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문제 정의
- 또한 피부장벽에 영향을 주는 항산화효과19,20), 면역조절작용18), 피부질환에 대한 항염증효과23) 등 AR 관련 선행연구들을 통해 보고된 AR의 효능들이 피부병변에 영향을 미칠 것이라 기대하였다. 따라서, 저자는 위와 같은 AR의 효능들을 통해 AD의 치료에 유의성 있는 효과를 얻을 수 있을 것이라 기대하고 이를 실험적으로 구명하고자 본 연구를 진행하였다.
- 본 실험에서는 한의학의 肺主皮毛 개념을 기본으로, 肺, 胃로 歸經하면서 淸肺, 養陰작용11) 및 排膿消腫, 祛風止痒의 효능12-15)을 가진 AR을 통해 肺氣를조절함으로서 인체 면역기능을 강화하고 피부질환의 개선을 도모하고자 하였다. 또한 피부장벽에 영향을 주는 항산화효과19,20), 면역조절작용18), 피부질환에 대한 항염증효과23) 등 AR 관련 선행연구들을 통해 보고된 AR의 효능들이 피부병변에 영향을 미칠 것이라 기대하였다.
- 이에 저자는 DNCB로 AD를 유도한 생쥐에게 AR 추출물을 도포하고 투여하여 AD 증상 개선효과를 알아보기 위하여, AD 유발 생쥐의 체중변화, 귀 무게, 귀 및 등의 피부 두께, 그리고 AD 피부의 육안적 관찰과 함께 symptom score 측정, 조직학적 소견을 관찰하였으며, AR 추출물이 면역세포의 증식률에 미치는 효과를 in vitro와 in vivo로 확인하였다.
- 이에 저자는 아토피 피부염에서 사삼의 피부 손상 및 항염증효과를 확인하고자, DNCB로 아토피 피부염을 유도한 생쥐에게 사삼 추출액을 도포하고 경구 투여하여 안전성 확인을 위한 체중변화를 측정하였으며, 효과 관찰을 위한 귀의 무게, 귀와 등의 피부두께 차이, 착색, 홍반 및 낙설, symptom score, 조직, 비장세포의 증식률 등에 미치는 영향에 유의성을 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 4)와 같이 실험군을 분류한 후 시행한 다음, 실험종료 시 각종의 처치를 실시한 실험 생쥐의 비장을 in vitro 방법과 동일하게 적출한 뒤 비장세포 부유액을 RPMI 1640배지로 희석하고 96 well plate에 1.0×106cells/㎖ 농도로 LPS를 첨가하고 Ez-cytox 15㎕를 각 well에 첨가하고 차광상태에서 2시간 정도 배양한 후 각 well의 흡광도를 Microplate Reader로 450㎚에서 측정하였다.
- 4주간의 실험을 마친 후 생쥐에서 적출한 비장에서 비장세포를 분리하고 LPS로 활성화시킨 후 증식률을 측정하였다. 측정값은 대조군의 증식률을 100.
- 4주의 실험기간 동안 체중 변화를 4회에 걸쳐 관찰하였다. 대조군을 제외하고 체중이 증가하는 경향을 나타내었다.
- AD 유발을 위한 약물 도포를 위해 동물전용 마취제인 zoletile(Virbac, France)을 완충용액(PBS)에 1:100 비율로 희석하여 생쥐 무게인 20g을 대략적인 기준으로 잡고 100㎕를 복강 주사하여 마취시켰다. 엉덩이 쪽을 전기면도기를 사용하여 1차 제모한 뒤 크림용 제모제를 넓게 도포하여 5∼10분 방치하고 온수를 묻힌 거즈로 닦아냈다.
- AR을 열수 추출한 후 동결건조시켜 얻은 분말을 증류수에 희석한 뒤 경구 투여시 사용하였으며, 투여량은 500㎎/㎏/day 농도로 하여 10일간 투여하도록 했다.
- 5㎖을 이용하여 마취시키고 AOO액과 1% DNCB가 혼합된 용액을 등과 귀부위에 도포하였다. Pipet(yellow tip)을 이용하여 1일 1회 3일간 혼합용액 30㎕을 귀 부위에 도포하고, 등 부위에는 1일 1회 3일간 혼합용액 50㎕을 도포한 후, 3일간 더 관찰하였다. 등 부위에 AI 희석액 도포를 같이 시작하면서 최종적으로 AD를 유발하기 위해 혼합용액을 귀에 30㎕, 등에 50㎕씩 10일간 2일 1회씩 총 5회에 걸쳐 도포하였다.
- Wysocki25) 및 Mizel 등26) 의 방법에 의하여 정상 생쥐의 비장 세포를 분리하고, 분리된 비장 세포 부유액을 RPMI(Rapid Prototyping & Manufacturing Institute) 1640배지로 희석하고 96well plate에 1.0×106 cells/㎖ 농도로 접종한 다음 비장 세포에 LPS(Lipopolysaccharide) 5㎍/㎖ 과 AR을 농도별(0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 ㎎/㎖)로 첨가한 후 각 37℃의 CO2 배양기에서 24 시간 배양했다.
- 沙蔘이 DNCB로 유발된 AD 생쥐에 미친 영향을 알아보기 위해 체중, 귀 무게, 귀 및 등의 피부 두께, symptom score, 그리고 splenocytes의 증식률을 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 그리고 탈수와 투명(cleansing) 과정을 거쳐 흐르는 물에 침전시켜 파라핀 제거한 후 조직 절편을 Hematoxylin(SIGMA, USA)과 Eosin(SIGMA, USA)으로 염색하였다. 과염색된 부분은 흐르는 수돗물에 5분 정도 수세한 후, 다시 탈수 및 투명과정을 거쳐 봉입(mounting) 하여 광학현미경(x 100)을 통해 관찰하였다.
- 0 ㎎/㎖)로 첨가한 후 각 37℃의 CO2 배양기에서 24 시간 배양했다. 그 이후 Ez-cytox 15㎕를 각 well에 첨가하고 차광상태에서 2시간 정도 배양한 다음 각 well의 흡광도를 Microplate Reader로 450㎚에서 측정하였다.
- 티슈로 남은 물기와 잔털까지 제거하고 24시간 동안 상처 치유를 위해 방치하였다. 그 후, 호흡마취제인 아이프란액(isoflurane, 중외제약, Korea) 1.5㎖을 이용하여 마취시키고 AOO액과 1% DNCB가 혼합된 용액을 등과 귀부위에 도포하였다. Pipet(yellow tip)을 이용하여 1일 1회 3일간 혼합용액 30㎕을 귀 부위에 도포하고, 등 부위에는 1일 1회 3일간 혼합용액 50㎕을 도포한 후, 3일간 더 관찰하였다.
- 생쥐에게 아토피 피부염(Atopic Dermatitis, AD)을 유발시키기 위해 acetone과 olive oil을 4대 1 로 섞은 혼합액(AOO)에 2,4-dinitrochlorobenzene(이하 DNCB, Sigma, USA)를 1% 비율로 희석한 혼합용액을 만들었다. 그리고 이 혼합용액을 제모한 생쥐의 피부에 도포하여 AD를 유발하였다.
- 생쥐로부터 얻어진 등 부위 피부 조직을 10% 포르말린에 고정한 후 파라핀에 포매하고, 미세절단기(Sakura, Japan)를 이용하여 4㎛ 두께로 박절하여 슬라이드에 부착시켰다. 그리고 탈수와 투명(cleansing) 과정을 거쳐 흐르는 물에 침전시켜 파라핀 제거한 후 조직 절편을 Hematoxylin(SIGMA, USA)과 Eosin(SIGMA, USA)으로 염색하였다. 과염색된 부분은 흐르는 수돗물에 5분 정도 수세한 후, 다시 탈수 및 투명과정을 거쳐 봉입(mounting) 하여 광학현미경(x 100)을 통해 관찰하였다.
- 도포용 약물과 경구 투여용 약물을 각각 방법에 차이를 두어 제조하였다. 증류수(D/W) 1,500㎖에서 100℃로 AR 50g을 4시간 열수 추출한 다음 찌꺼기를 제거한 상층액을 모아서 감압농축기(EYELA, Japan)를 이용하여 농축하였다.
- 도포용으로 제조된 시료를 등 부위에 적절히 도포하되, AD 유발액인 혼합용액을 바르는 시간과 최소 4시간 이상 차이를 두었고, 10일간 매일 일정한 시간에 최종 혼합액 기준으로 도포 용량을 50㎕로 하여 도포하였다.
- Pipet(yellow tip)을 이용하여 1일 1회 3일간 혼합용액 30㎕을 귀 부위에 도포하고, 등 부위에는 1일 1회 3일간 혼합용액 50㎕을 도포한 후, 3일간 더 관찰하였다. 등 부위에 AI 희석액 도포를 같이 시작하면서 최종적으로 AD를 유발하기 위해 혼합용액을 귀에 30㎕, 등에 50㎕씩 10일간 2일 1회씩 총 5회에 걸쳐 도포하였다.
- 체중을 총 4회에 걸쳐 측정하여, 약물의 투여 및 도포로 인한 생쥐의 체중 변화를 관찰하였다. 먼저 사육장에서의 적응 기간을 끝낸 후 실험을 시작하기 전에 측정한 체중을 기준으로 삼았고(Initial), AD를 유발하기 위해 제모한 다음 AD를 유발시킨 후 측정한(Waxing) 체중, 약물의 투여와 도포가 진행되는 1주(1 Weeks)때에, 마지막으로 희생시키기 전 체중(2Weeks)을 측정하여 비교하였다. 체중의 측정은 측정일 오후 2시에 실시하였고, 전자저울(HANA, KC-200, Korea)을 이용하였다.
- 시료 투여로 발생한 생쥐 피부는 Hematoxylin osin(H&E) 염색을 시행하여 조직학적 관찰을 시행하였다. 생쥐로부터 얻어진 등 부위 피부 조직을 10% 포르말린에 고정한 후 파라핀에 포매하고, 미세절단기(Sakura, Japan)를 이용하여 4㎛ 두께로 박절하여 슬라이드에 부착시켰다. 그리고 탈수와 투명(cleansing) 과정을 거쳐 흐르는 물에 침전시켜 파라핀 제거한 후 조직 절편을 Hematoxylin(SIGMA, USA)과 Eosin(SIGMA, USA)으로 염색하였다.
- 생쥐에게 아토피 피부염(Atopic Dermatitis, AD)을 유발시키기 위해 acetone과 olive oil을 4대 1 로 섞은 혼합액(AOO)에 2,4-dinitrochlorobenzene(이하 DNCB, Sigma, USA)를 1% 비율로 희석한 혼합용액을 만들었다. 그리고 이 혼합용액을 제모한 생쥐의 피부에 도포하여 AD를 유발하였다.
- 수동 펀치를 이용하여 실험이 끝난 후 희생된 생쥐의 귀를 일정한 크기로 도려내어 무게를 측정하고 각 군을 비교하였다. 그 결과, 대조군의 귀 무게는 정상군에 비하여 유의성 있게 증가하였고, ARSF군의 귀무게는 대조군에 비해 유의성 (p<0.
- 시료 투여로 발생한 생쥐 피부는 Hematoxylin osin(H&E) 염색을 시행하여 조직학적 관찰을 시행하였다.
- 실험 마지막 날 AD가 유발된 생쥐를 희생시킨 후, 시료의 도포 및 투여로 변화된 귀 두께와 등 피부 두께를 측정하기 위해 등과 귀의 피부를 절제한 후 디지털 캘리퍼(Mitutoyo, Japan)를 이용하여 각각의 두께를 측정하였다.
- 실험 마지막 날 생쥐를 희생시킨 후, 정확한 측정을 위하여 가위로 귀를 절제한 다음 수동형 펀치기를 이용하여 직경 5㎜의 둥근 절편을 만들어 미량 저울(OHAUS, USA)을 이용하여 무게를 측정하였다.
- 실험을 위해 제모 후 AD를 유발시키지 않고 증류수를 경구 투여하고 AOO만을 도포한 정상군(Normal, NOR), AD를 유발하고 증류수를 경구 투여하고 AOO을 도포한 대조군(Control, CON), AD를 유발하고 AR 추출액을 도포하고 증류수를 경구 투여한 AR 도포군(AR spread group, ARS), AD를 유발하고 증류수를 도포하고 AR 추출액을 경구 투여한 AR 경구 투여군(AR feeding group, ARF), AD를 유발하고 AR 추출액을 도포하고 경구 투여한 AR 도포 및 경구 투여군(AR spread&feeding group, ARSF)로 나누었다.
- 실험종료 후 희생된 생쥐의 양쪽 귀를 수동 펀치를 이용하여 일정한 크기로 도려낸 다음 두께를 측정하였고, 또한 절제한 등 피부를 디지털 캘리퍼로 피부 두께를 측정하였다. 대조군의 귀 두께와 등 피부 두께는 정상군보다 유의성 있게 증가한 반면 ARSF 군의 귀와 등 두께는 대조군보다 각각 유의성(p<0.
- 약물도포 및 투여에 따른 AD의 실험기간 동안 변화 정도를 관찰하기 위해 실험을 마친 뒤 희생시키기 전, 각 군별 생쥐의 등 부위를 Digital camera(Samsung WB 1000, Korea)로 촬영하였다. 이를 기초로 생쥐의 등에 발생한 피부질환의 병변 정도를 육안으로 관찰하여 수치화하고, 피부 부종과 종창의 정도를 다음의 기준에 따라 판정하였다(Table 1).
- 약물도포 및 투여에 따른 AD의 실험기간 동안 변화 정도를 관찰하기 위해 실험을 마친 뒤 희생시키기 전, 각 군별 생쥐의 등 부위를 Digital camera(Samsung WB 1000, Korea)로 촬영하였다. 이를 기초로 생쥐의 등에 발생한 피부질환의 병변 정도를 육안으로 관찰하여 수치화하고, 피부 부종과 종창의 정도를 다음의 기준에 따라 판정하였다(Table 1).
- 정상 생쥐로부터 비장 세포를 분리하여 사삼 추출액을 처리한 다음 비장세포 증식률을 관찰하였다. LPS를 첨가하지 않은 대조군(-)에 비해 LPS가 첨가된 대조군(+)에서 증식률이 크게 상승하였으며 사삼 추출액의 처리농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 비장세포의 증식률이 증가하였다.
- 도포용 약물과 경구 투여용 약물을 각각 방법에 차이를 두어 제조하였다. 증류수(D/W) 1,500㎖에서 100℃로 AR 50g을 4시간 열수 추출한 다음 찌꺼기를 제거한 상층액을 모아서 감압농축기(EYELA, Japan)를 이용하여 농축하였다. 그리고 동결건조기(Samwon, Korea)를 이용하여 동결 건조한 후, 최종적으로 얻어진 AR의 동결 건조 분말은 14.
- 체중을 총 4회에 걸쳐 측정하여, 약물의 투여 및 도포로 인한 생쥐의 체중 변화를 관찰하였다. 먼저 사육장에서의 적응 기간을 끝낸 후 실험을 시작하기 전에 측정한 체중을 기준으로 삼았고(Initial), AD를 유발하기 위해 제모한 다음 AD를 유발시킨 후 측정한(Waxing) 체중, 약물의 투여와 도포가 진행되는 1주(1 Weeks)때에, 마지막으로 희생시키기 전 체중(2Weeks)을 측정하여 비교하였다.
- 먼저 사육장에서의 적응 기간을 끝낸 후 실험을 시작하기 전에 측정한 체중을 기준으로 삼았고(Initial), AD를 유발하기 위해 제모한 다음 AD를 유발시킨 후 측정한(Waxing) 체중, 약물의 투여와 도포가 진행되는 1주(1 Weeks)때에, 마지막으로 희생시키기 전 체중(2Weeks)을 측정하여 비교하였다. 체중의 측정은 측정일 오후 2시에 실시하였고, 전자저울(HANA, KC-200, Korea)을 이용하였다.
대상 데이터
- 은 길경과(초롱꽃과)에 속한 다년생 본초인 잔대 Adenphora triphylla var. japonica HARA 및 동속근연식물의 뿌리를 건조한 것으로 동신대학교 부속목포한방병원에서 구입하여 사용하였다.
- 실험을 위해 제모 후 AD를 유발시키지 않고 증류수를 경구 투여하고 AOO만을 도포한 정상군(Normal, NOR), AD를 유발하고 증류수를 경구 투여하고 AOO을 도포한 대조군(Control, CON), AD를 유발하고 AR 추출액을 도포하고 증류수를 경구 투여한 AR 도포군(AR spread group, ARS), AD를 유발하고 증류수를 도포하고 AR 추출액을 경구 투여한 AR 경구 투여군(AR feeding group, ARF), AD를 유발하고 AR 추출액을 도포하고 경구 투여한 AR 도포 및 경구 투여군(AR spread&feeding group, ARSF)로 나누었다. 각각의 개체 수는 9마리로 실험을 시행하였다.
- 증류수(D/W) 1,500㎖에서 100℃로 AR 50g을 4시간 열수 추출한 다음 찌꺼기를 제거한 상층액을 모아서 감압농축기(EYELA, Japan)를 이용하여 농축하였다. 그리고 동결건조기(Samwon, Korea)를 이용하여 동결 건조한 후, 최종적으로 얻어진 AR의 동결 건조 분말은 14.1g으로 수득율은 28.2%이었고, 이를 증류수에 희석하여 경구 투여 시료로 사용하였다.
- 동신대학교 실험동물윤리위원회(DSU-2014-043)의 승인을 거친 이후 동물실험 전문업체인 ㈜샘타코에서 7주령의 수컷 Balb/c 계통의 생쥐(23±2g)를 구매하여 실험을 시행하였다.
데이터처리
- 통계 프로그램 SigmaPlot 11을 사용하여 데이터를 통계 처리하였고, 수합된 데이터는 one-way ANOVA 기법을 활용하였다. P-value가 0.05미만인 경우에만 유의한 것으로 인정하였으며, 사후검정은 Tukey방법을 시행하였다.
- 통계 프로그램 SigmaPlot 11을 사용하여 데이터를 통계 처리하였고, 수합된 데이터는 one-way ANOVA 기법을 활용하였다. P-value가 0.
이론/모형
- Proliferation rates of splenocyte were measured using modified MTT method described in materials and methods. Values are represented as mean±SD.
성능/효과
- 1. 사삼 추출액을 처리한 실험군들의 체중은 대조군에 비하여 증가하는 경향을 나타내었고, 특히 실험종료 시 ARSF군의 체중은 대조군에 비하여 유의성 있게 증가하였다.
- 2. ARSF군의 귀 무게, 귀와 등 피부의 두께는 대조군보다 유의성 있게 감소하였다.
- 3. ARSF군의 등 피부는 대조군과 다른 ARS군과 ARF군에서 나타나는 착색, 홍반 및 낙설에 비해 현저하게 감소하였다.
- 4. ARSF군의 symptom score는 대조군보다 유의성 있게 감소하였다.
- 귀의 부종과 귀 피부 조직의 비후로 인해 귀 무게도 증가하는 경향을 보이므로, 약물의 항염증 작용을 평가하는 척도로 사용된다36). 4주간의 실험이 끝난 후 생쥐의 귀 무게를 측정한 결과 대조군의 귀 무게는 정상군에 비하여 유의성 있게 증가하였고, ARSF군의 귀 무게는 체중의 결과와 유사하게 대조군에 비해 유의성 있게 감소하는 것으로 보여 AR 추출액은 AD로 인한 증상을 개선시킬 수 있는 것으로 판단된다. 또한, 실험이 끝난 후 생쥐의 양쪽 귀 두께와 등 피부의 두께를 측정한 결과 상기 결과들과 같이 ARSF군의 측정치가 대조군보다 유의성 있게 감소하여 AR 추출액은 DNCB로 유도한 AD에 효과적일 것으로 생각된다.
- 5. ARSF군의 등 피부를 H&E 염색을 통해 관찰한 조직학적 결과는 대조군에 비해 일부 Epidermis의 각화와 염증세포 침윤이 남아 있었을 뿐 AD의 조직학적 소견이 개선되었다.
- 6. In vitro 상에서 사삼 추출액은 처리농도가 증가할수록 비장세포의 증식률이 유의성 있게 증가하였다.
- 7. In vivo 상에서 사삼 추출액을 처리한 실험군의 비장세포 증식률은 대조군보다 증가하였으나, 유의한 변화는 나타나지 않았다.
- AD 유발 및 경구투여, 도포의 4주간 실험이 끝난 이후, 등 피부에서 관찰되는 증상의 정도를 관찰해 본 결과, 실험을 마치고 희생시키기 직전 정상군의 모습(Fig. 4)은 털이 자라 일반 생쥐의 모습과 비슷하게 별다른 병리적 소견이 없었으나 혼합용액으로 AD 유발시킨 후 증류수를 처치한 대조군의 등 피부에서는 착색이 심하거나 홍반과 낙설이 병행된 모습이 관찰되었다(Fig. 5). AD 유발 후 사삼 추출액을 도포한 ARS 군과 AD 유발 후 사삼 추출액을 경구 투여한 ARF 군은 대조군에 비해 착색, 홍반 및 낙설이 감소하는 경향을 나타내었고, ARS 군보다 육안적으로 관찰할 때 효과적인 것으로 보였다(Fig.
- AD 유발 후 사삼 추출액을 도포한ARS군(C)과 사삼 추출액을 경구 투여한 ARF군(D)에서는 일부 Epidermis의 각화와 염증세포 침윤이 남아있었으나, 유발 대조군에 비해서는 아토피의 조직학적 소견이 개선되었음을 확인할 수 있었다. AD 유발 후 사삼 추출액을 도포와 경구 투여한 ARSF군(E)의 경우는 일부 Epidermis의 각화와 염증세포 침윤이 남아 있었을 뿐 대조군에 비해 AD의 조직학적 소견이 개선되었음을 확인하였다 (Fig. 10).
- AD 유발 후 사삼 추출액을 도포한 ARS 군과 AD 유발 후 사삼 추출액을 경구 투여한 ARF 군은 대조군에 비해 착색, 홍반 및 낙설이 감소하는 경향을 나타내었고, ARS 군보다 육안적으로 관찰할 때 효과적인 것으로 보였다(Fig. 6∼7).
- 이에 비해 대조군(B)는 epidermis 층에서 심한 각질층 두께의 과형성과 일부 색소침착의 소견이 보이고, epidermis 아래층에서는 eosinophil, mast cell 등을 주로 하는 염증세포의 침윤이 관찰되었다. AD 유발 후 사삼 추출액을 도포한ARS군(C)과 사삼 추출액을 경구 투여한 ARF군(D)에서는 일부 Epidermis의 각화와 염증세포 침윤이 남아있었으나, 유발 대조군에 비해서는 아토피의 조직학적 소견이 개선되었음을 확인할 수 있었다. AD 유발 후 사삼 추출액을 도포와 경구 투여한 ARSF군(E)의 경우는 일부 Epidermis의 각화와 염증세포 침윤이 남아 있었을 뿐 대조군에 비해 AD의 조직학적 소견이 개선되었음을 확인하였다 (Fig.
- . In vitro 상으로 AR 추출물의 비장세포 증식률을 관찰한 결과 AR 추출물의 처리농도가 증가함에 따라 농도의존적으로 비장세포의 증식률이 증가하였고, 특히 1㎎/㎖을 처리한 군에서 대조군(+)에 비해 유의성 있게 증가하였다. 또한 실험을 마친 생쥐의 비장에서 비장세포를 분리하고 LPS로 활성화 시킨 후 증식률을 측정한 결과(in vivo) AR 추출물을 처리한 모든 실험군의 비장세포 증식률은 대조군보다 증가하였다.
- 정상 생쥐로부터 비장 세포를 분리하여 사삼 추출액을 처리한 다음 비장세포 증식률을 관찰하였다. LPS를 첨가하지 않은 대조군(-)에 비해 LPS가 첨가된 대조군(+)에서 증식률이 크게 상승하였으며 사삼 추출액의 처리농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 비장세포의 증식률이 증가하였다. 특히 고농도인 1㎎/㎖을 처리한 군에서 대조군(+)에 비해 유의성(p<0.
- 그 결과, 대조군의 귀 무게는 정상군에 비하여 유의성 있게 증가하였고, ARSF군의 귀무게는 대조군에 비해 유의성 (p<0.05) 있게 감소하였다(Table 3, Fig. 2).
- , 등 피부에서 관찰되는 피부염의 증상을 육안적으로 관찰한 결과, 실험을 마치고 희생시키기 직전 정상군의 모습은 털이 자라 일반 생쥐의 모습과 비슷하였지만 대조군의 등 피부는 착색이 심하거나 홍반과 낙설이 병행된 모습이 관찰되었다. 그러나 AR 추출액을 처리한 모든 실험군은 대조군에 비해 착색, 홍반 및 낙설이 감소하는 경향을 나타내었고, 특히 ARSF군은 대조군에 비해 착색, 홍반 및 낙설이 현저하게 감소하였을 뿐 아니라 ARS군과 ARF군에 비해서도 차이가 있는 것으로 나타났으며, 실험군의 symptom score에서도 유의한 반응을 나타내었다. 또한 피부조직을 H&E염색 후 관찰해 본 결과, 정상군은 특이소견이 거의 관찰되지 않았지만 대조군은 epidermis 층에서 심한 각질층 두께의 과형성과 일부 색소침착의 소견이 보이고,epidermis 아래층에서는 eosinophil, mast cell 등을 주로하는 염증세포의 침윤이 관찰되었다.
- 또한 피부조직을 H&E염색 후 관찰해 본 결과, 정상군은 특이소견이 거의 관찰되지 않았지만 대조군은 epidermis 층에서 심한 각질층 두께의 과형성과 일부 색소침착의 소견이 보이고,epidermis 아래층에서는 eosinophil, mast cell 등을 주로하는 염증세포의 침윤이 관찰되었다. 그러나 ARSF 군은 대조군에 비해 일부 Epidermis의 각화와 염증세포 침윤이 남아 있었을 뿐 AD의 조직학적 소견이 개선되었다. 이와 같은 결과는 AR 추출액을 도포나 경구투여 어느 한쪽만을 시행하는 하는 것보다는 이를 병용처리하면 더욱 더 효과가 있음을 보여주는 결과라 생각된다.
- 대조군의 귀 두께와 등 피부 두께는 정상군보다 유의성 있게 증가한 반면 ARSF 군의 귀와 등 두께는 대조군보다 각각 유의성(p<0.05) 있게 감소하였다(Table 4, Fig. 3A∼B).
- 대조군의 체중은 유발 후 1주째와 2주째 정상군에 비해 유의성 있게 감소되었고 실험종료 시사삼 추출액을 도포하고 경구투여한 ARSF 군의 체중이 대조군에 비해 유의성(p<0.01) 있게 증가하였다(Table 2, Fig. 1).
- In vitro 상으로 AR 추출물의 비장세포 증식률을 관찰한 결과 AR 추출물의 처리농도가 증가함에 따라 농도의존적으로 비장세포의 증식률이 증가하였고, 특히 1㎎/㎖을 처리한 군에서 대조군(+)에 비해 유의성 있게 증가하였다. 또한 실험을 마친 생쥐의 비장에서 비장세포를 분리하고 LPS로 활성화 시킨 후 증식률을 측정한 결과(in vivo) AR 추출물을 처리한 모든 실험군의 비장세포 증식률은 대조군보다 증가하였다.
- 또한 피부조직을 H&E염색 후 관찰해 본 결과, 정상군은 특이소견이 거의 관찰되지 않았지만 대조군은 epidermis 층에서 심한 각질층 두께의 과형성과 일부 색소침착의 소견이 보이고,epidermis 아래층에서는 eosinophil, mast cell 등을 주로하는 염증세포의 침윤이 관찰되었다.
- 4주간의 실험이 끝난 후 생쥐의 귀 무게를 측정한 결과 대조군의 귀 무게는 정상군에 비하여 유의성 있게 증가하였고, ARSF군의 귀 무게는 체중의 결과와 유사하게 대조군에 비해 유의성 있게 감소하는 것으로 보여 AR 추출액은 AD로 인한 증상을 개선시킬 수 있는 것으로 판단된다. 또한, 실험이 끝난 후 생쥐의 양쪽 귀 두께와 등 피부의 두께를 측정한 결과 상기 결과들과 같이 ARSF군의 측정치가 대조군보다 유의성 있게 감소하여 AR 추출액은 DNCB로 유도한 AD에 효과적일 것으로 생각된다.
- 모든 실험종료 후 희생시킨 생쥐의 등 부위의 피부조직을 H & E 염색 후 관찰해 본 결과, 정상군(A)은 epidermis가 얇게 분포하였고 다른 특이 소견이 거의 관찰되지 않았다.
- 식품의약품안전청에서 고시한 동물실험시설 규정과 적합한 시설에서의 1주일 간 적응 기간 동안 고형사료와 물을 충분히 공급하였으며, 또한 12시간 명암주기 및 실내온도(24±2℃)와 습도(55±5%)를 일정하게 유지시켰다.
- 실험동물의 급격한 체중변화는 부작용의 가능성으로 인식35)되는데, 총 실험기간 4주간의 체중 변화를 4회에 걸쳐 관찰한 결과 대조군의 체중이 정상군보다 감소하여 AD로 인해 병태모델의 체중이 감소하였지만 모든 실험군에서는 대조군의 체중보다 증가하였다. 특히 ARSF군에서 대조군보다 유의성 있게 증가하여 AD의 증상이 개선된 것으로 생각된다.
- 이상의 결과, AR 추출물은 DNCB로 유도된 AD에 유의한 효과를 나타내는 것으로 판단되며, 특히 AR 추출물을 도포하거나 경구투여하는 것보다는 병용처리하는 것이 더욱 효과적일 것으로 생각된다. 단, 본 실험에서 경구용 시료는 열수 추출을, 도포용 시료는 에탄올 추출을 이용하여 각각 다른 시료추출방법을 택했으며, 추출용매에 따라 발생할 수 있는 영향에 대한 부분은 비교관찰하지 못하였다.
- 측정값은 대조군의 증식률을 100.0±10.0%로 환산하였을 때 사삼 추출액을 투여한 실험군의 증식률은 대조군보다 증가하였다 (Table 7, Fig. 12).
- 특히 AD 유발 후 사삼 추출액을 도포와 경구 투여한ARSF 군의 경우는 대조군에 비해 착색, 홍반 및 낙설이 현저하게 감소하는 경향을 나타내었고, ARS 군과 ARF 군에 비해서도 차이가 있는 것으로 나타났다(Table 5, Fig. 8∼9).
후속연구
- 이상의 결과, AR 추출물은 DNCB로 유도된 AD에 유의한 효과를 나타내는 것으로 판단되며, 특히 AR 추출물을 도포하거나 경구투여하는 것보다는 병용처리하는 것이 더욱 효과적일 것으로 생각된다. 단, 본 실험에서 경구용 시료는 열수 추출을, 도포용 시료는 에탄올 추출을 이용하여 각각 다른 시료추출방법을 택했으며, 추출용매에 따라 발생할 수 있는 영향에 대한 부분은 비교관찰하지 못하였다. 또한 AR이 어떠한 기전에 의해 도포, 경구 투여의 병용처리시 각각의 단일처리에 비해 유의성이 더 나타났었는지, 그리고 각각 실험군의 용량별 효과비교에 대한 분석 등과 같은 추후 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 단, 본 실험에서 경구용 시료는 열수 추출을, 도포용 시료는 에탄올 추출을 이용하여 각각 다른 시료추출방법을 택했으며, 추출용매에 따라 발생할 수 있는 영향에 대한 부분은 비교관찰하지 못하였다. 또한 AR이 어떠한 기전에 의해 도포, 경구 투여의 병용처리시 각각의 단일처리에 비해 유의성이 더 나타났었는지, 그리고 각각 실험군의 용량별 효과비교에 대한 분석 등과 같은 추후 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 하지만, 본 실험을 통해 향후 AR이 AD의 개선을 위한 임상적 치료제로서 활용될 수 있는 기초자료가 될 수 있을 것이라 생각하며, 더욱 질 높은 가치와 근거 수준 강화를 위해 앞으로 다각적인 후속연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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