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논문 상세정보

벼에서 CRISPR/Cas9 활용 고빈도 유전자 편집 방법

A novel method for high-frequency genome editing in rice, using the CRISPR/Cas9 system

초록

CRISPR/Cas9 기술은 생명공학을 활용한 신품종 작물육성에 있어 패러다임 변혁을 가져다 줄 핵심 기반기술이다. 본 연구에서는 CRISPR/Cas9를 이용하여 유전자편집기술을 기존에 알려진 방법보다 쉽고 정확하게 실험 할 수 있도록 sgRNA 디자인, 벡터구축, 형질전환체 육성 및 분석 등을 자세히 기술하였다. sgRNA는 http://www.rgenome.net/ 사이트에서 NGG 영역을 중심으로 하여 target-up: 5'-ggcaGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'과 target-down: 5'-aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3'의 올리고를 디자인하였다. 식물형질전환용 벡터는 pPZP-Cas9-RGEN을 기본으로 하였으며, sgRNA의 프로모터는 OsU3를 이용하여 pPZP::35S::Cas9::PinII-OsU3::sgRNA::Bar-Gen 순으로 구축하였다. 형질전환체의 육성은 단기형질전환 Agrobacterium 법을 사용하였으며 재분화 식물체를 얻는데48일 정도 소요되었다. 형질전환체 유무는 genomic PCR 분석으로 single copy 선발은 TaqMan PCR로 분석하였다. 정밀유전자편집 식물체는 T1 세대에서 T-DNA 삽입되지 않은 식물체를 Bar-strip에 의해 선발하였다. 선발된 식물체의 sgRNA 영역의 염기배열 조사에 의해 유전자 편집 식물체를 육성하였다. 따라서 본 연구에서 CRISPR/Cas9 system에 의한 정밀유전자편집 기술을 이용하여 보다 빠르고 쉽고 경제적으로 유전자가 편집된 개체를 확보할 수 있었다. 본 실험에서 확립된 system은 상업용 식물 계통육성에 이용 가능하여 육종적 가치가 매우 클 것으로 사료된다.

Abstract

The CRISPR/Cas9 is a core technology that can result in a paradigm for breeding new varieties. This study describes in detail the sgRNA design, vector construction, and the development of a transgenic plant and its molecular analysis, and demonstrates how gene editing technology through the CRISPR/Cas9 system can be applied easily and accurately. CRISPR/Cas9 facilitates targeted gene editing through RNA-guided DNA cleavage, followed by cellular DNA repair mechanisms that introduce sequence changes at the site of cleavage. It also allows the generation of heritable-targeted gene mutations and corrections. Here, we present detailed procedures involved in the CRISPR/Cas9 system to acquire faster, easier and more cost-efficient gene edited transgenic rice. The protocol described here establishes the strategies and steps for the selection of targets, design of sgRNA, vector construction, and analysis of the transgenic lines. The same principles can be used to customize the versatile CRISPR/Cas9 system, for application to other plant species.

본문요약 

문제 정의
  • 본 논문에서는 CRISPR/Cas9을 이용하여 유전자편집기술을 기존에 알려진 방법보다 쉽고 정확하게 실험할 수 있도록 sgRNA 디자인, 벡터구축, 형질전환체 분석 및 육성 등을 자세히 기술하고자 한다.

    지금까지 많은 생물에서 CRISPR/Cas9를 이용하여 유전자 편집에 대한 보고는 되었으나 일반적인 연구실에서 적용 및 응용하기가 아직 부족한 실정이다. 본 논문에서는 CRISPR/Cas9을 이용하여 유전자편집기술을 기존에 알려진 방법보다 쉽고 정확하게 실험 할 수 있도록 sgRNA 디자인, 벡터구축, 형질전환체 분석 및 육성 등을 자세히 기술하고자 한다.

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핵심어 질문 논문에서 추출한 답변
RGEN 디자인 프로그램
RGEN 디자인 프로그램의 사용방법은 무엇인가?
사이트 접속 후 Cas-Designer로 들어가서 원하는 PAM type을 선정할 수 있으며, 본 연구에서는 SpCas9 from Streptococcus pyogenes: 5'-NGG-3' 을 선정하였다. 그 다음은 target genome 을 선정하고, 유전자 전체 CDS 중에서 앞쪽부터 50% 정도 되는 서열을 한번에 1,000 bp 이내로 target sequence에 넣은 후 submit를 클릭한다. 분석에 의해 얻어진 sgRNA들 중에서는 mis-match 1, 2에서 off-target이 제거된 list 1-0-0으로 나온 것과, 30%~70% 사이의 GC 함량으로 구성되고, out-of-frame score가 높은 것 순으로 선정하는 것이 바람직하다. 이 score는 indel이 일어났을 때 frame-shift가 일어날 가능성을 예측 하여 기록한 것으로 높을수록 염기에 변이가 일어날 가능성이 높다고 볼 수 있다. 이렇게 선정된 sgRNA들은 한번 더 Cas-OFFinder로 들어가서 넣은 후 mis-match 설정을 3 ~ 4개로 하여 off-target들을 찾아내어 list 1-0-0-0을 골라낸다. Off-target이 많으면 원하지 않는 변이가 생길 가능성이 높으 므로 신중히 선택하는 것이 좋다. 최종 선정된 sgRNA들 중에서 한 유전자당 4 ~ 5개를 선정하여 사용한다

RGEN 디자인 프로그램은 먼저 선정된 작물의 게놈에서 목표하는 유전자 염기서열 중 CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein 9) 시스템이 인식하는 부위인 PAM (Proto-Spacer Adjacent Motif) 5’-NGG-3’ 서열을 선정한 후, PAM으로부터 시작하여 역으로 20bp의 sgRNA를 제작하도록 고안되어 있다. 프로그램 사용방법은 사이트 접속 후 Cas-Designer로 들어가서 원하는 PAM type을 선정할 수 있으며, 본 연구에서는 SpCas9 from Streptococcus pyogenes: 5'-NGG-3' 을 선정하였다. 그 다음은 target genome 을 선정하고, 유전자 전체 CDS 중에서 앞쪽부터 50% 정도 되는 서열을 한번에 1,000 bp 이내로 target sequence에 넣은 후 submit를 클릭한다. 분석에 의해 얻어진 sgRNA들 중에서는 mis-match 1, 2에서 off-target이 제거된 list 1-0-0으로 나온 것과, 30%~70% 사이의 GC 함량으로 구성되고, out-of-frame score가 높은 것 순으로 선정하는 것이 바람직하다. 이 score는 indel이 일어났을 때 frame-shift가 일어날 가능성을 예측 하여 기록한 것으로 높을수록 염기에 변이가 일어날 가능성이 높다고 볼 수 있다. 이렇게 선정된 sgRNA들은 한번 더 Cas-OFFinder로 들어가서 넣은 후 mis-match 설정을 3 ~ 4개로 하여 off-target들을 찾아내어 list 1-0-0-0을 골라낸다. Off-target이 많으면 원하지 않는 변이가 생길 가능성이 높으 므로 신중히 선택하는 것이 좋다. 최종 선정된 sgRNA들 중에서 한 유전자당 4 ~ 5개를 선정하여 사용한다.

게놈편집
게놈편집은 어떠한 기술인가?
다양한 생물 종에서 목적하는 유전자를 개량하는 기술

최근 다양한 생물 종에서 목적하는 유전자를 개량하는 기술로 “게놈편집”이 주목 받고 있다. 특히 인공제한효소를 이용한 게놈편집은 광범위한 생물 종에서 표적유전자 파괴 (Knock-out) 및 외래유전자의 부가(knock-in)가 가능하게 되면서부터 차세대 유전자 개량기술로 주목을 받고 있다 (Subburaj et al.

CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas9 활용시 어떠한 편집이 가능한가?
특정염기서열을 인지하고 그 부위의 이중나선을 절단함으로써 유전체상 위치 특이적 돌연변이 유도, 유전자삽입, 대체 등을 포함한 다양한 염기서열 특이적 유전체 편집이 가능 하다

최근 들어 세균 획득 면역반응 system (CRISPR/Cas9(clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR-associated protein 9)은 염기서열 특이적 핵산분해효소로서 작용할 수 있는 일종의 맞춤형 유전자가위이다. CRISPR/Cas9 활용을 통해 특정염기서열을 인지하고 그 부위의 이중나선을 절단함으로써 유전체상 위치 특이적 돌연변이 유도, 유전자삽입, 대체 등을 포함한 다양한 염기서열 특이적 유전체 편집이 가능 하다(Endo et al. 2016; Wang et al.

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