마늘은 전통적으로 cycloalliin을 포함한 기능성 식품으로 널리 알려져 있다. 본 연구를 통해 혈관계에서 발효마늘추출물이 어떤 효능을 갖는지 알아보았다. 먼저, 발효마늘추출물이 내피세포의 단핵구 부착을 억제하는 것을 관찰하였다. 농도 변화에 따른 실험결과, 발효마늘추출물을 0.1 또는 $1{\mu}g/ml$ 농도로 전처리 하면, LPS에 의하여 촉발되는 소 대동맥 내피세포에 달라붙는 THP-1의 부착이 억제되는 것을 확인하였다. 단핵구의 내피세포 부착이 염증반응 초기단계에 진행되는 과학적 근거를 고려하면 이와 같은 결과는 발효마늘추출물이 혈관 염증을 저해한다고 볼 수 있다. 또한 세포신호전달물질의 활성변화를 관찰한 결과, 발효마늘추출물이 소 대동맥 내피세포에서 eNOS와 Akt의 활성을 유도함을 알았다. eNOS의 인산화 반응은 발효마늘추출물을 처리한지 10분 후에 최대로 상승되었으며, 이와 유사하게 Akt도 발효마늘추출물을 처리하고 10분 후에서 인산화 반응이 최대로 상승되었다. 산화질소 양 변화 측정에서도 발효마늘추출물은 산화질소의 생성을 상승시켰다. 한편, 산화질소 생성을 저해하는 억제제 처리는 발효마늘추출물에 의해 나타나는 세포부착 저해능력을 감소시켰다. eNOS와 Akt를 매개로 하는 LPS 유도 세포 부착 정도가 발효마늘추출물에 의하여 억제된다는 것은 산화질소가 세포부착에 중요 매개물임을 의미한다. 결론적으로, 발효마늘추출물은 염증관련 질환을 예방하는 데에 중요한 역할을 한다고 할 수 있다.
마늘은 전통적으로 cycloalliin을 포함한 기능성 식품으로 널리 알려져 있다. 본 연구를 통해 혈관계에서 발효마늘추출물이 어떤 효능을 갖는지 알아보았다. 먼저, 발효마늘추출물이 내피세포의 단핵구 부착을 억제하는 것을 관찰하였다. 농도 변화에 따른 실험결과, 발효마늘추출물을 0.1 또는 $1{\mu}g/ml$ 농도로 전처리 하면, LPS에 의하여 촉발되는 소 대동맥 내피세포에 달라붙는 THP-1의 부착이 억제되는 것을 확인하였다. 단핵구의 내피세포 부착이 염증반응 초기단계에 진행되는 과학적 근거를 고려하면 이와 같은 결과는 발효마늘추출물이 혈관 염증을 저해한다고 볼 수 있다. 또한 세포신호전달물질의 활성변화를 관찰한 결과, 발효마늘추출물이 소 대동맥 내피세포에서 eNOS와 Akt의 활성을 유도함을 알았다. eNOS의 인산화 반응은 발효마늘추출물을 처리한지 10분 후에 최대로 상승되었으며, 이와 유사하게 Akt도 발효마늘추출물을 처리하고 10분 후에서 인산화 반응이 최대로 상승되었다. 산화질소 양 변화 측정에서도 발효마늘추출물은 산화질소의 생성을 상승시켰다. 한편, 산화질소 생성을 저해하는 억제제 처리는 발효마늘추출물에 의해 나타나는 세포부착 저해능력을 감소시켰다. eNOS와 Akt를 매개로 하는 LPS 유도 세포 부착 정도가 발효마늘추출물에 의하여 억제된다는 것은 산화질소가 세포부착에 중요 매개물임을 의미한다. 결론적으로, 발효마늘추출물은 염증관련 질환을 예방하는 데에 중요한 역할을 한다고 할 수 있다.
Fermented garlic extract (FGE) is a well-known functional food containing cycloalliin. Here we tested if FGE has an effect on the vascular system. We found that FGE had an effect on monocytic adhesion to endothelial cells, which occurs at the initial step of processes of inflammation. From dose-depe...
Fermented garlic extract (FGE) is a well-known functional food containing cycloalliin. Here we tested if FGE has an effect on the vascular system. We found that FGE had an effect on monocytic adhesion to endothelial cells, which occurs at the initial step of processes of inflammation. From dose-dependent experiments, 0.1 to $1{\mu}g/ml$ of FGE appeared to inhibit lipopolysaccharide (LPS)-enhanced heterotypic cell adhesion between THP-1 and BAECs. This result indicates that FGE blocks vascular inflammation. Then we found that FGE activates eNOS and Akt in BAECs. The phosphorylation of eNOS was maximally elevated 10 min after FGE treatment. Parallely, the phosphorylation of Akt was also maximally increased 10 min after FGE treatment. Consistently, it was found that FGE enhanced the production of nitric oxide. We then examined whether NO mediates THP-1 cell adhesion to BAECs. Both Akt and eNOS inhibitors appeared to reverse an inhibitory effect of FGE. These findings indicate that FGE inhibits LPS-enhanced heterotypic cell adhesion via Akt and eNOS. In conclusion, FGE plays an important role in prevention of inflammatory diseases.
Fermented garlic extract (FGE) is a well-known functional food containing cycloalliin. Here we tested if FGE has an effect on the vascular system. We found that FGE had an effect on monocytic adhesion to endothelial cells, which occurs at the initial step of processes of inflammation. From dose-dependent experiments, 0.1 to $1{\mu}g/ml$ of FGE appeared to inhibit lipopolysaccharide (LPS)-enhanced heterotypic cell adhesion between THP-1 and BAECs. This result indicates that FGE blocks vascular inflammation. Then we found that FGE activates eNOS and Akt in BAECs. The phosphorylation of eNOS was maximally elevated 10 min after FGE treatment. Parallely, the phosphorylation of Akt was also maximally increased 10 min after FGE treatment. Consistently, it was found that FGE enhanced the production of nitric oxide. We then examined whether NO mediates THP-1 cell adhesion to BAECs. Both Akt and eNOS inhibitors appeared to reverse an inhibitory effect of FGE. These findings indicate that FGE inhibits LPS-enhanced heterotypic cell adhesion via Akt and eNOS. In conclusion, FGE plays an important role in prevention of inflammatory diseases.
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문제 정의
08 mg/g이다. 다음으로 이와 같이 확보한 발효마늘추출물이 내피세포에 어떤 영향을 미치는 지 알아보기 위하여 다양한 실험들을 진행하였다. 발효마늘추출물이 세포의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위해 Fig.
따라서 본 연구에서는 발효마늘의 혈관기능에 관한 분자적 기전을 이해하기 위한 일련의 실험을 수행코자 하였다. 심혈관계의 분자적 기전을 이해하려면 혈관에 존재하는 내피세포를 분리 및 배양한 후 내피세포에 발효마늘 추출물을 처리하였을 때 일어나는 내피세포의 다양한 변화를 관찰하는 것이 분자적 기전을 이해하는 데에 도움을 준다.
종합해서 요약하면 본 연구에서는 혈관 내피세포 내의 산화질소 생성이 발효마늘추출물에 의하여 조절되는지 여부를 확인하였으며, 그에 관여하는 신호전달 경로를 조사하였다. 또한 변화하는 산화질소의 양이 어떤 혈관기능에 어떻게 작용하는지 조사하였다.
발효마늘추출물이 일으키는 내피세포의 생리적 변화에 관한 분자적 기전을 알아보기 위하여 본 연구에서는 발효마늘추출물을 처리하였을 때 변화하는 다양한 내피세포의 신호전달물질의 활성의 변화를 western blot을 통해 확인하였다. 세포 신호전달은 eNOS의 활성을 조절하는 신호전달 경로를 표적으로 실험을 진행하였다.
본 연구에서는 발효마늘추출물이 혈관 내피세포에 미치는 생리적인 기능을 알아보았으며, 그 중에도 단핵구의 혈관 부착에 미치는 발효마늘추출물의 영향을 규명하였다. 발효마늘추출물은 혈관 내피세포의 여러 변화들 중에서 산화질소의 생성을 유발하여 단핵구의 부착을 감소 시켰고, 이는 발효마늘추출물이 혈관에서 항 염증성 효과가 있음을 보여준다.
이러한 염증반응은 동맥경화 발생 초기에 주로 일어나는데, 초기 염증반응에 의해 분비되는 화학주화성물질에 의해 단핵구는 염증이 발생한 주위에 모이게 되고, 내피세포가 발현하는 세포부착 단백질에 의하여 결합한 후 내피 층 안으로 이동하여 혈관벽을 비후시킨다[15, 17]. 이러한 일련의 과정 중의 하나인 단핵구의 혈관부착에 발효마늘이 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 단핵구의 내피세포 부착실험을 본 연구에서 수행하였다. LPS를 처리하여 유사 염증 현상을 유도한 뒤 발효마늘추출물을 처리한 경우와 처리하지 않은 경우의 혈관내피세포의 변화를 관찰 한 결과, 발효 마늘추출물을 처리한 혈관 내피세포에는 단핵구 부착이 감소되었다.
본연구에서 이와 연계되는 내피세포의 생리적 특성 변화를 관찰하였는 데, 이는 세포 성장, 세포 이동 및 단핵구의 내피세포부착 등이다. 종합해서 요약하면 본 연구에서는 혈관 내피세포 내의 산화질소 생성이 발효마늘추출물에 의하여 조절되는지 여부를 확인하였으며, 그에 관여하는 신호전달 경로를 조사하였다. 또한 변화하는 산화질소의 양이 어떤 혈관기능에 어떻게 작용하는지 조사하였다.
가설 설정
Then cell proliferation was detected by using WST-1 reagent. (B) FGE had no effect on cell migration. Serum-depleted BAECs were scraped immediately after treating cells with indicated concentrations of FGE.
제안 방법
발효마늘 추출물의 지표물질은 기존의 연구 결과에 의하여 황화합물 중 가장 많은 함량으로 포함된 cycloalliin으로 결정하였다[8]. Cycloalliin의 함량은 HPLC (Alliance HPLC, Waters Co., Milford, MA, USA)를 활용한 Ichikawa 등의 분석법을 변형하여 분석하였다[8].
Fig. 3의 결과와 같이 eNOS의 발현이 발효마늘추출물을 처리해 줌에 따라 증가하는 것을 보고 산화질소의 양에는 어떠한 변화가 있는지 알아보기위한 실험을 진행하였다. 산화질소는 신경, 혈관내피, 유도성 산화질소 합성 효소에 의해 L-arginine으로부터 합성된다.
각 조건 별로 전처리 된 BAEC을 분해완충액(150 mMNaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 50mM Tris-HCl, pH 8.8, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)으로 하였다. 그 후 원심분리기를 이용하여 상층액을 획득하였다.
그 후 조건 별로 전면 성장시켜 놓은 BAEC 위에 동량으로 첨가하여 부착된 THP-1 세포의 수를 관찰하였다. 관찰 후 부착된 세포와 전체 세포의 비율을 계산하여 정량화 하였다.
그 후 10 μg의 DAF-2 DA (diaminofluorescein diacetate)을 30분간 37℃, 5% CO2 조건에서 반응 시킨 후 세포를 수확하여 초음파파쇄로 분해한 후 세포 분해액을 원심분리기를 하여 13,000 rpm의 빠르기로 10분 동안 원심분리 하여 상층액을 분획하였다.
그 후 원심분리기를 통해 형광 염색된 THP-1만을 확보하여 PBS로 2회 세척 해주었다. 그 후 조건 별로 전면 성장시켜 놓은 BAEC 위에 동량으로 첨가하여 부착된 THP-1 세포의 수를 관찰하였다. 관찰 후 부착된 세포와 전체 세포의 비율을 계산하여 정량화 하였다.
그 후 10 μg의 DAF-2 DA (diaminofluorescein diacetate)을 30분간 37℃, 5% CO2 조건에서 반응 시킨 후 세포를 수확하여 초음파파쇄로 분해한 후 세포 분해액을 원심분리기를 하여 13,000 rpm의 빠르기로 10분 동안 원심분리 하여 상층액을 분획하였다. 그 후 형광분석계(Spectrofluorophotometer RF-5301 PC, SHIMADZU, Japan)를 이용하여 형광스펙트럼(Ex : 495 nm, Em : 515 nm, Slit : 10 nm)을 측정하여 분석하였다.
그 후 cell viability assay kit를 이용하여 분석한 결과 발효마늘추출물이 세포의 성장에는 큰 영향을 미치지 못하였다. 다음으로 내피세포의 이동에 미치는 발효마늘의 효과를 관찰하였다. 내피세포의 이동은 상처 치유의 과정과 혈관을 형성하는 과정 중에 일어나는 단계다.
흥미롭게도 본 연구에서 사용한 발효마늘추출물에는 발효로 인해 생겨난 유효성분들이 일으킨 단핵구 부착 억제기능은 산화질소에 의해 매개 되었다. 더 구체적인 분자기전을 알기 위하여 세포신호전달 경로에 미치는 발효마늘추출물의 효과를 관찰하였다. 발효마늘추출물의 처리양 및 처리시간에 따른 세포신호전달 분자의 활성을 관찰한 결과, ERK, JNK, p38 MAP kinase의 활성은 1 ug/ml의 발효마늘추출물 처리에 의해 특별한 변화를 관찰하지 못하였다(data not shown).
BAEC은 20% 소태아혈청(fetal bovine serum (FBS), Welgene, Seoul, Korea)과 항생제(50 μg/ml penicillin/streptomycin)가 포함된 DMEM (glucose 1 g/l, Welgene)을 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 또한 세포 부착 실험에 사용된 THP-1은 부유하여 자라는 부유세포(suspension cell)로 배양의 조건은 BAEC과는 다르게 RPMI1640 (Welgene)를 이용하여 10% 소태아혈청과 0.5% 항생제를 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
2C에서 보는 바와 같이 발효마늘추출물의 농도에 관계없이 세포이동에는 발효마늘추출물이 아무런 영향을 나타내지 않음을 알 수 있다. 또한 혈관내피세포의 염증 반응에 발효마늘추출물이 어떻게 관여하는지 알아보기 위하여 발효마늘추출물을 혈관내피세포에 처리한 후 단핵구 부착 정도의 변화를 관찰 하였다(Fig. 2D). 먼저 내피세포를 혈청기아 시킨 후 마늘의 효과를 보기 위하여 LPS (Lipopolysaccharide)를 처리해주었다.
마늘 5 kg과 증류수 10 kg을 발효조(MJS U3, Marubishi, Tokyo, Japan)에서 혼합, 교반하면서 121°C에서 1시간 동안 멸균하였다.
2D). 먼저 내피세포를 혈청기아 시킨 후 마늘의 효과를 보기 위하여 LPS (Lipopolysaccharide)를 처리해주었다. LPS는 그람 음성균의 외막에 존재하는 성분으로 항원으로 인식되어 염증반응을 유도한다[16].
배양 종료 후 50°C에서 24시간 동안 숙성 과정을 거친 다음, 멸균, 여과 및 농축하여 발효마늘추출물로 사용하였다. 발효마늘 추출물의 지표물질은 기존의 연구 결과에 의하여 황화합물 중 가장 많은 함량으로 포함된 cycloalliin으로 결정하였다[8]. Cycloalliin의 함량은 HPLC (Alliance HPLC, Waters Co.
발효마늘추출물을 시간과 농도 별로 달리 처리 하였을 경우 변화하는 신호전달물질들의 활성을 관찰하였다(Fig. 3). 실험에서 알아본 신호전달물질은 eNOS (endothelial nitric oxide synthase)와 Akt이다.
분리된 상층액을 가지고 SMARTTM BCA Protein Assay Kit (iNtRON, Korea)를 이용해 세포 분해액의 단백질을 정량하였으며 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)에 loading하여 분리시켰다. 분리된 단백질을 polyvinylidene fluoride (PVDF) 막(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 전달시킨 후, 분석하고자 하는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체는 p~Akt (Cell Signaling), Akt (Cell Signaling), p~eNOS (Cell Signaling), eNOS (Cell Signaling), actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Calif.
그 후 원심분리기를 이용하여 상층액을 획득하였다. 분리된 상층액을 가지고 SMARTTM BCA Protein Assay Kit (iNtRON, Korea)를 이용해 세포 분해액의 단백질을 정량하였으며 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)에 loading하여 분리시켰다. 분리된 단백질을 polyvinylidene fluoride (PVDF) 막(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 전달시킨 후, 분석하고자 하는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 1차 항체와 반응시켰다.
산화질소가 염증 반응을 조절한다는 사실을 바탕으로[12,13, 20] 산화질소 생산을 억제 하였을 때 단핵구의 부착에는 어떠한 변화가 있는지 실험하였다(Fig. 5). 먼저 phophoinositide 3-kinases를 억제하여 Akt의 억제자로 작용하는 wortmannin을 처리한 실험결과 발효마늘추출물을 처리하였을 때 나타나는 단핵구 부착의 억제효과가 wortmannin에 의해 사라짐을 알 수 있었다.
발효마늘추출물이 일으키는 내피세포의 생리적 변화에 관한 분자적 기전을 알아보기 위하여 본 연구에서는 발효마늘추출물을 처리하였을 때 변화하는 다양한 내피세포의 신호전달물질의 활성의 변화를 western blot을 통해 확인하였다. 세포 신호전달은 eNOS의 활성을 조절하는 신호전달 경로를 표적으로 실험을 진행하였다. eNOS는 산화질소를 합성하는 내피세포 효소로 알려져 있는데, eNOS에 의해 합성된 산화질소는 혈관 기능을 조절하는데 매우 중요한 가스호르몬으로 알려져 있다.
세포성장은 cell viability assay kit (Daeillab Service Co., LTD, Seoul, Korea)를 이용하여 평가하였다. 전면 성장한 BAEC을 최소 12시간 동안 혈청기아 시킨 후, 다양한 농도의 발표마늘추출물을 처리하여 0-24 시간 동안 배양하였다.
3A는 발효마늘추출물 처리 시간에 따라 변화하는 신호전달물질의 활성을 western blot으로 관찰한 결과와 그 결과를 정량화하여 그래프로 나타낸 그림이다. 실험에 사용된 발효마늘추출물의 농도는 100 ng/ml로 처리한 뒤 5분~60분 사이의 활성 변화를 관찰하였다. eNOS와 Akt 모두 10분에서 그 발현이 최대인 것을 확인 할 수 있었다.
실험을 위해 내피세포를 혈청기아 시킨 뒤 발효마늘추출물을 100 ng/ml, 1 μm/ml 농도로 처리하였다.
내피세포의 이동은 상처 치유의 과정과 혈관을 형성하는 과정 중에 일어나는 단계다. 이러한 사실을 바탕으로 발효마늘추출물을 처리하였을 때 세포이동에 어떠한 영향이 있는지 알아보았다(Fig. 2B, Fig. 2C). 실험을 위해 내피세포에 창상선을 만들어 준 뒤 발효마늘추출물을 Fig.
이러한 사실을 바탕으로 혈관내피세포에 발효마늘추출액을 0.1 μg/ml 처리 한 후 시간에 따른 산화질소의 양을 측정하였다.
1차 항체의 반응이 끝난 후 PBS로 3회 washing 해준 뒤 2차 항체와 연속적으로 반응시켜주었다. 이후, 이를 화학발광 검출법을 통해 X-선 필름에 감광시켜 단백질을 검출하였다.
LPS는 그람 음성균의 외막에 존재하는 성분으로 항원으로 인식되어 염증반응을 유도한다[16]. 자극을 유도하지 않은 상태와 유도한 상태에서 발효마늘추출물을 처리하여 나타나는 변화를 관찰하였다. Fig.
지표성분인 cycloalliin의 함량분석은 발효마늘추출물을 TSKgel amide column (4.5×250 mm, 5 μm)에서 분리한 후, 210 nm에서 흡광도 검출을 하는 크로마토그래피를 수행하여 지표물질을 분석하였다(Fig. 1).
그 후 scarper 찰과기를 이용하여 창상선을 만든 후 다시 PBS로 2회 세척하고 유산균발효마늘추출액 100 ng/ml와 μg/ml를 0~24시간 동안 처리하였다. 처리 시간에 따른 세포의 이동을 관찰하였으며, 창상선을 기준으로 이동한 세포 수를 계산하여 비교하였다.
대상 데이터
분리된 단백질을 polyvinylidene fluoride (PVDF) 막(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 전달시킨 후, 분석하고자 하는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체는 p~Akt (Cell Signaling), Akt (Cell Signaling), p~eNOS (Cell Signaling), eNOS (Cell Signaling), actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Calif., USA)을 표적으로 하는 항체를 사용하였다. 1차 항체의 반응이 끝난 후 PBS로 3회 washing 해준 뒤 2차 항체와 연속적으로 반응시켜주었다.
BAEC은 20% 소태아혈청(fetal bovine serum (FBS), Welgene, Seoul, Korea)과 항생제(50 μg/ml penicillin/streptomycin)가 포함된 DMEM (glucose 1 g/l, Welgene)을 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
본 실험에서 사용한 유산균발효 마늘추출물은 경남 가월영농조합에서 생산한 창녕산 마늘을 구입하여 다음과 같이 조제하였다. 마늘 5 kg과 증류수 10 kg을 발효조(MJS U3, Marubishi, Tokyo, Japan)에서 혼합, 교반하면서 121°C에서 1시간 동안 멸균하였다.
3). 실험에서 알아본 신호전달물질은 eNOS (endothelial nitric oxide synthase)와 Akt이다. eNOS는 혈관의 생리적 기능 유지에 중요한 산화질소를 생성하는 효소로 알려져 있으며, Akt는 세포 성장에 관여하는 신호전달물질이다[3, 13].
소 대동맥 내피세포인 BAEC (bovine aortic endothelial cell)은 세포 외 기질에 부착하여 성장하는 세포(adhesive cell)이다. 이 세포는 소의 대동맥에서 추출하여 사용되는데, 계 대수가 8에서 12 사이의 일차세포를 실험에 사용하였다. BAEC은 20% 소태아혈청(fetal bovine serum (FBS), Welgene, Seoul, Korea)과 항생제(50 μg/ml penicillin/streptomycin)가 포함된 DMEM (glucose 1 g/l, Welgene)을 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
데이터처리
실험결과는 mean ± S.E.로 나타내었고 분석된 데이터는 실험자료로부터 one-way ANOVA를 이용하여 유의성이 있을경우 post-hoc test (Dunnett test)를 통해 95% 수준에서 유의성을 검증하였다.
성능/효과
Akt와 eNOS 및 산화질소 양 증가의 상관관계를 보다 자세히 규명해 본 단핵구 부착 실험의 결과, Akt의 활성을 억제하는 wortmannin 및 eNOS의 활성을 억제하는 L-NAME 처리군 모두에서 발효마늘추출물이 작용하는 세포부착억제 효과가 사라졌다(Fig. 5). 이와 같은 현상은 발효마늘의 단핵구 부착 억제기능은 산화질소를 통해서 일어남을 보여주는 것이다.
이러한 일련의 과정 중의 하나인 단핵구의 혈관부착에 발효마늘이 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 단핵구의 내피세포 부착실험을 본 연구에서 수행하였다. LPS를 처리하여 유사 염증 현상을 유도한 뒤 발효마늘추출물을 처리한 경우와 처리하지 않은 경우의 혈관내피세포의 변화를 관찰 한 결과, 발효 마늘추출물을 처리한 혈관 내피세포에는 단핵구 부착이 감소되었다. 이는 동맥경화가 유발 되었을 때 나타나는 염증반응이 발효마늘추출물에 의하여 의미있게 줄어들었다고 볼 수 있으며 발효마늘추출물은 동맥경화 발생을 억제하는데 효과가 있다고 사료된다.
실험을 위해 내피세포를 혈청기아 시킨 뒤 발효마늘추출물을 100 ng/ml, 1 μm/ml 농도로 처리하였다. 그 후 cell viability assay kit를 이용하여 분석한 결과 발효마늘추출물이 세포의 성장에는 큰 영향을 미치지 못하였다. 다음으로 내피세포의 이동에 미치는 발효마늘의 효과를 관찰하였다.
다음으로 Fig. 3B에서 보는 바와 같이 발효 마늘추출물을 농도별로 처리하여 신호전달물질의 활성 변화를 관찰한 실험결과, eNOS와 Akt의 활성은 0.1 μg/ml일 때 가장 높은 것으로 확인 되었다.
하지만 LPS에 의해 자극이유도되었을 경우 발효마늘추출물을 처리해 주게 되면 부착되는 단핵구의 수가 확연히 감소하는 것을 볼 수 있으며, 이는 발효마늘추출물이 염증 반응에 어느 정도 관여한다고 볼 수 있다. 따라서 Fig. 2의 결과를 토대로 발효마늘추출물은 세포 성장과 세포이동에는 효과를 나타내지 못했지만, 단핵구 부착을 통해 일어나는 염증 반응에는 발효마늘추출물이 억제효과가 있음을 알 수 있었다.
Akt는 다양한 세포기능에 역할을 하면서 eNOS의 Upstream 분자로도 알려져 있다[12]. 따라서 두 세포신호전달 분자들이 발효마늘추출물에 의하여 활성화되는 현상은 발효마늘추출물이 혈관내피세포의 산화질소 생성 유발기능을 갖고 있음을 지지해주는 결과이다. 발효마늘추출물이 산화질소 생성을 직접 유발하는지 알기 위하여 발효마늘추출물을 처리한 후 혈관 세포내의 산화질소를 측정 한 결과, 산화질소의 양이 140%까지 증가하였다(Fig.
이는 앞서 wortmannin을 처리하고 관찰한 실험결과와 비슷하게 산화질소의 합성이 억제되면 염증 반응이 감소되지 못하여 단핵구의 부착이 증가했다고 볼 수 있다. 따라서 앞선 실험들과 비교해 보았을 때 산화질소는 혈관 내피세포의 염증 반응에 관여하며 발효마늘추출물을 이러한 산화질소의 생성에 관여하여 단핵구 부착을 차단하는 기능을 갖는다는 것을 알 수 있다.
5). 먼저 phophoinositide 3-kinases를 억제하여 Akt의 억제자로 작용하는 wortmannin을 처리한 실험결과 발효마늘추출물을 처리하였을 때 나타나는 단핵구 부착의 억제효과가 wortmannin에 의해 사라짐을 알 수 있었다. 이는 Akt가 억제되면 내피세포에서는 LPS에 의해 유도된 염증 반응이 발효마늘추출물로 인해 감소되지 않는다는 것을 알 수 있다.
더 구체적인 분자기전을 알기 위하여 세포신호전달 경로에 미치는 발효마늘추출물의 효과를 관찰하였다. 발효마늘추출물의 처리양 및 처리시간에 따른 세포신호전달 분자의 활성을 관찰한 결과, ERK, JNK, p38 MAP kinase의 활성은 1 ug/ml의 발효마늘추출물 처리에 의해 특별한 변화를 관찰하지 못하였다(data not shown).
따라서 두 세포신호전달 분자들이 발효마늘추출물에 의하여 활성화되는 현상은 발효마늘추출물이 혈관내피세포의 산화질소 생성 유발기능을 갖고 있음을 지지해주는 결과이다. 발효마늘추출물이 산화질소 생성을 직접 유발하는지 알기 위하여 발효마늘추출물을 처리한 후 혈관 세포내의 산화질소를 측정 한 결과, 산화질소의 양이 140%까지 증가하였다(Fig. 4).
특히 산화질소는 P-selectin의 발현을 조절하는데 P-selectin의 발현이 증가하는 원인 중 하나는 산화질소 합성 효소의 억제에 의해 산화질소의 양이 감소하는 것이다[19]. 본 실험에서 보았던 결과처럼 산화질소 생성 효소의 저해제 처리가 단핵구 부착을 증가시키는 현상도 산화질소가 혈관기능에 중요한 인자임을 보여준 것이다.
1 μg/ml 처리 한 후 시간에 따른 산화질소의 양을 측정하였다. 세포 내 산화질소양의 변화를 측정한 결과 10분에서 가장 많은 양의 산화질소를 관찰됨을 알 수 있었다(Fig. 4).
이를 바탕으로 발효마늘추출물이 혈관내피세포에 가장 효율적으로 영향을 미치는 시간은 처리 후 10분이며 그 농도는 0.1 μg/ml일 때 인 것을 알 수 있었다.
후속연구
발효마늘추출물은 혈관 내피세포의 여러 변화들 중에서 산화질소의 생성을 유발하여 단핵구의 부착을 감소 시켰고, 이는 발효마늘추출물이 혈관에서 항 염증성 효과가 있음을 보여준다. 따라서 연구 결과를 토대로 발효마늘추출물은 동맥경화를 비롯한 다양한 염증 반응의 치료 및 예방에 효과가 있는 식·의약 재료가 될 수 있음을 제시한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
마늘이 가진 생리활성 효능으로 알려진 것들은 무엇인가?
마늘(Allium sativum)은 전 세계적으로 향신료 등의 식용뿐만 아니라 한방의학의 약재로 까지 널리 이용된 한방 의약품 중 하나이다[9]. 오랫동안 많은 연구자들이 효능을 알기 위한 많은 연구를 통하여 마늘은 항죽상경화증, 항당뇨병, 항돌연변이성, 항암 및 면역 활동 등을 높이며 항균 성분으로 서의 수많은 치료 효능 등이 보고 되었다[2]. 또한 마늘은 발효하여 실생활에서 많이 이용되고 있는데, 발효마늘의 생리적인 효과도 현재 많이 밝혀져 있는 상태이다.
발효마늘의 생리학적 효능은 무엇인가?
또한 마늘은 발효하여 실생활에서 많이 이용되고 있는데, 발효마늘의 생리적인 효과도 현재 많이 밝혀져 있는 상태이다. 마늘의 효능과 비슷하게도 발효마늘은 관상 동맥경화, 혈중 콜레스테롤 수치 등을 감소시키는 것과 혈관 산화도를 낮추는 심혈관 보호 기능을 가진다고 알려져 있다[10]. 또 다른 보고에 의하면, 발효마늘이 관상 동맥 질환이 있는 환자의 동맥이 석회화 되는 것을 억제한다고도 알려졌다[20]. 그러나 발효마늘의 혈관 기능에 관한 분자적 기전에 대한 이해는 아직 미미하여 더 많은 연구가 필요하다.
죽상 동맥경화의 초기단계에서 혈액에서 순환하고 있는 혈구세포와 내피세포의 부착이 일어나는 현상을 이용하여 항염증 정도를 파악하기 위해 어떤 것을 측정할 수 있는가?
동맥경화는 혈관에서 발생하는 질환으로 혈관의 염증 반응에 의해서 진행되는데, 이러한 죽상 동맥경화의 초기단계에서는 혈액에서 순환하고 있는 혈구세포와 내피세포의 부착이 일어난다. 이러한 현상을 이용하여 항염증 정도를 파악하기 위해 백혈구의 내피세포 부착 정도를 측정하여 염증에 관한 효능을 평가 할 수 있다. 이 과정은 주로 혈관 내피세포에서 여러 염증성 자극에 반응하여 순환하는 백혈구 내에 발현되는 부착분자들과 내피세포의 부착분자들에 의해 매개된다고 알려져 있다[1, 4].
참고문헌 (21)
Blankenberg, S., Barbaux, S. and Tiret, L. 2003. Adhesion molecules and atherosclerosis. Atherosclerosis 170, 191-203.
Cellini, L., Di Campli, E., Masulli, M., Di Bartolomeo, S. and Allocati, N. 1996. Inhibition of Helicobacter pylori by garlic extract (Allium sativum). FEMS Immunol. Med. Microbiol. 13, 273-277.
Chiu, W. C., Chiou, T. J., Chung, M. J. and Chiang, A. N. 2016. ${\beta}$ 2-Glycoprotein I inhibits vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis by suppressing the phosphorylation of extracellular signal-regulated Kinase 1/2, Akt, and endothelial nitric oxide synthase. PloS One 11, e0161950.
Choi, K. B., Wong, F., Harlan, J. M., Chaudhary, P. M., Hood, L. and Karsan, A. 1998. Lipopolysaccharide mediates endothelial apoptosis by a FADD-dependent pathway. J. Biol. Chem. 273, 20185-20188.
Choi, W., Song, J., Park, M. H., Yu, H. J. and Park, H. 2016. Effect of fermented platycodon grandiflorum extract on cell proliferation and migration in bovine aortic endothelial cells. J. Life Sci. 26, 59-67.
Jansson, E. a., Huang, L., Malkey, R., Govoni, M., Nihlen, C., Olsson, A., Stensdotter, M., Petersson, J., Holm, L., Weitzberg, E. and Lundberg, J. O. 2008. A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis. Nat. Chem. Biol. 4, 411-417.
Jung, E. B., Choi, J. H., Yu, H. J., Kim, K. H., Lee, S. K., Hwang, Y. I. and Lee, S. H. 2013. Organosulfur compounds in fermented garlic extracts and the effects on alcohol induced cytotoxicity in CYP2E1-transfected HepG2 cells. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 42, 342-347.
Larijani, V. N., Ahmadi, N., Zeb, I., Khan, F., Flores, F. and Budoff, M. 2013. Beneficial effects of aged garlic extract and coenzyme Q10 on vascular elasticity and endothelial function: the FAITH randomized clinical trial. Nutrition 29, 71-75.
Lee, H. S., Lim, W. C., Lee, S. J., Lee, S. H., Lee, J. H. and Cho, H. Y. 2016. Antiobesity effect of garlic extract fermented by lactobacillus plantarum BL2 in diet-induced obese mice. J. Med. Food. 19, 823-829.
Li, T., Li, D., Xu, H., Zhang, H., Tang, D. and Cao, H. 2016. Wen-Xin Decoction ameliorates vascular endothelium dysfunction via the PI3K/AKT/eNOS pathway in experimental atherosclerosis in rats. BMC Complement. Altern. Med. 16, 27.
Oliveira-Paula, G. H., Lacchini, R. and Tanus-Santos, J. E. 2017. Clinical and pharmacogenetic impact of endothelial nitric oxide synthase polymorphisms on cardiovascular diseases. Nitric Oxide 63, 39-51.
Quaschning, T., Kocak, S., Bauer, C., Neumayer, H. H., Galle, J. and Hocher, B. 2003. Increase in nitric oxide bioavailability improves endothelial function in endothelin1 transgenic mice. Nephrol. Dial. Transplant 18, 479-483.
Singh, K. K., Matkar, P. N., Muhammad, S., Quan, A., Gupta, V., Teoh, H., Al-Omran, M. and Verma, S. 2016. Investigation of novel LPS-induced differentially expressed long non-coding RNAs in endothelial cells. Mol. Cell Biochem. 421, 157-168.
Sobrevia, L., Ooi, L., Ryan, S. and Steinert, J. R. 2005. Nitric oxide: a regulator of cellular function in health and disease. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 150-166.
Tousoulis, D., Kampoli, A. M., Tentolouris Nikolaos Papageorgiou, C. and Stefanadis, C. 2012. The role of nitric oxide on endothelial function. Curr. Vasc. Pharmacol. 10, 4-18.
Weiss, N., Papatheodorou, L., Morihara, N., Hilge, R. and Ide, N. 2013. Aged garlic extract restores nitric oxide bioavailability in cultured human endothelial cells even under conditions of homocysteine elevation. J. Ethnopharmacol. 145, 162.
Yao, H. W., Zhu, X. Y., Guo, X. F. and Wang, H. 2016. An amphiphilic fluorescent probe designed for extracellular visualization of nitric oxide released from living cells. Anal. Chem. 88, 9014-9021.
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