벌사상자는 여성의 생식기 질환이나 화농성 피부염에 주로 사용되어온 한약재로, 최근 들어 암과 관련된 연구가 많이 이루어짐에 따라 벌사상자의 항암 효과에 대한 관심이 높아지고 있다. 벌사상자의 대표적인 성분인 osthole, xanthotoxol 등은 벤젠고리 화합물로 에탄올과 같은 유기용매에 잘 용해된다. 이에 따라 본 연구에서는 AGS 위암세포에서 벌사상자 에탄올 추출물(CME)에 대한 세포주기 정지 유도 효과를 확인하고자 하였다. CME 처리에 의한 AGS 위암세포의 증식 억제 유도 효과 및 세포독성 효과를 확인하기 위하여 MTT assay와 LDHrelease assay를 실시한 결과, 농도 및 시간 의존적으로 세포생존율이 감소하였으며, 농도 의존적인 세포독성 효과를 확인하였다. 또한, CME의 농도가 증가할수록 AGS 위암세포의 형태학적 변화가 관찰되었다. 이러한 세포증식 억제 유도 효과가 세포주기 정지에 의한 것인지 확인하기 위하여 CME를 농도별로 24시간 동안 처리한 후 세포주기를 측정하였다. 그 결과 G1기의 세포가 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다. 그리고 CME의 처리가 세포주기와 관련된 단백질에 미치는 영향을 알아보기 위하여 western blot analysis를 실시하여 G1기 세포주기 정지와 관련된 신호 단백질들의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과 CME의 처리가 세포 증식과 분열에 중요한 역할을 하는 p-Akt와 p-GSK-$3{\beta}$의 발현을 저해하는 것을 확인하였고, 이에 따라 p53의 발현과 활성이 증가하여 p21의 발현이 증가함을 확인하였다. 또한, p21의 증가에 따른 cyclin E의 발현 감소와 CDK2의 비활성화 상태인 p-CDK(T14), p-CDK(Y15)의 발현 증가를 확인하였다. 이와 같은 CME의 세포주기 억제 유도 효과가 일어나는 신호경로를 확인하기 위하여 LY294002(PI3K/Akt 저해제), BIO(GSK-$3{\beta}$ 저해제), Pifithrin-${\alpha}$(p53 저해제)를 CME와 각각 또는 병행 처리한 후 MTT assay, 세포주기 측정, western blot analysis를 진행하였다. 그 결과 LY294002의 처리는 CME 처리군과 유사하게 세포생존율을 저해시키고 G1기 정지를 유도했으며, 세포주기 단백질을 조절하였다. 또한, GSK-$3{\beta}$와 p53 저해제를 처리하였을 때 CME를 병행 처리했음에도 불구하고 세포증식 억제나 G1기 정지와 같은 항암 효과가 나타나지 않았으며, 관련 신호경로 단백질의 변화도 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 CME의 처리가 Akt/GSK-$3{\beta}$/p53 신호경로를 조절하여 cyclin E의 발현을 감소시키고 CDK2의 활성을 억제함으로써 G1기 세포주기 정지를 유도함을 확인하였다.
벌사상자는 여성의 생식기 질환이나 화농성 피부염에 주로 사용되어온 한약재로, 최근 들어 암과 관련된 연구가 많이 이루어짐에 따라 벌사상자의 항암 효과에 대한 관심이 높아지고 있다. 벌사상자의 대표적인 성분인 osthole, xanthotoxol 등은 벤젠고리 화합물로 에탄올과 같은 유기용매에 잘 용해된다. 이에 따라 본 연구에서는 AGS 위암세포에서 벌사상자 에탄올 추출물(CME)에 대한 세포주기 정지 유도 효과를 확인하고자 하였다. CME 처리에 의한 AGS 위암세포의 증식 억제 유도 효과 및 세포독성 효과를 확인하기 위하여 MTT assay와 LDH release assay를 실시한 결과, 농도 및 시간 의존적으로 세포생존율이 감소하였으며, 농도 의존적인 세포독성 효과를 확인하였다. 또한, CME의 농도가 증가할수록 AGS 위암세포의 형태학적 변화가 관찰되었다. 이러한 세포증식 억제 유도 효과가 세포주기 정지에 의한 것인지 확인하기 위하여 CME를 농도별로 24시간 동안 처리한 후 세포주기를 측정하였다. 그 결과 G1기의 세포가 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다. 그리고 CME의 처리가 세포주기와 관련된 단백질에 미치는 영향을 알아보기 위하여 western blot analysis를 실시하여 G1기 세포주기 정지와 관련된 신호 단백질들의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과 CME의 처리가 세포 증식과 분열에 중요한 역할을 하는 p-Akt와 p-GSK-$3{\beta}$의 발현을 저해하는 것을 확인하였고, 이에 따라 p53의 발현과 활성이 증가하여 p21의 발현이 증가함을 확인하였다. 또한, p21의 증가에 따른 cyclin E의 발현 감소와 CDK2의 비활성화 상태인 p-CDK(T14), p-CDK(Y15)의 발현 증가를 확인하였다. 이와 같은 CME의 세포주기 억제 유도 효과가 일어나는 신호경로를 확인하기 위하여 LY294002(PI3K/Akt 저해제), BIO(GSK-$3{\beta}$ 저해제), Pifithrin-${\alpha}$(p53 저해제)를 CME와 각각 또는 병행 처리한 후 MTT assay, 세포주기 측정, western blot analysis를 진행하였다. 그 결과 LY294002의 처리는 CME 처리군과 유사하게 세포생존율을 저해시키고 G1기 정지를 유도했으며, 세포주기 단백질을 조절하였다. 또한, GSK-$3{\beta}$와 p53 저해제를 처리하였을 때 CME를 병행 처리했음에도 불구하고 세포증식 억제나 G1기 정지와 같은 항암 효과가 나타나지 않았으며, 관련 신호경로 단백질의 변화도 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 CME의 처리가 Akt/GSK-$3{\beta}$/p53 신호경로를 조절하여 cyclin E의 발현을 감소시키고 CDK2의 활성을 억제함으로써 G1기 세포주기 정지를 유도함을 확인하였다.
Cnidium monnieri (L.) Cusson is distributed in China and Korea, and the fruit of C. monnieri is used as traditional Chinese medicine to treat carbuncle and pain in female genitalia. In this study, we examined the anti-proliferation and cell cycle arrest effects of ethanol extracts from C. monnieri (...
Cnidium monnieri (L.) Cusson is distributed in China and Korea, and the fruit of C. monnieri is used as traditional Chinese medicine to treat carbuncle and pain in female genitalia. In this study, we examined the anti-proliferation and cell cycle arrest effects of ethanol extracts from C. monnieri (CME) in AGS gastric cancer cells. Our results show that CME suppressed cell proliferation and induced release of lactate dehydrogenase (LDH) in AGS cells by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide assay and LDH assay. Cell morphology was altered by CME in a dose-dependent manner. In order to identify the cell cycle arrest effects of CME, we investigated cell cycle analysis after CME treatment. In our results, CME induced cell cycle arrest at G1 phase. Protein kinase B (Akt) plays a major role in cell survival mechanisms such as growth, division, and metastasis. Akt protein regulates various downstream proteins such as glycogen synthase kinase-$3{\beta}$ (GSK-$3{\beta}$) and tumor protein p53 (p53). Expression levels of p-Akt, p-GSK-$3{\beta}$, p53, p21, cyclin E, and cyclin-dependent kinase 2 (CDK2) were determined by Western blot analysis. Protein levels of p-Akt, p-GSK-$3{\beta}$, and cyclin E were reduced while those of p53, p21, and p-CDK2 (T14/Y15) were elevated by CME. Moreover, treatment with CME, LY294002 (phosphoinositide 3-kinase/Akt inhibitor), BIO (GSK-$3{\beta}$ inhibitor), and Pifithrin-${\alpha}$ (p53 inhibitor) showed that cell cycle arrest effects were mediated through regulation of the Akt/GSK-$3{\beta}$/p53 signaling pathway. These results suggest that CME induces cell cycle arrest at G1 phase via the Akt/GSK-$3{\beta}$/p53 signaling pathway in AGS gastric cancer cells.
Cnidium monnieri (L.) Cusson is distributed in China and Korea, and the fruit of C. monnieri is used as traditional Chinese medicine to treat carbuncle and pain in female genitalia. In this study, we examined the anti-proliferation and cell cycle arrest effects of ethanol extracts from C. monnieri (CME) in AGS gastric cancer cells. Our results show that CME suppressed cell proliferation and induced release of lactate dehydrogenase (LDH) in AGS cells by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide assay and LDH assay. Cell morphology was altered by CME in a dose-dependent manner. In order to identify the cell cycle arrest effects of CME, we investigated cell cycle analysis after CME treatment. In our results, CME induced cell cycle arrest at G1 phase. Protein kinase B (Akt) plays a major role in cell survival mechanisms such as growth, division, and metastasis. Akt protein regulates various downstream proteins such as glycogen synthase kinase-$3{\beta}$ (GSK-$3{\beta}$) and tumor protein p53 (p53). Expression levels of p-Akt, p-GSK-$3{\beta}$, p53, p21, cyclin E, and cyclin-dependent kinase 2 (CDK2) were determined by Western blot analysis. Protein levels of p-Akt, p-GSK-$3{\beta}$, and cyclin E were reduced while those of p53, p21, and p-CDK2 (T14/Y15) were elevated by CME. Moreover, treatment with CME, LY294002 (phosphoinositide 3-kinase/Akt inhibitor), BIO (GSK-$3{\beta}$ inhibitor), and Pifithrin-${\alpha}$ (p53 inhibitor) showed that cell cycle arrest effects were mediated through regulation of the Akt/GSK-$3{\beta}$/p53 signaling pathway. These results suggest that CME induces cell cycle arrest at G1 phase via the Akt/GSK-$3{\beta}$/p53 signaling pathway in AGS gastric cancer cells.
따라서 본 연구에서는 벌사상자 에탄올 추출물(CME)을AGS 위암세포에 처리한 후 세포주기 정지 유도 효과가 발생하는지 확인하였고, 세포주기와 관련된 단백질의 발현 변화와 Akt/GSK-3β/p53 신호경로의 조절을 확인함으로써 CME가 어떠한 신호경로를 통하여 세포주기 정지를 유도하는지 확인하고자 하였다.
제안 방법
Akt, GSK-3β, p53 저해제가 AGS 위암세포의 증식과 세포주기 정지에 미치는 영향을 알아보기 위하여 AGS 위암 세포에 CME와 LY294002(PI3K/Akt 저해제), BIO(GSK-3β 저해제), Pifithrin-α(p53 저해제)를 각각 또는 병행 처리하여 세포생존율과 세포주기를 측정하였다. 선행연구에 의하면 LY294002를 처리하였을 때 암세포의 증식이 억제되고, BIO와 Pifithrin-α 처리 시에는 암세포의 생존율이 증가한다고 보고되었다(20,32).
G1기와 관련된 cyclin-CDK 복합체는 cyclin E와 CDK2가 있으며, p21이 CDK2에 결합하여 복합체의 형성을 저해하는 것으로 보고되었다(16). 이에 따라 본 연구에서는 CME를 AGS 위암세포에 농도별(20, 40, 60 μg/mL)로 24시간 동안 처리한 후 세포주기와 관련된 단백질들의 발현 변화를 western blot analysis를 통하여 확인하였다. 그 결과 p-Akt, p-GSK-3β, cyclin E의 발현이 저해되었으며(Fig.
대상 데이터
본 실험에서 사용된 AGS 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양받았으며, 10% fetal bovine serum(FBS, HyClone Laboratories Inc., Logan, UT, USA)과 1% antibiotics가 포함된 RPMI 1640 media(HyClone Laboratories Inc.)를 사용하여 5% CO2, 37°C 조건에서 배양하였으며, HaCaT 세포는 Dr. Fusenig(German Cancer Research Center, DKFZ, Heidelberg, Germany)으로부터 분양받아 10% fetal bovine serum과 1% antibiotics가 포함된 DMEM media(HyClone Laboratories Inc.)를 사용하여 5% CO2, 37°C 조건에서 배양하였다. 48시간마다 Trypsin-EDTA(HyClone Laboratories Inc.
본 실험에서 사용된 벌사상자는 동경종합상사(주)(Seoul, Korea)에서 구입하였고, 벌사상자 100 g에 99.9% 에탄올 800 mL를 가하여 72시간 동안 상온에서 환류추출 하였다. 이러한 방법으로 추출된 벌사상자 에탄올 추출물(CME)을 6 μm filter paper(qualitative filter paper NO.
데이터처리
통계 프로그램인 SPSS(22.0, IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 사용하였고 실험설계에 대한 분산분석은 독립표본 t-test(independent sample t-test)와 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였고, 일원배치분산분석에 대한 사후검정은 Duncan의 다중범위검정(multiple range test)을 통하여 검정하였다. 각 자료는 3번 이상의 반복된 실험을 통하여 얻은 결과로 검정하였고 P<0.
성능/효과
1D에서와 같이 농도가 증가할수록 일정했던 모양이 불규칙적으로 바뀌었으며 세포질의 응축과 lamellipodia와 filopodia의 소실로 인하여 세포가 cell culture plate에 부착하지 못하고 떨어짐으로써 세포 밀도가 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 본 실험들을 통하여 CME의 처리가 AGS 위암세포에서 세포증식을 억제하고 세포독성 효과를 보이며, 세포의 형태학적 변화를 유도한다는 것을 확인하였다.
선행연구에서도 p53과 p21의 증가가 cyclin E의 발현을 억제하고, CDK2의 Thr 14, Tyr 15 잔기에 인산화를 시킴으로써 G1기 정지를 유도한다고 보고되었다(16,20,31). 따라서 본 실험을 통하여 CME의 처리가 p-Akt의 발현을 저해함으로써 p-GSK-3β의 발현을 저해하고, p53과 p21의 발현을 증가시킴으로써 cyclin E의 발현 감소와 p-CDK2의 인산화를 조절하여 G1기 세포주기 정지를 유도하는 것을 확인하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
벌사상자란?
벌사상자는 여성의 생식기 질환이나 화농성 피부염에 주로 사용되어온 한약재로, 최근 들어 암과 관련된 연구가 많이 이루어짐에 따라 벌사상자의 항암 효과에 대한 관심이 높아지고 있다. 벌사상자의 대표적인 성분인 osthole, xanthotoxol 등은 벤젠고리 화합물로 에탄올과 같은 유기용매에 잘 용해된다.
세포주기를 구성하는 단계는?
세포주기(cell cycle)는 G1, S, G2 및 M기로 구성되어있으며, G1기와 G2기에 세포주기를 조절하는 checkpoint가 존재하는 것으로 알려져 있다(16). 정상적인 세포는 DNA damage, ROS, glucose deprivation과 같은 스트레스에 의하여 손상을 입게 되면 checkpoint를 통해 세포 분열을 중지하지만 이와 달리 암세포는 스스로 분열을 조절하지 못하고 비정상적인 분열을 통하여 무한정적인 증식을 한다(16, 17).
osthole과 xanthotoxol의 기능은?
벌사상자의 대표적인 성분에는 osthole과 xanthotoxol등이 있으며, 벤젠고리(benzene ring)를 가지고 있어 주로 에탄올과 같은 유기용매로 추출이 이루어진다(2,3). 이러한 벌사상자의 활성성분은 nuclear factor kappa B(NF-κB)와 mitogen-activated protein kinase(MAPK) 신호경로의 활성을 차단하여 면역기능을 개선하고, 염증반응을 유발하는 것으로 알려진 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생성을 저해하여 염증반응을 억제하는 것으로 알려져 있다(4-6). 이외에도 인체 유방암세포에 벌사상자로부터 추출한 osthole을 처리하였을 때 암의 전이(metastasis)와 관련이 깊은 세포 이동(cell migration) 및 세포 침투(cell invasion)가저해되었다고 보고되었으며, 벌사상자 99% 에탄올 추출물을 HCT 116 대장암 세포주에 처리하였을 때 G1기 세포주기 정지와 세포사멸(apoptosis)을 유도한다고 보고되었다(7-9). 이처럼 최근에는 기존 항암제의 여러 가지 부작용과 내성에 대한 문제점이 증가함에 따라 천연 추출물에 함유된 다양한 생리활성물질의 항암 효과를 규명하기 위한 많은 연구가 진행되고 있다(10-12).
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