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문제 정의
- 본 연구에서는 고시형 기능성 원료로 인정받은 서양엉겅퀴와 국내 자생 엉겅퀴의 부위별 silymarin 분석 및 생리활성을 연구하여 두 시료의 비교를 통해 국내에서 자생하는 엉겅퀴의 기능성 식품소재로 활용가능성에 대한 기초자료로 제시하고자 한다.
제안 방법
- 24-Well plate에 BNLCL.2 세포를 7×104 cells/ml가 되도록 분주한 뒤 24시간 동안 CO2 incubator (37℃, 5% CO2)에서 예비 배양한 후, 각 시료를 최종 농도(0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 mg/ml)가 되도록 세포를 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- 1 ml을 처리하여 24시간 배양하였다. 5일간 같은 방법으로 세포에 시료와 ethanol을 처리한 다음 이후 MTT assay로 세포의 생존율을 측정하였다. 세포생존율은 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 대조군과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.
- 6), 40 mM HCI에 녹인 10 mM TPTZ [2,4,6-tris (2-pyridyl)-s-triazine] 및 20 mM iron (Ⅲ) chloride를 각각 37℃로 가온한 후 실험직전에 10:1:1의 부피 비율로 혼합하여 사용하였다. 96-well plate에 FRAP 용액 0.2 ml와 농도별(0.03125, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1mg/ml)로 희석된 시료 0.05 ml를 혼합한 다음 37℃에서 15분간 반응시킨 후 590 nm에서 흡광도를 측정하였으며 대조군으로 trolox의 환원력과 비교하였다. 각 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다.
- ABTS [2,2-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid diammonium salt)] cation radical 소거활성은 Re 등의 방법[20]을 변형하여 측정하였다. 7 mM ABTS 용액과 2.
- DPPH free radical 소거활성은 Blois와 Marsden의 방법[1]을 변형하여 각 추출물의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)에 대한 전자공여능을 측정하였다. 추출물을 농도별(0.
- Ethanol 처리에 따른 산화적 손상에 대한 간세포보호효과를 관찰하기 위하여, 24-Well plate에 BNL CL.2 세포를 5×104 cells/ml가 되도록 분주하여 20시간 동안 배양하고, 3% FBS를함유한 DMEM 배지로 교환하여 시료를 최종 농도(0.01, 0.05,0.1, 0.2 mg/ml)가 되도록 처리하고 1시간 후 300 mM ethanol 0.1 ml을 처리하여 24시간 배양하였다.
- Ethyl acetate 추출용액을 50℃ 이하의 rotary vacuum evaporator로서 감압 농축하여 silymarin compounds을 추출하였으며, 이를 methanol에 2 mg/ml의 농도로 녹여 0.45 μM membrane filter로 여과한 후 HPLC로서 분석하였다.
- H2O2 처리에 따른 산화적 손상에 대한 간세포보호효과를 관찰하기 위하여, 24-Well plate에 BNL CL.2 세포를 5×104 cells/ml가 되도록 분주하여 24시간 동안 CO2 incubator (37℃, 5% CO2)에서 예비 배양한 후 배지를 제거하고 PBS(phosphate-buffered saline)로 2회 세척한 다음 배지를 교환하였다.
- Silymarin 표준용액은 silymarin (Sigma S0292, USA)을 methanol에 녹여 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1 mg/ml의 용액을 조제하고, 해당 분석조건에서의 silymarin 중의 flavonolignan 성분들의 chromatographic pattern을 결정하였으며 검량곡선을 작성해 시료에 대한 각각의 함량을 측정하였다.
- t-BHP (tert-butyl hydroperoxide)에 의한 산화적 손상에 대한 간세포보호효과를 관찰하기 위하여, 24-Well plate에 BNLCL.2 세포를 7×104 cells/ml가 되도록 분주한 뒤 24시간 동안 CO2 incubator (37℃, 5% CO2)에서 배양한 후 각 시료를 최종농도(0.01, 0.05, 0.1, 0.2 mg/ml)가 되도록 세포에 한 시간 전처리한 후 t-BHP (최종농도 80 μM)를 첨가하고 24시간 더 배양하였다.
- 2 세포를 5×104 cells/ml가 되도록 분주하여 24시간 동안 CO2 incubator (37℃, 5% CO2)에서 예비 배양한 후 배지를 제거하고 PBS(phosphate-buffered saline)로 2회 세척한 다음 배지를 교환하였다. 그 후 각 시료를 최종 농도(0.01, 0.05, 0.1, 0.2 mg/ml)가 되도록 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 산화적 스트레스를 일으키기 위하여 0.
- 5 mg/ml농도를 처리한 군을 제외한 모든 군에서 세포생존율이 약 80~100%로 나타났다. 따라서 엉겅퀴 부위별 추출물이 0.2 mg/ml이하에서 세포 독성 없음을 확인하여 0.2 mg/ml이하로 처리농도를 설정하여 실험을 진행하였다.
- 배양된 BNLCL.2 세포가 80% confluent 되었을 때 PBS로 세척한 후 0.5% trypsin-EDTA 용액을 처리하여 CO2 incubator (37℃, 5% CO2)에서 4분간 정치시킨 다음, 세포를 탈착시켜 1,000 rpm에서 4분 동안 원심분리한 후 T-75 flask에 8×104 cell/well씩 분주하여 2일 간격으로 계대배양하였다.
- 2 mg/ml)가 되도록 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 산화적 스트레스를 일으키기 위하여 0.4 mM H2O2를 처리한 후, 2시간 동안 배양한 다음 이후 MTT assay로 세포의 생존율을 측정하였다. 세포 생존율은 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 대조군과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.
- 세포의 생존율은 Mosmann에 따른 3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) 환원 방법을 약간 변형하여 측정하였다[15]. 24-Well plate에 BNLCL.
- 양성대조군으로 BHA와 α-tocopherol의 소거활성과 비교하였으며, 엉겅퀴 추출물에 대한 ABTS radical 소거활성은 아래와 같은 식으로 계산하여 백분율(%)로 표시하였으며, 각 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다.
- 양성대조군으로는 BHA와 α-tocopherol을 사용하였으며 전자공여능은 아래와 같은 식으로 계산하여 백분율(%)로 표시하였으며, 각 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다.
- 2 mg/ml)가 되도록 세포에 한 시간 전처리한 후 t-BHP (최종농도 80 μM)를 첨가하고 24시간 더 배양하였다. 이후 MTT assay로서 세포의 생존율을 측정하였다. 세포 생존율은 540 nm에서 흡광도를 측정하고 대조군과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.
- 총 페놀 함량은 Folin-Denis법[5]을 일부 변형하여 측정하였다. 1 mg/ml 농도의 엉겅퀴 추출물 0.
- DPPH free radical 소거활성은 Blois와 Marsden의 방법[1]을 변형하여 각 추출물의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)에 대한 전자공여능을 측정하였다. 추출물을 농도별(0.03125, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mg/ml)로 희석한 다음, 96-well plate에 0.2 ml 와 사용 직전 만든 0.2 mM DPPH 용액 0.1 ml를 넣고 혼합한 후, 실온에서 30분 간 반응시킨 다음 microplate reader를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 BHA와 α-tocopherol을 사용하였으며 전자공여능은 아래와 같은 식으로 계산하여 백분율(%)로 표시하였으며, 각 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다.
- 환류냉각장치를 부착한 3 L round flask에 분쇄한 엉겅퀴 및 서양엉겅퀴를 부위별로 각각 50 g 넣은 후 2 l의 메탄올을 가하여 65±1℃에서 6시간씩 2회 반복 추출하였으며 그 여과액을 합하였다.
대상 데이터
- HPLC는 Agilent 1200을, analytical column은 ZORBAX Eclipse XDB-C18 (250×4.6 mm, I.D. 5 μm)을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 BNL CL.2는 한국세포주은행으로부터 구입하였으며, 사용된 시약 중 Folin-Ciocalteu phenol reagent,gallic acid, sodium carbonate1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH), 2,2’-azino-bis (3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), potassium persulfate, PBS buffer(phosphate buffered saline, pH 7.4), 2,4,6-tris (2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ), sodium acetate, iron (Ⅲ) chloride, BHA,ɑ-tocopherol, 3-isobutyl-1-methylxanthine, dexamethasone,insulin, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT), Oil red O, tert-butyl hydroperoxide (t-BHP)는 Sigma Chemical Co. (St, Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin(P/S), Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) GibcoCo.
- 본 실험에 사용된 엉겅퀴는 제천한방약초 및 동이약초 등에서 구입하였으며, 서양엉겅퀴는 평택약초농원에서 건초 및 뿌리를 구입하여 사용하였다. 환류냉각장치를 부착한 3 L round flask에 분쇄한 엉겅퀴 및 서양엉겅퀴를 부위별로 각각 50 g 넣은 후 2 l의 메탄올을 가하여 65±1℃에서 6시간씩 2회 반복 추출하였으며 그 여과액을 합하였다.
- 본 실험에 사용된 흰쥐 정상 간세포(mouse liver normal cell, BNL CL.2)는 10% FBS (fetal bovine serum)와 1% P/S(penicilin-streptomycin)가 첨가된 DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium)배지를 사용하여 배양하였다.
데이터처리
- 실험결과는 SPSS (Statistical Package for Social Sciences, SPSS inc, Chicago IL, USA) program Ver. 12.0을 이용하여 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시하여 유의성이 있는 경우에 Duncan의 다중범위검정(Duncan's multiple range test)으로 시료 간의 유의차를 검정하였다(p<0.05).
이론/모형
- FRAP은 Benzie와 Strain의 방법[2]에 따라 측정하였다. FRAP 용액은 300 mM acetate buffer (pH 3.
- 엉겅퀴로부터 silymarin의 추출은 T. Radjabian 등[23]에 따라 추출하였다. 엉겅퀴 시료분말 10 g을 칭량하여 n-hexane에 4시간 동안 침지해 탈지하였다.
성능/효과
- 02 mg/g으로 많이 함유되어 있었다. Silymarin은 서양 엉겅퀴의 지표성분 물질이므로 엉겅퀴보다 많이 나온 것으로사료되지만, 서양엉겅퀴는 수입에 의존하기 때문에 경제적인 면에선 국내에서 자생하고 있고 쉽게 구할 수 있으며 지상부와 지하부를 모두 사용하는 엉겅퀴도 silymarin 추출물로써 활용이 매우 가능하다고 판단된다.
- t-BHP를 처리한 세포에서는 t-BHP를 처리하지 않은 정상세포(100±1.52%)에 비해 세포생존율이 24.60±0.57%로 유의적인 감소를 보였다.
- marianum)의 flavonolignan의 일종인 silymarin과 동일한 성분을 함유하고 있었다고 하였다. 본 연구에서는 H2O2만을 처리한 세포보다 약 60%이상의 높은 세포생존율을 보여 간세포에 대한 보호효과가 큰 것으로 생각되었다.
- 8%로 나타났으며, t-BHP로 유도한 세포로부터 약 30% 정도의 세포 생존율이 증가하여 세포 손상을 보호하는 것으로 판단된다고 보고하였다. 본 연구에서는 t-BHP만을 처리한 세포보다 약 25%의 높은 세포생존율을 보였으며, 따라서 엉겅퀴 추출물도 t-BHP로 유도된 산화적 스트레스에 대해 간세포 보호효과가 있는 것으로 생각된다.
- 2와 같다. 엉겅퀴 부위별 추출물을 처리하지 않은 대조군의 생존율을 100%로 하였을 때 0.5 mg/ml농도를 처리한 군을 제외한 모든 군에서 세포생존율이 약 80~100%로 나타났다. 따라서 엉겅퀴 부위별 추출물이 0.
- 57%로 유의적인 감소를 보였다. 엉겅퀴와 서양엉겅퀴 추출물이 처리된 세포에서는 농도 의존적으로 세포 생존율이 증가하였으며, 엉겅퀴 지상부는 서양엉겅퀴 지상부 보다 다소 낮은 활성을 보였다. 그러나 0.
- 위와 같이 항산화 활성 실험 결과, 엉겅퀴는 서양엉겅퀴보다 다소 낮거나 거의 유사한 활성이 나타났으며, 지상부보다 지하부가 활성이 높았다. 하지만 항산화 활성과 비례한다고 알려진 총 페놀 화합물의 함량과 비교하였을 때, 항산화 활성이 대체로 높게 나타난 서양엉겅퀴에서 총 페놀 함량도 많았다.
- 엉겅퀴의 silymarin compound를 분석한 결과는 Table 1과 같다. 지상부와 지하부를 합친 total silymarin 함량은 서양엉겅퀴가 1.17 mg/g으로 엉겅퀴의 0.65 mg/g보다 2배정도 높은 함량을 나타났다. 엉겅퀴는 지상부의 0.
- 추출물을 0.1 mg/ml로 처리하였을 때, 엉겅퀴 지상부와 지하부는 각각 63.41±0.57%, 와 68.6±1.24%로 억제 활성이 나타났다.
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