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문제 정의
- licheniformis 균주의 yobN 유전자 보유가 amine oxidase 활성과 일치하지 않으며, 균주 특이적인 특성으로 확인되었다. 따라서 GenBank에 유전체 정보가 등록된 B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. subtilis 균주를 대상으로 yobN 유전자의 보유를 검토하였다.
- 최근 본 연구자들은 전통 된장 발효 및 숙성 과정 중의 미생물 천이 분석 과정에서 Bacillus 속 126 균주를 확보하였다[22]. 본 연구에서는 이들 분리 균주를 대상으로 바이오제닉아민 저감화에 기여할 수 있는 amine oxidase 활성 보유 균주를 선발하여 yobN 유전자의 보유 및 된장 발효용 종균으로써의 특성을 검토하였다.
제안 방법
- Amine oxidase 유전자 yobN 존재 확인을 위한 PCR primer는 GenBank에 등록된 Bacillus 속 보유 yobN 유전자 염기서열을 ClustalW program을 이용하여 나열한 다음, 상동성이 높은 부분을 선정하여 제작하였다(IF: 5′ATCGCCGACTCGCTTCTATGA-3′, IR: 5′-ATGCCCGTG TCCTCCTATGCT-3′).
- 균주들의 내염성은 NaCl을 첨가한 TSA에서의 생장을 통하여 확인하였다. 12%, 14%, 16% (w/v)의 NaCl이 첨가된 배지는 37℃에서 7일 동안 배양하여 colony 형성을 확인하였다. 균주들이 보유한 단백질 분해 활성 확인에는 탈지분유 2% (w/v), 산 생성 활성 확인에는 glucose 2% (w/v)와 CaCO3 0.
- 1)를 증폭할 수 있도록 제작하였고(GF: 5′-GGACTTCGTGCAGAGAGGATG-3′, GR:5′-ACATCCCGTCAGAAGGCGGAG-3′), PCR은 yobN 유전자 존재 확인과 동일한 조건에서 수행하였다. 8MI05 균주로부터 증폭된 완전한 yobN 유전자는 pGEM-T easy vector (Promega, USA)를 이용하여 클로닝하였고, 유전자 발현을 위한 host로는 Escherichia coli BL21을 사용하였다. E.
- Amine oxidase 유전자 보유 균주에 의한 바이오제닉아민 저감화 활성은 4종류의 바이오제닉아민을 첨가한 TSB에서 24시간 배양 후, 감소한 바이오제닉아민을 정량분석하여 측정하였다. 4종류의 바이오제닉아민(cadaverine dihydrochloride, histamine dihydrochloride, putrescine dihydrochloride, tyramine hydrochloride)은 Sigma로부터 구입하였고, 각각 0.
- 바이오제닉아민 정량은 식품공전에 따라 dansyl chloride (Sigma)로 유도체화한 다음, HPLC로 분석하였다[25]. HPLC는 Agilent 1200 series system (Agilent Technologies, USA)을 사용하였고, 바이오제닉아민은 UV detector를 이용하여 254 nm에서 검출하였다. Nova-Pak C18 column (4 μm, 154 × 4.
- PCR 증폭을 위한 total DNA 추출에는 DNeasy tissue kit (Qiagen, Germany)를 사용하였고, PCR은 50 μl 반응계에서 template DNA, 10 mM dNTP, 1.25 unit Taq polymerase (Inclone, Korea) 및 각 primer를 0.5 μM 농도로 첨가하여 T-3000 thermocycler (Biometra, Germany)를 사용하여 수행하였다.
- TSB에서 12시간 배양한 균주 배양액을 새로운 TSB로 희석하여 흡광도(600 nm) 0.5로 동일화시킨 다음, 배양액의 amine oxidase 활성을 Amplex Red Monoamine Oxidase Assay Kit (Molecular Probes, USA)를 사용하여 측정하였다. 효소 활성 1 unit은 20℃, pH 6.
- Tributyrin agar는 1시간 sonication으로 tributyrin을 유화시킨 다음 멸균하였다. 각 기질이 첨가된 배지에 균주를 접종하고, 37℃에서 24시간 배양하여 생육과 투명환의 생성으로 활성을 확인하였다. 효소 활성에 미치는 NaCl의 영향은 각 기질이 첨가된 배지에 NaCl을 첨가하여 확인하였다.
- 균주들의 내염성은 NaCl을 첨가한 TSA에서의 생장을 통하여 확인하였다. 12%, 14%, 16% (w/v)의 NaCl이 첨가된 배지는 37℃에서 7일 동안 배양하여 colony 형성을 확인하였다.
- 12%, 14%, 16% (w/v)의 NaCl이 첨가된 배지는 37℃에서 7일 동안 배양하여 colony 형성을 확인하였다. 균주들이 보유한 단백질 분해 활성 확인에는 탈지분유 2% (w/v), 산 생성 활성 확인에는 glucose 2% (w/v)와 CaCO3 0.7% (w/v)를 첨가한 TSA를 사용하였고, 지질 분해 활성은 tributyrin 1% (v/v)를 첨가한 tributyrin agar (Sigma)를 사용하였다. Tributyrin agar는 1시간 sonication으로 tributyrin을 유화시킨 다음 멸균하였다.
- 25% (w/v) 농도로 첨가하였다[24]. 바이오제닉아민 정량은 식품공전에 따라 dansyl chloride (Sigma)로 유도체화한 다음, HPLC로 분석하였다[25]. HPLC는 Agilent 1200 series system (Agilent Technologies, USA)을 사용하였고, 바이오제닉아민은 UV detector를 이용하여 254 nm에서 검출하였다.
- 1 M ammonium acetate 를 50:50 (v/v)으로 혼합한 용매를 19분 동안 90:10으로 변화시킨 다음, 2분 동안 50:50로 변화시켰다. 바이오제닉아민의 정량을 위한 정량곡선은 4종류의 바이오제닉아민에 내부표준물질 1,7-diaminoheptane (Sigma)을 1,000 mg/l 첨가하여 작성하였다. 3반복 수행한 실험결과의 평균과 표준편차를 정량값으로 제시하였다.
- 또한 주원료 콩에 다량으로 함유된 단백질과 지질의 분해를 통하여 된장 특유의 관능적인 특성이 나타나기 때문에 단백질 및 지질 분해 활성은 종균 선발의 기준이 될 수 있다. 본 연구에서 선발한 amine oxidase 활성 보유 B. licheniformis 9균주와 B.siamensis 1균주를 대상으로 된장 발효 관련 기능성을 평가하였다(Table 1).
- 양혈액(sheep blood; BBL Microbiology Systems, Sparks, MD, USA)을 5% (v/v) 농도로 첨가한 TSA를 사용하여 37℃에서 12시간 배양하여 생성된 colony 표면에 100 mg/l 농도 N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (Sigma, USA) 수용액을 도포하여 산화반응에 의한 색깔 변화를 확인하였다.
- 0 U/ml 이상의 활성을 나타낸 10균주를 선발하였다(Table 1). 양혈액배지에서 산화 반응을 나타내지 않은 B. licheniformis 8DJ14 균주는 2.8 U/ml의 amine oxidase 활성을 나타내어 바이오제닉아민 정량분석을 위한 대조군으로 선발하였다.
- 완전한 yobN 유전자 증폭을 위한 PCR primer는 GenBank에 등록된 B. licheniformis WX-02의 yobN 유전자(NCBI accession number: AKQ73085.1)를 증폭할 수 있도록 제작하였고(GF: 5′-GGACTTCGTGCAGAGAGGATG-3′, GR:5′-ACATCCCGTCAGAAGGCGGAG-3′), PCR은 yobN 유전자 존재 확인과 동일한 조건에서 수행하였다.
- 재조합균주에 의한 바이오제닉아민 저감화 활성은 4종류의 바이오제닉아민을 첨가한 LB broth에서 24시간 배양 후, 감소한 바이오제닉아민을 정량분석하여 측정하였다.
- 6 mm, Waters, USA)을 분리에 사용하였고, 용매는 1 ml/min 속도로 흘려 주었다. 전개용매는 acetonitrile과 0.1 M ammonium acetate 를 50:50 (v/v)으로 혼합한 용매를 19분 동안 90:10으로 변화시킨 다음, 2분 동안 50:50로 변화시켰다. 바이오제닉아민의 정량을 위한 정량곡선은 4종류의 바이오제닉아민에 내부표준물질 1,7-diaminoheptane (Sigma)을 1,000 mg/l 첨가하여 작성하였다.
- 증폭된 PCR 산물은 1.5% (w/v) agarose gel을 이용한 전기영동으로 확인하였으며, Gel & PCR purification system (Inclone)을 이용하여 정제하여 Genotech (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 염기 서열을 결정하였다.
- 각 기질이 첨가된 배지에 균주를 접종하고, 37℃에서 24시간 배양하여 생육과 투명환의 생성으로 활성을 확인하였다. 효소 활성에 미치는 NaCl의 영향은 각 기질이 첨가된 배지에 NaCl을 첨가하여 확인하였다.
대상 데이터
- 양혈액(sheep blood; BBL Microbiology Systems, Sparks, MD, USA)을 5% (v/v) 농도로 첨가한 TSA를 사용하여 37℃에서 12시간 배양하여 생성된 colony 표면에 100 mg/l 농도 N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (Sigma, USA) 수용액을 도포하여 산화반응에 의한 색깔 변화를 확인하였다. 10초 이내 colony 주변에 어두운 남색 또는 보라색 환이 생기는 균주를 oxidase 활성 보유 균주로 선발하였다.
- Amine oxidase 유전자 보유 균주에 의한 바이오제닉아민 저감화 활성은 4종류의 바이오제닉아민을 첨가한 TSB에서 24시간 배양 후, 감소한 바이오제닉아민을 정량분석하여 측정하였다. 4종류의 바이오제닉아민(cadaverine dihydrochloride, histamine dihydrochloride, putrescine dihydrochloride, tyramine hydrochloride)은 Sigma로부터 구입하였고, 각각 0.25% (w/v) 농도로 첨가하였다[24]. 바이오제닉아민 정량은 식품공전에 따라 dansyl chloride (Sigma)로 유도체화한 다음, HPLC로 분석하였다[25].
- 메주와 된장에서 분리하여 16S ribosomal RNA 유전자 염기서열 분석을 통하여 동정한 B. licheniformis 82균주, B.methylotrophicus 18균주, B. siamensis 17균주, B. subtilis 9균주를 바이오제닉아민 분해 활성 보유 균주 선발에 사용하였다[22]. Bacillus 균주들의 동정은 shikimate 5-dehydrogenase 유전자 aroE의 염기서열 결정을 통하여 재확인하였다[23].
- Bacillus 균주들의 동정은 shikimate 5-dehydrogenase 유전자 aroE의 염기서열 결정을 통하여 재확인하였다[23]. 본 연구에 사용된 Bacillus 균주는 tryptic soy agar (TSA;Difco, USA)와 tryptic soy broth (TSB; Difco)를 사용하여 37℃에서 12시간 배양하였다.
- 5% (w/v) agarose gel을 이용한 전기영동으로 확인하였으며, Gel & PCR purification system (Inclone)을 이용하여 정제하여 Genotech (Daejeon, Korea)에 의뢰하여 염기 서열을 결정하였다. 유전자 상동성 분석은 National Center for Biotechnology Information database (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 BLAST program을 이용하여 GenBank에 등록된 염기서열 정보를 대상으로 수행하였다.
데이터처리
- 바이오제닉아민의 정량을 위한 정량곡선은 4종류의 바이오제닉아민에 내부표준물질 1,7-diaminoheptane (Sigma)을 1,000 mg/l 첨가하여 작성하였다. 3반복 수행한 실험결과의 평균과 표준편차를 정량값으로 제시하였다.
성능/효과
- 한편, Bacillus 균주들의 유기산 생성은 한천배지 상에서 거의 확인되지 않았다. 10균주 모두 NaCl이 첨가된 한천배지에서 균주 특이적인 protease와 lipase 활성을 나타냈지만, NaCl이 6% 초과하여 첨가된 경우 protease 활성을 나타내는 균주는 없었다. Lipase 활성 측정을 위한 tributyrin은 4% (w/v) 이상의 NaCl 농도에서 녹지 않아 최대 NaCl 첨가량을 결정할 수 없지만, 소금이 상당량 존재하는 상태에서 Bacillus 균주가 lipase 활성을 나타낼 것으로 추정된다.
- 2017년 4월 기준, 총 8균주의 완전한 유전체 정보가 GenBank에 공개된 B. licheniformis의 경우, 5균주가 yobN 유전자를 보유하고 있는 것으로 확인되었다(Table 2). 가장 많은 유전체 정보가 등록된 B.
- yobN 유전자의 보유가 확인된 8MI05와 8MS03 균주를 4종류 바이오제닉아민을 첨가한 TSB에서 배양한 다음, 바이오제닉아민의 감소를 확인하였다. 8MI05와 8MS03 균주 배양액으로부터는 음성대조군 8DJ14 균주 배양액 대비 4종류 바이오제닉아민 감소가 확인되었고, 특히 8MI05 균주의 저감화 능력이 높은 것으로 나타났다(Fig. 1). 대조군 대비 8MI05 균주는 4종류 바이오제닉아민을 평균 444 ppm 감소 시켰고, 8MS03 균주는 평균 279 ppm 감소시켰다.
- 두 균주 모두 4종류 바이오제닉아민 (cadaverine, histamine, putrescine, tyramine) 분해 활성을 나타냈고, yobN 유전자를 보유한 재조합균주에서도 바이오제닉아민 분해 활성이 확인되었다. Amine oxidase 유전자 보유 균주들은 14% NaCl 농도에서 생육 가능하였고, 균주 특이적인 protease 및 lipase 활성을 나타내었다.
- Amine oxidase 활성 측정을 통하여 선발된 Bacillus 10균주를 대상으로 amine oxidase 유전자 yobN 특이적 primer IF와 IR을 이용하여 PCR을 진행한 결과, 8MI05, 8MS03 균주로부터 예상 크기와 일치하는 약 400 bp의 증폭 산물이 확인되었다. 두 균주로부터 증폭된 DNA 단편은 B.
- subtilis H'J53-3 균주의 존재를 보고하였다. B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. subtilis 균주의 완전한 유전체 정보를 대상으로 hdc 및 tdc 유전자의 보유를 검토한 결과, 이들 유전자를 보유한 균주는 존재하지 않았다(Table 2). 따라서 B.
- 4 U/ml의 활성을 나타냈다. B. licheniformis 38균주 중에서 14BML13 균주는 31.8 U/ml로 가장 높은 활성을 14BDL20 균주는 7.4 U/ml로 가장 낮은 활성을 나타내었다. 추가 실험 진행을 위하여 19.
- yobN 유전자의 기능성 규명을 위하여 8MI05 균주 유래의 완전한 yobN 유전자를 증폭하여 pGEM-T easy vector에 삽입한 재조합 플라스미드 pGBAO을 구축하고, 이 플라스미드를 보유한 재조합균주에 의한 4종류 바이오제닉아민의 감소를 확인한 결과, 대조군 대비 감소가 확인되었다. 가장 높은 저감화가 확인된 tyramine의 경우 775 ppm의 감소가 확인되었고, 가장 낮은 저감화가 나타난 putrescine은 59 ppm 의 감소가 나타났다(Fig.
- yobN 유전자의 보유가 확인된 8MI05와 8MS03 균주를 4종류 바이오제닉아민을 첨가한 TSB에서 배양한 다음, 바이오제닉아민의 감소를 확인하였다. 8MI05와 8MS03 균주 배양액으로부터는 음성대조군 8DJ14 균주 배양액 대비 4종류 바이오제닉아민 감소가 확인되었고, 특히 8MI05 균주의 저감화 능력이 높은 것으로 나타났다(Fig.
- yobN 유전자의 기능성 규명을 위하여 8MI05 균주 유래의 완전한 yobN 유전자를 증폭하여 pGEM-T easy vector에 삽입한 재조합 플라스미드 pGBAO을 구축하고, 이 플라스미드를 보유한 재조합균주에 의한 4종류 바이오제닉아민의 감소를 확인한 결과, 대조군 대비 감소가 확인되었다. 가장 높은 저감화가 확인된 tyramine의 경우 775 ppm의 감소가 확인되었고, 가장 낮은 저감화가 나타난 putrescine은 59 ppm 의 감소가 나타났다(Fig. 2). 재조합균주의 바이오제닉아민 저감화 활성이 확인됨에 따라 yobN 유전자의 바이오제닉아민 분해 기능이 재확인되었다.
- licheniformis의 경우, 5균주가 yobN 유전자를 보유하고 있는 것으로 확인되었다(Table 2). 가장 많은 유전체 정보가 등록된 B. subtilis의 경우, 53균주의 완전한 유전체 정보 중에서 47균주의 보유가 확인되었다. 한편, 총 20균주의 완전한 유전체 정보가 공개된 B.
- licheniformis 8MI05와 8MS03 균주는 동일한 염기서열을 가진 amine oxidase 유전자(yobN)를 보유하고 있었다. 공개된 B. licheniformis 유전체 정보를 대상으로 yobN 유전자의 보유를 검색한 결과, yobN 유전자 보유는 균주 특이적인 특성으로 확인되었다. 두 균주 모두 4종류 바이오제닉아민 (cadaverine, histamine, putrescine, tyramine) 분해 활성을 나타냈고, yobN 유전자를 보유한 재조합균주에서도 바이오제닉아민 분해 활성이 확인되었다.
- 메주와 된장에서 분리한 Bacillus 속 126균주를 대상으로 amine oxidase 활성을 나타낸 10균주를 분리하였다. 그 중, B. licheniformis 8MI05와 8MS03 균주는 동일한 염기서열을 가진 amine oxidase 유전자(yobN)를 보유하고 있었다. 공개된 B.
- 1). 대조군 대비 8MI05 균주는 4종류 바이오제닉아민을 평균 444 ppm 감소 시켰고, 8MS03 균주는 평균 279 ppm 감소시켰다.
- licheniformis 유전체 정보를 대상으로 yobN 유전자의 보유를 검색한 결과, yobN 유전자 보유는 균주 특이적인 특성으로 확인되었다. 두 균주 모두 4종류 바이오제닉아민 (cadaverine, histamine, putrescine, tyramine) 분해 활성을 나타냈고, yobN 유전자를 보유한 재조합균주에서도 바이오제닉아민 분해 활성이 확인되었다. Amine oxidase 유전자 보유 균주들은 14% NaCl 농도에서 생육 가능하였고, 균주 특이적인 protease 및 lipase 활성을 나타내었다.
- Amine oxidase 활성 측정을 통하여 선발된 Bacillus 10균주를 대상으로 amine oxidase 유전자 yobN 특이적 primer IF와 IR을 이용하여 PCR을 진행한 결과, 8MI05, 8MS03 균주로부터 예상 크기와 일치하는 약 400 bp의 증폭 산물이 확인되었다. 두 균주로부터 증폭된 DNA 단편은 B. licheniformis WX-02 균주의 amine oxidase 유전자와 100% 상동성을 나타내어, 8MI05와 8MS03 균주의 yobN 유전자 보유가 확인 되었다.
- amyloliquefaciens의 경우, yobN 유전자를 보유한 균주는 확인되지 않았으며, 30균주의 불완전 유전체 정보에서도 확인되지 않았다. 따라서 B. licheniformis와 B. subtilis의 yobN 유전자 보유는 균주 특이적인 특징으로 나타났고, B. amyloliquefaciens의 yobN 유전자 비보유는 종(species) 특이적인 특징으로 추정된다.
- idriensis 균주에서만 확인되었다[19]. 본 연구에서는 B. licheniformis 균주의 yobN 유전자 보유가 amine oxidase 활성과 일치하지 않으며, 균주 특이적인 특성으로 확인되었다. 따라서 GenBank에 유전체 정보가 등록된 B.
- 선발된 균주들은 모두 14% (w/v) NaCl을 첨가한 TSA에서 생육을 나타내어 평균 NaCl 농도 12%인 된장에서의 생육에는 문제가 없는 것으로 나타났다. 한편, Bacillus 균주들의 유기산 생성은 한천배지 상에서 거의 확인되지 않았다.
- 선발한 40균주를 대상으로 amine oxidase 활성을 측정한 결과, 각각 한 균주가 선발된 B. siamensis와 B. subtilis는 25.2 U/ml, 12.4 U/ml의 활성을 나타냈다. B.
- 양혈액이 첨가된 TSA에서 생장한 총 126 Bacillus 속 균주의 colony에 N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 용액을 도포한 결과, 산화반응을 나타내는 B. licheniformis 38균주, B. siamensis 1균주, B. subtilis 1균주의 총 40균주를 선발하였다.
- 2). 재조합균주의 바이오제닉아민 저감화 활성이 확인됨에 따라 yobN 유전자의 바이오제닉아민 분해 기능이 재확인되었다.
- subtilis의 경우, 53균주의 완전한 유전체 정보 중에서 47균주의 보유가 확인되었다. 한편, 총 20균주의 완전한 유전체 정보가 공개된 B. amyloliquefaciens의 경우, yobN 유전자를 보유한 균주는 확인되지 않았으며, 30균주의 불완전 유전체 정보에서도 확인되지 않았다. 따라서 B.
후속연구
- 가장 높은 amine oxidase 활성을 나타낸 B. licheniformis 14BML13 균주가 yobN 유전자를 보유하지 않은 것으로 보아 yobN 유전자 외에도 amine oxidase 활성에 기여할 수 있는 추가적 요인이 존재할 가능성이 있어, 이에 대한 추가적 연구가 필요하다.
- 본 연구에서 선발된 B. licheniformis 8MI05는 바이오제닉아민 저감화 활성을 보유하고 있으며, 내염성뿐만 아니라 protease 및 lipase 활성 측면에서 우수성을 나타내어, 생물 학적 위해요소에 의한 위험성을 낮추고 된장 발효에 관능적 특성을 향상시킬 수 있을 것으로 예상된다.
- licheniformis 8MI05는 바이오제닉아민 저감화 활성을 보유하고 있으며, 내염성뿐만 아니라 protease 및 lipase 활성 측면에서 우수성을 나타내어, 생물 학적 위해요소에 의한 위험성을 낮추고 된장 발효에 관능적 특성을 향상시킬 수 있을 것으로 예상된다. 해당 균주의 기능성이 된장 담금을 통하여 확인된다면 우수한 발효용 종균으로써 된장 발효에 기여할 것으로 기대된다.
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