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문제 정의
- 본 연구에서는 함량평가를 통해 부산물로 생산되는 고추씨의 활용을 위한 기초 자료로 사용되기 위하여 고추씨에 함유되어 있는 icariside E5, vanilloylicariside E5의 밸리데이션과 함량평가를 실시하였다.
제안 방법
- 지표성분 분리 및 구조동정 − 지표물질 분리에 사용된 역상 컬럼은 고정상으로 Sephadex LH-20(10-25 μm, GE Healthcare Bio-Science AB, Uppsala, Sweden), MCI-gel CHP 20P(75-150 μm, Mitsubishi Chemical, Tokyo, Japan) 및 ODS-B gel(40-60 μm, Daiso, Osaka, Japan)이었다. Column chromatography를 이용하여 지표물질을 분리하였으며 구조동정은 Varian사의 600 MHz(1H: 600 MHz, 13C: 150 MHz)를 이용하여 icariside E5(1)와 vanilloyl icariside E5(2)로 구조를 동정하였다(Fig. 1).13)
- HPLC 조건 − 표준품인 icariside E5와 vanilloyl icariside E5의 분석조건을 Table I과 같이 설정한 다음, 이 분석조건에 따라 각각의 시료의 validation과 정량분석을 실시하였다.
- Icariside E5과vanilloyl icariside E5의 혼합 표준용액을 4개 농도(Icariside E5; 1000, 500, 250, 125 μg/mL, vanilloyl icariside E5 500, 250, 125, 62.5 μg/mL)의 범위에서, 각 시료 농도당 3일간 반복성 시험, 일내 3회 반복성 시험을 하였다.
- 5 μg/mL)가 되도록 용액을 만들어 실험을 실시하였다. Linear regression equation (y=ax+b y: peak 면적, x: 시료 농도 a: 직선의 기울기, b: y절편)을 구하였으며 R2의 값을 통하여 직선성을 확인하였다. R2의 값이 0.
- 검량선, 직선성(Linearity) −직선성 평가를 위한 검량선을 얻기 위해 표준품 icariside E5을 methanol로 희석하여 4개의 농도(1000, 500, 250, 125 μg/mL), 표준품 vanilloyl icariside E5을 methanol로 희석하여 4개의 농도(500, 250, 125, 62.5 μg/mL)가 되도록 용액을 만들어 실험을 실시하였다.
- 고추씨 추출물을 column chromatography 방법으로 분리, 정제하여 얻은 icariside E5과 vanilloyl icariside E5을 지표 성분으로 설정하여 분석법을 확립하였다.
- 분석 방법의 검증(Validation) − HPLC 분석방법의 정확성 및 재현성을 검증하기 위하여 KFDA(식품의약품안전처)의「의약품등 분석법의 밸리데이션에 대한 가이드라인」에 따라서 특이성, 직선성, 정량한계, 정확성 및 정밀성 평가를 시행하였다.
- 이 stock solution을 희석하여 icariside E5는 1000, 500, 250, 125 μg/mL, vanilloyl icariside E5는 500, 250, 125, 62.5 μg/mL 농도의 표준용액을 조제하였다.
- 정량한계(LOQ) −분석물질의 정량이 가능한 최저농도를 확인하기 위하여 정량한계(LOQ)를 측정하였다.
- 정확성(Accuracy) 및 정밀성(Precision) −동일 시료에 대하여 실험 환경 변동에 따른 결과의 변화 정도를 확인하기 위하여 정밀성 및 정확성 평가를 하였다.
- 5 μg/mL)의 범위에서, 각 시료 농도당 3일간 반복성 시험, 일내 3회 반복성 시험을 하였다. 정확성은 표준값과 측정값 간의 일치되는 정도로 확인하였으며, 정밀성은 반복 분석하였을 때 분석물질에 대한 측정값들 사이의 근접성으로 측정하였다.
- 6 (C-8''')]의 존재를 나타내었다. 최종적으로 문헌과 비교하여 2는 vanilloylicariside E5로 구조를 동정하였다.13)
- 3 (C-6'')에서 glucopyranose를 확인하였다. 최종적으로 문헌을 비교하여 icariside E5로 구조를 동정하였다.13)
- 추출물은 CNW®사의 Nylon 0.45 μm filter로 여과한 후 HPLC 검액으로 사용하였다.
- 특이성(Specificity) −지표성분이 고추씨 추출물 내의 다른 물질과 분리가 되는지 UV detector를 이용하여 피크의 retention time(RT)을 검토하여 확인하였다.
- 표준용액의 조제 −고추씨로부터 분리, 정제한 icarisideE5과 vanilloyl icariside E5을 각 1 mg씩 정확히 취해 각각 MeOH를 1 mL가하여 stock solution(1000 μg/mL)을 조제했다.
- 함량(Content) − Validation 과정을 통하여 확립한 HPLC 분석법으로 고추씨 추출물 내의 지표성분의 정량에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정밀성, 정확성 등을 갖고 있음을 확인하고, 검증된 분석법으로 고추씨 추출물의 함량을 측정하였다.
대상 데이터
- TLC는 pre-coated silica gel 60 F254 plate(Merck, Darmastadt, Germany)를 사용하였다. 단일 화합물의 구조를 규명하기 위해 이용한 NMR(Nuclear magneticresonance) spectrum은 Varian사의 600MHz(1H: 600MHz, 13C: 150MHz)를 사용하여 측정하였고, NMR 용매는 Sigma. Inc(USA)의 Acetond-d6, methanol-d4를 사용하였다.
- 07분에 검출되었다. 두 지표성분의 UV 흡수 파장은 280 nm로 설정하여 피크의 면적을 측정하였다.
- 분석에 사용된 용매는 Whatman® Membrane filters(0.45 μm, diam. 47 mm)를 이용하여 여과된 용매를 사용하였다.
- 의 분석법을 확립하기 위한 최적의 분석법이 확립되었다. 이동상 용매로 A: water, B: acetonitrile를 선정하여 각각 gradient elution을 적용함으로써 검체의 피크를 이상적으로 분리할 수 있었다. Icariside E5은 19.
- 재료 −본 실험에 사용된 고추씨 재료의 원산지는 경북 영양군(구매처; 영양고추유통공사)이며 고추씨 추출물은 노바렉스(주)로부터 제공받아 사용하였다.
데이터처리
- 기울기 S는 분석물질의 검량선으로부터 구하여 회귀직선에서 y절편의 표준편차를 표준편차 σ로서 이용하였다.
- 정량한계(LOQ)는 QL=10×σ/S(σ: 반응의 표준편차, S: 검량선의 기울기)를 통하여 계산하였다.
이론/모형
- 정량한계(LOQ) −정량한계(LOQ)공식을 이용하여 정량한계를 구하였다.
성능/효과
- Icariside E5은 94.87 μg/mL, vanilloyl icariside E5은 13.38 μg/mL으로 확인하였으며 소량인 성분도 정량이 가능함을 확인하였다(Table II).
- Vanilloyl icariside E5을 HPLC로 분석하여 작성한 검량선의 Linear regression equation은 Y=12947X-95797이며(Fig. 2), 검량선의 상관계수(R²)는 0.9999로 높은 직선성을 보였다.
- 40%%로 양호한 값을 나타내었다(Table III). Vanilloyl icariside E5의 정확성은 98.72~103.50% 이내로 확인하였으며, 정밀성은 변동계수(c.v., coefficient variation)로서 0.14~1.94로 양호한 값을 나타내었다(Table III).
- 검량선, 직선성(Linearity) − Icariside E5의 HPLC로 분석하여 작성한 검량선의 Linear regression equation은 Y=12428X+137720이며(Fig. 3), 검량선의 상관계수(R²)는 0.9998로 높은 직선성을 보였다.
- 분석조건 확립 −지표성분인 icariside E5와 vanilloyl icariside E5의 분석법을 확립하기 위한 최적의 분석법이 확립되었다.
- 정확성(Accuracy) 및 정밀성(Precision) − Icariside E5의 정확성은 98.32~100.91% 이내로 확인하였으며, 정밀성은 변동계수(c.v., coefficient variation)로서 0.30~1.40%%로 양호한 값을 나타내었다(Table III).
- 특이성(Specificity) − HPLC를 이용해 고추씨 추출물의 chromatography를 비교하여 icariside E5와 vanilloyl icariside E5의 retention time을 확인한 결과, 다른 물질과 간섭 없이 성분의 peak를 확인하였다.
- 특이성, 직선성, 정량한계, 정확성 및 정밀성을 통하여 충분히 유의성이 있음을 확인하였으며 이상의 분석법을 이용하여 지표물질에 대한 함량분석을 시행한 결과 고추씨 추출물에는 0.28%의 icariside E5와 0.085%의 vanilloyl icariside E5이 함유되어 있음을 확인하였다. 본 연구의 결과로 확립된 분석법은 추후 고추씨 추출물의 함량분석에 있어서 중요한 기초자료로 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 의 retention time을 확인한 결과, 다른 물질과 간섭 없이 성분의 peak를 확인하였다. 표준용액의 RT는 icariside E5 19.49분, vanilloyl icariside E5 22.07분으로 확인되었으며, 고추씨 추출물내의 icariside E5과 vanilloyl icariside E5의 RT는 각각 19.08분, 22.10분으로 표준용액의 피크 유지시간과 고추씨 추출물내의 피크 유지시간이 거의 일치한 것을 확인함으로써 특이성을 검증하였다(Fig. 2).
- 함량(Content) −확립된 분석법을 이용하여 지표물질의 함량을 측정한 결과 고추씨 extract 내의 icariside E5의 함량은 0.28%로 확인하였으며, vanilloyl icariside E5의 함량은 0.085%로 확인하였다(Table IV).
후속연구
- 085%의 vanilloyl icariside E5이 함유되어 있음을 확인하였다. 본 연구의 결과로 확립된 분석법은 추후 고추씨 추출물의 함량분석에 있어서 중요한 기초자료로 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
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