평활근에 대하여 이완효과를 나타낸다는 사실을 알 수 있다.
- L-NNA를 전처치한 경우 오가피 추출물의 음경해면체 이완효과가 0.3, 1, 3 ㎎/㎖에서 유의성있게 억제되었다.
- Mouse의 음경해면체 조직에 오가피 추출물을 처리한 후 면역조직화학적 변화를 관찰한 결과, 음경해면체 내 PDE-5 양성반응은 PE군에 비해 AC군에서 유의하게 감소되었으며, 이는 오가피가 PDE-5의 작용을 억제함으로써 음경해면체에 이완효과를 나타낸다는 사실을 의미한다.
- Mouse의 음경해면체 조직에 오가피 추출물을 처리한 후 조직 화학적 변화를 관찰한 결과, 음경해면체 내 아교섬유에 대한 평활근 분포 비율은 PE군에 비하여 AC군에서 유의성 있게 증가되었으며, 이는 오가피가 음경해면체 평활근에 대하여 이완효과를 나타냈다는 것을 보여준다. PDE는 cGMP의 분해에 관여하는 효소로 물질 특이성, 세포내 분포 및 억제제의 선택적 민감도 등과 같은 기능적특성에 따라 9종류의 아형으로 분류되며7,8), 그 중 특히 5형이 세포내에서 cGMP 불활성화와 가장 관련이 있다고 알려져 있다34).
- NO synthase inhibitor인 L-NNA의 전처치는 오가피의 음경해면체 이완효과를 억제시켰으며, 특히 L-NNA를 전처치한 경우 오가피 추출물의 이완효과는 0.3, 1.0, 3.0 ㎎/㎖에서 유의성 있게 억제되었다.
- 먼저 PE로 최대의 수축을 유발시킨 음경해면체에 오가피 추출물을 농도별로 투여하였을 때, 오가피 추출물이 음경해면체에 대해 나타낸 유의한 이완효과의 결과로 오가피가 음경해면체에 이완효과를 가진다는 사실을 확인할 수 있다. 또한 L-arginine으로부터 NO를 생성시키는 NOS에 대하여 blocker로 작용하는 L-NNA32)를 전처치한 경우에 오가피 추출물의 음경해면체 이완효과는 유의하게 억제되었다. HUVEC에 오가피 추출물을 농도별로 처치하였을 때 NO의 생성이 유의하게 증가되었으며, mouse의 음경해면체 조직에 오가피 추출물을 처리한 후 면역조직화학적 변화를 관찰한 결과, 음경해면체 내 eNOS 양성반응이 PE군에 비하여 AC군에서 증가되어 나타났다.
- 먼저 PE로 최대의 수축을 유발시킨 음경해면체에 오가피 추출물을 농도별로 투여하였을 때, 오가피 추출물이 음경해면체에 대해 나타낸 유의한 이완효과의 결과로 오가피가 음경해면체에 이완효과를 가진다는 사실을 확인할 수 있다. 또한 L-arginine으로부터 NO를 생성시키는 NOS에 대하여 blocker로 작용하는 L-NNA32)를 전처치한 경우에 오가피 추출물의 음경해면체 이완효과는 유의하게 억제되었다.
- 영상분석 결과 음경해면체 내 PDE-5 양성반응이 20,000,000 pixel cells 당 control group에서는 10,635±1,567 pixel cells을 차지하였으나, PE group에서는 34,455±3,059 pixel cells로 증가되었고, AC group에서는 18,875±1,708 pixel cells로 PE group에 비하여 유의성있게 감소되었다.
- 영상분석 결과 음경해면체 내 eNOS 양성반응이 20,000,000 pixel cells 당 control group에서는 55,353±3,324 pixel cells을 차지하였으나, PE group에서는 16,368±2,029 pixel cells로 감소되었고, AC group에서는 42,649±4,293 pixel cells로 PE group에 비하여 유의성있게 증가되었다.
- 영상분석 결과 음경해면체 내 아교섬유에 대한 평활근 분포 비율이 control group에서는 6.7±0.6%를 차지하였으나, PE group에서는 2.1±0.4%로 감소되었고, AC group에서는 7.7±0.4%로 PE group에 비하여 유의성있게 증가되었다.
- 오가피 추출물은 PE로 수축된 음경해면체에 대하여 농도의존적 이완효과를 나타내었으며, 특히 1.0 ㎎/㎖에서 1.41±0.27 g, 3.0 ㎎/㎖에서 1.02±0.24 g의 수축을 나타내어 유의성 있는 이완효과를 확인할 수 있었다.
- HUVEC에 오가피 추출물을 농도별로 처치하였을 때 NO의 생성이 유의하게 증가되었으며, mouse의 음경해면체 조직에 오가피 추출물을 처리한 후 면역조직화학적 변화를 관찰한 결과, 음경해면체 내 eNOS 양성반응이 PE군에 비하여 AC군에서 증가되어 나타났다. 이 결과들은 오가피가 eNOS 활성화를 통하여 NO의 생성을 증가시킴으로써 음경해면체 평활근에 대하여 이완효과를 나타낸다는 사실을 알 수 있다.
- 이상의 내용을 요약해보면, 오가피 추출물은 음경해면체에서 eNOS/NO 증가를 통하여 cGMP를 활성화시킴으로써 세포외 Ca2+의 유입을 차단하고, cGMP 활성을 억제하는 PDE-5의 활성을 감소시켜 음경해면체 평활근을 이완시키는 것으로 생각된다.
- 이상의 실험결과 오가피 추출물은 음경해면체에서 eNOS/NO 증가를 통하여 cGMP를 활성화시킴으로써 세포외 Ca2+의 유입을 차단하고, cGMP 활성을 억제하는 PDE-5의 활성을 감소시켜 음경해면체 평할근을 이완시키는 것으로 생각된다.
- . 이에 음경해면체 이완에서 세포외 Ca2+의 유입에 미치는 오가피의 영향을 알아보기 위하여 Ca2+을 제거한 kreb-ringer solution에서 오가피를 전처치하고 PE로 수축시킨 후 Ca2+을 투여한 결과, Ca2+ 투여에 의한 수축의 증가가 유의하게 억제된 것은 오가피가 세포외 Ca2+의 유입을 차단하여 음경해면체를 이완시킨다는 사실을 나타낸다.
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