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문제 정의
- 특히, 버섯의 경우에는 표고버섯의 아세톤 추출물과 에틸아세테이트 추출물을 이용하여 구강미생물 5종에 대한 증식 억제 효과를 보고한 일부 자료만이 알려져 있다[13]. 또한, 싸리버섯에 대한 구강미생물의 항균 활성은 현재까지 연구된 바가 전무하기 때문에, 본 연구에서는 아세톤, 에탄올 및 에틸아세테이트 등 3가지 용매로 싸리버섯으로부터 용매추출하여 치아우식증과 치주질환 원인균인 Streptococcus, Actinomyces 및 Aggregatibacter 등 총 10종의 구강세균에 대한 항균 효과를 확인함으로써 항균 관련 구강제품에 적용될 후보 천연소재로써의 가능성을 탐색하고자 한다.
- 본 연구는 싸리버섯을 3종의 용매로 추출하여 최적의 구강세균 활성 관련 용매를 탐색하였으며, 치아우식과 치주질환을 유발하는 구강균주 10종에 대한 싸리버섯 추출물의 항균활성을 조사하여 다음과 같은 결과를 확보하였다.
제안 방법
- 10종의 구강균주에 대해서 다른 용매추출물에 비해 강한 항균활성을 보인 에틸아세테이트 추출물의 최소생육저해농도를 측정하였다[Table 3]. 싸리버섯 에틸아세테이트 추출물은 S.
- 12 mg/ml 농도로 추출물을 단계별로 희석하여 첨가하였다. 36시간까지 배양하면서 시간별로(0, 2, 4, 6, 10, 12, 24 및 36 hr) 600 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 추출물을 포함하지 않은 용액(DMSO 첨가)을 음성대조군으로 사용하였다.
- 37°C 혐기성배양기에서 24시간 동안 배양시킨 후, 600 nm에서 흡광도를 측정하여 균의 생육이 나타나지 않는 추출물의 농도를 MIC로 결정하였다.
- 37°C에서 24시간 배양한 후, 600 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 다음 식을 사용하여 생육저해율을 조사하였다.
- MIC 측정결과, 싸리버섯의 에틸아세테이트 추출물은 모든 구강균주에서 3.75∼15.00 mg/ml의 MIC 값을 보여주었기 때문에, 이를 바탕으로 MIC보다 낮은 농도인 0.12, 1.88, 3.75, 7.50 및 15.00 mg/ml 등의 농도별로 싸리버섯 에틸아세테이트 추출물을 첨가하면서 10종 구강균주에 대한 생육저해곡선을 측정하였다.
- S. aureus, S. anginosus, S. criceti, S. mutans, S. ratti, S. sanguinis 및 S. sobrinus 등은 Brain-Heart Infusion (BHI, Difco, Detroit, MI, USA) 배지에, A. israelii, A. viscosus 및 A. actinomycetemcomitans 등은 Trypticase Soy Broth (TSB, BD Co., USA) 배지에 접종하여 24시간 동안 37°C 혐기성배양기(5% CO2)에서 배양하였다[Table 1].
- 각 시험 구강균주를 각각의 조건에 맞는 액체 배지에 접종 후 37°C에서 24시간 배양하여 활성화시키고 0.5 McFarland 표준탁도(약 1.00×108 CFU/ml)로 맞추어 각각의 평판 배지에 멸균된 면봉을 이용하여 균일하게 도포하였다.
- 구강세균에 대한 에틸아세테이트 추출물의 농도별 및 시간경과별 생육저해정도를 조사하였으며, 위에서 설명한 최소생육저해농도 측정 방법과 동일하게 진행하였다. 싸리버섯 에틸아세테이트 추출물의 MIC 값으로 얻어진 15.
- 그리고 37°C 혐기성배양기(incubator)에서 24시간 동안 배양시키면서, paper disc 주위에 생성된 억제환(inhibition zone)의 크기를 vernier caliper (0∼150 mm, color world, China)로 측정하는 방법으로 모든 추출물에 대한 항균력을 비교·분석하였다.
- israelii 등 10종의 구강세균에 대한 항균활성능력과 최소억제농도를 측정하였다. 또한, 생장저해곡선을 확인함으로써 싸리버섯 추출물이 10종의 구강세균의 생장에 미치는 영향을 조사하였다. 싸리버섯의 에틸아세테이트 추출물은 10종 구강세균 모두에서 항균활성을 나타내었고, 아세톤 추출물은 에틸아세테이트 추출물의 항균활성에 비해 다소 약하지만 S.
- 실험을 3번 반복하여 평균값과 표준편차로 나타냈으며, 100.00 μg/ml ampicillin을 양성대조군으로 사용하였다[24].
- 구강세균에 대한 에틸아세테이트 추출물의 농도별 및 시간경과별 생육저해정도를 조사하였으며, 위에서 설명한 최소생육저해농도 측정 방법과 동일하게 진행하였다. 싸리버섯 에틸아세테이트 추출물의 MIC 값으로 얻어진 15.00 mg/ml, 7.50 mg/ml, 3.75 mg/ml 및 1.88 mg/ml, 0.12 mg/ml 농도로 추출물을 단계별로 희석하여 첨가하였다. 36시간까지 배양하면서 시간별로(0, 2, 4, 6, 10, 12, 24 및 36 hr) 600 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 추출물을 포함하지 않은 용액(DMSO 첨가)을 음성대조군으로 사용하였다.
- 싸리버섯 추출물이 구강세균의 생육에 미치는 생육저해율 측정은 싸리버섯 추출물을 3.75 mg/ml 농도로 주입하였으며, 위의 최소생육저해농도 측정방법과 동일하게 측정하였다. 37°C에서 24시간 배양한 후, 600 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 다음 식을 사용하여 생육저해율을 조사하였다.
- 싸리버섯을 건조 분쇄 후, 아세톤, 에탄올 및 에틸아세테이트 등으로 용매추출하여 확보한 고형물의 함량을 각 용매별 수율로 계산하였다[Table 2]. 추출 수율은 에틸아세테이트 추출물이 8.
- 이에 본 연구에서는 치아우식증과 치주질환 원인균에 대한 싸리버섯의 항균활성을 알아보고자 싸리버섯을 아세톤, 에탄올 및 에틸아세테이트 등 3종의 용매로 추출하였으며, S. mutans, S.sobrinus, S. aureus, S. sanguinis, S criceti, S. ratti, S. anginosus, A. actinomycetemcomitans, A.viscosus 및 A. israelii 등 10종의 구강세균에 대한 항균활성능력과 최소억제농도를 측정하였다. 또한, 생장저해곡선을 확인함으로써 싸리버섯 추출물이 10종의 구강세균의 생장에 미치는 영향을 조사하였다.
대상 데이터
- 각각의 추출액을 3번 감압여과(ADVANTEC No. 2Advantec MFS, Inc., Tokyo, Japan) 한 후, 회전진공증발기(rotary evaporator, EYELA A-1000S, Tokyo Rikakikai Co, Tokyo, Japan)로 농축하여 추출물을 확보하였으며, 추출용매로는 99.50% 아세톤, 99.50% 에탄올 및 99.00% 에틸아세테이트(Daejung Chemicals & Metals, Siheung, Korea) 등을 사용하였다.
- 실험에 사용된 구강균주는 총 10종으로 그람양성간균인 Staphylococcus aureus 외 8종과 그람음성균인 Aggregatibacter actinomycetemcomitans 1종 등을 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)로부터 분양 받아 사용하였다. S.
- 싸리버섯은 강원도 양양군 소재의 산과 바다농장에서 냉동 싸리버섯을 구입하여 사용하였다. 자연 건조하여 분쇄한 싸리버섯 50.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 3회 반복적으로 수행하여 평균±표준편차로 나타내었다.
- 본 연구의 통계처리는 SPSS Statistics 23 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용한 분산분석(ANOVA) 방법으로 비교하였으며, Duncan’s multiple range test (α= 0.05)에 따라 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 디스크 확산법으로부터 얻은 항균활성 관련 결과를 바탕으로 아세톤, 에틸아세테이트 및 에탄올 추출물 중 항균력이 가장 높게 확인된 에틸아세테이트 추출물만을 사용하여 각 구강균주에 대한 최소생육저해농도(MIC) 값을 액체배지희석법(broth dilution method)으로 측정하였다. 96 well plate에 최종농도가 0.
- 싸리버섯 추출물의 항균력은 디스크 확산법을 이용하여 측정하였다[23]. 각 시험 구강균주를 각각의 조건에 맞는 액체 배지에 접종 후 37°C에서 24시간 배양하여 활성화시키고 0.
- 싸리버섯의 용매별 추출물의 항균활성을 디스크 확산법으로 조사하였다[Fig. 1]. 아세톤과 에틸아세테이트 추출물은 10종의 구강균주 모두에 대하여 항균효과를 나타내었고, 에탄올 추출물의 경우는 S.
성능/효과
- 1. 디스크 확산법을 이용하여 아세톤, 에탄올 및 에틸아세테이트 등의 추출용매에 의한 항균활성 조사 결과, 에틸아세테이트로 추출한 싸리버섯 추출물이 10종의 구강균주에 대해서 다른 용매와 비교하였을 때, 상당히 높은 항균활성을 나타낸 반면, 에탄올 추출물은 다소 약한 활성을 보였다. 싸리버섯 에틸아세테이트 추출물의 경우, S.
- 1.88∼7.50 mg/ml의 농도에서는 대부분의 구강균주의 경우, 12시간까지 균의 생육이 억제되었으며, 12시간 이후 음성대조군에 비해 균의 증식이 활발히 진행되었다.
- 2. 싸리버섯 에틸아세테이트 추출물의 MIC 조사 결과, S. aureus와 S. mutans에 대해서 15.00 mg/ml, S. sobrinus와 A. actinomycetemcomitans에 대해서 7.50〜15.00 mg/ml, S. anginosus, S.criceti, S. ratti, S. sanguinis 및 A. viscosus 등에 대해서 7.50 mg/ml로 확인되었으며, 특히 A.israelii에 대해서 가장 낮은 3.75 mg/ml를 나타내었다.
- 24시간 동안 배양한 경우, 싸리버섯 에틸아세테이트 추출물이 첨가된 구강균주는 추출물을 첨가하지 않은 음성대조군에 비하여 A. israelii과 A.viscosus에 대한 생육저해율이 각각 93.70%와 76.50% 정도 유의적으로 높은 결과를 보였다(p<0.05).
- 3. 싸리버섯 에틸아세테이트 추출물을 대상으로 농도 및 시간 경과에 따른 생육저해효과를 확인한 결과, 대부분 음성대조군에 비해 균의 생육저해효과를 나타냈으며, 대부분 12 혹은 24 시간 경과 후 균의 생육이 크게 증가하였으나, 농도가 가장 큰 15.00 mg/ml의 경우 배양 초기부터 36시간까지 강하게 균의 생육이 억제되었다.
- MIC 측정결과, 싸리버섯의 에틸아세테이트 추출물은 A. israelii의 경우, 3.75 mg/ml인 것을 제외하고 나머지 모든 구강균주에 대해서 7.50∼15.00 mg/ml의 높은 MIC 값을 나타내었다.
- S. anginosus, S. criceti, S. ratti 및 A. actinomycetemcomitans 등에서 각각 8.19 mm, 8.66 mm, 8.98 mm 및 9.05 mm의 억제환을 보이는 것처럼 다른 용매추출물에 비해 유의적으로 월등히 높은 항균활성을 보였다(p 아세톤 > 에탄올 추출물 순으로 항균활성이 나타났으며, 일부 A. israelii과 A. viscosus 등에서는 에틸아세테이트 > 에탄올 > 아세톤 추출물 순으로 항균활성을 보였으나, 유의적 차이를 나타내지는 않았다(p>0.05).
- 50 mg/ml의 농도에서는 대부분의 구강균주의 경우, 12시간까지 균의 생육이 억제되었으며, 12시간 이후 음성대조군에 비해 균의 증식이 활발히 진행되었다. 결과적으로, 농도가 커질수록 균의 증식이 억제되는 시간이 증가하였으며, 균의 증식 속도가 느려지는 것을 확인할 수 있었다. 특히, S.
- 00 mg/ml의 추출물을 첨가한 경우에는 균의 생육 기간 동안 균의 증식이 발생하지 않고 사멸되었다. 결과적으로, 본 연구에서는 싸리버섯 추출물이 S. aureus, S.anginosus, S. criceti, S. mutans, S. ratti, S. sanguinis, S. sobrinus, A. israelii, A. viscosus 및 A.actinomycetemcomitans 등에 항균활성을 보였으며, 특히, A. viscosus에 대해 항균활성이 높게 나타났다. 따라서 치아우식증 뿐만 아니라 치주질환을 유발하는 구강균주에 대한 싸리버섯 추출물의 항균효과를 확인할 수 있었으며, 특히 싸리버섯에 대해 에틸아세테이트가 아세톤 및 에탄올 보다 구강 세균의 성장을 억제하는데 효과적인 용매로서 더욱 적합하다는 것을 확인할 수 있었다.
- viscosus에 대해 항균활성이 높게 나타났다. 따라서 치아우식증 뿐만 아니라 치주질환을 유발하는 구강균주에 대한 싸리버섯 추출물의 항균효과를 확인할 수 있었으며, 특히 싸리버섯에 대해 에틸아세테이트가 아세톤 및 에탄올 보다 구강 세균의 성장을 억제하는데 효과적인 용매로서 더욱 적합하다는 것을 확인할 수 있었다. 버섯은 채취 시기, 건조방법, 추출용매 또는 추출방법의 차이에 따라 추출되는 생리활성물질의 종류와 양이 달라지므로 향후 구강세균에 대해 항균효과를 나타내는 싸리버섯의 성분을 분리하고 그 성분에 따른 구강세균의 성장억제효과를 확인하는 연구가 필요하며, 또한 독성검사를 통해 안전성을 검증하는 추가적인 연구가 수반되어야 할 것으로 사료된다.
- 50 mg/ml의 MIC를 나타내었다. 또한 S. sobrinus와 A. actinomycetemcomitans 에서는 7.50 mg/ml와 15.00 mg/ml 사이의 MIC 값을 보였으며, 특히 A. israelii에서는 3.75 mg/ml로 가장 낮은 MIC를 확인하였다.
- 05). 또한, A. actinomycetemcomitans에 대한 생육저해율이 56.80%로 A. israelii와 A. viscosus를 제외한 나머지 그람 양성균보다 높은 결과를 나타냈으며, S. mutans와 S. sanguinis에 대한 생육 저해율은 각각 18.40%와 26.70%로 상당히 낮게 확인되었다.
- 10종의 구강균주에 대해서 다른 용매추출물에 비해 강한 항균활성을 보인 에틸아세테이트 추출물의 최소생육저해농도를 측정하였다[Table 3]. 싸리버섯 에틸아세테이트 추출물은 S. aureus와 S.mutans에서 각각 15.00 mg/ml이였으며, S. anginosus, S. criceti, S. ratti, S. sanguinis 및 A. viscosus등에서는 각각 7.50 mg/ml의 MIC를 나타내었다. 또한 S.
- 디스크 확산법을 이용하여 아세톤, 에탄올 및 에틸아세테이트 등의 추출용매에 의한 항균활성 조사 결과, 에틸아세테이트로 추출한 싸리버섯 추출물이 10종의 구강균주에 대해서 다른 용매와 비교하였을 때, 상당히 높은 항균활성을 나타낸 반면, 에탄올 추출물은 다소 약한 활성을 보였다. 싸리버섯 에틸아세테이트 추출물의 경우, S. ratti와 A. actinomycetemcomitans 등에서 가장 강한 활성을 확인하였다.
- 또한, 생장저해곡선을 확인함으로써 싸리버섯 추출물이 10종의 구강세균의 생장에 미치는 영향을 조사하였다. 싸리버섯의 에틸아세테이트 추출물은 10종 구강세균 모두에서 항균활성을 나타내었고, 아세톤 추출물은 에틸아세테이트 추출물의 항균활성에 비해 다소 약하지만 S. mutans를 제외한 나머지 모든 구강균주에서 항균효과를 보였다. 에탄올 추출물은 S.
- sanguinis 등을 제외한 나머지 구강균주 모두에서 다소 약한 항균 활성을 보였다. 아세톤 추출물은 S. criceti와 S. ratti에서 각각 8.23 mm와 8.59 mm 등으로 다른 구강균주들에 비해 높은 활성을 보였으며, 에틸아세테이트 추출물은 모든 구강균주에서 가장 강한 항균활성을 확인하였다. S.
- 1]. 아세톤과 에틸아세테이트 추출물은 10종의 구강균주 모두에 대하여 항균효과를 나타내었고, 에탄올 추출물의 경우는 S. anginosus, S. mutans 및 S. sanguinis 등을 제외한 나머지 구강균주 모두에서 다소 약한 항균 활성을 보였다. 아세톤 추출물은 S.
- mutans를 제외한 나머지 모든 구강균주에서 항균효과를 보였다. 에탄올 추출물은 S. anginosus, S. mutans 및 S. sobrinus 등에서 활성을 보이지 않았으나, A. viscosus에 대한 활성에서만 다른 모든 구강균주에 비해 다소 높게 확인되었다. 에틸아세테이트를 이용한 표고버섯 추출물이 아세톤 표고버섯 추출물보다 구강세균에 대해 높은 항균활성을 보인 선행연구[13] 에서와 동일하게, 본 연구에서도 싸리버섯의 구강세균에 대한 항균효과를 높이는데 에틸아세테이트가 가장 적합한 용매임을 확인할 수 있었다.
- viscosus에 대한 활성에서만 다른 모든 구강균주에 비해 다소 높게 확인되었다. 에틸아세테이트를 이용한 표고버섯 추출물이 아세톤 표고버섯 추출물보다 구강세균에 대해 높은 항균활성을 보인 선행연구[13] 에서와 동일하게, 본 연구에서도 싸리버섯의 구강세균에 대한 항균효과를 높이는데 에틸아세테이트가 가장 적합한 용매임을 확인할 수 있었다. MIC 측정결과, 싸리버섯의 에틸아세테이트 추출물은 A.
- 싸리버섯을 건조 분쇄 후, 아세톤, 에탄올 및 에틸아세테이트 등으로 용매추출하여 확보한 고형물의 함량을 각 용매별 수율로 계산하였다[Table 2]. 추출 수율은 에틸아세테이트 추출물이 8.93 %로 다른 용매추출물과 비교하였을 때 가장 높은 수율을 보였으며, 다음으로 아세톤(6.30%)과 에탄올(4.01%) 순으로 나타났다.
- 추출물을 첨가하지 않은 음성대조군에서 2시간 이후, 4∼6 시간까지 균의 성장이 빠르게 증가하였으나, 싸리버섯 에틸아세테이트 추출물을 0.12 mg/ml로 첨가하였을 경우에는 4시간까지 균의 증식이 억제되다가 12시간까지 균이 완만하게 증식되었으며, 그 이후에는 균의 증식이 활발히 진행되었다.
- 결과적으로, 농도가 커질수록 균의 증식이 억제되는 시간이 증가하였으며, 균의 증식 속도가 느려지는 것을 확인할 수 있었다. 특히, S. criceti, S. ratti 및 S. anginosus 등은 7.50 mg/ml의 경우에서 24시간까지 균의 증식이 지연되는 결과를 보여주었으며, 또한 농도가 가장 높은 15.00 mg/ml에서는 10종의 모든 구강세균에 대한 36시간 생육기간동안 균의 증식이 완전히 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 따라서 치아우식증 뿐만 아니라 치주질환을 유발하는 구강균주에 대한 싸리버섯 추출물의 항균효과를 확인할 수 있었으며, 특히 싸리버섯에 대해 에틸아세테이트가 아세톤 및 에탄올 보다 구강 세균의 성장을 억제하는데 효과적인 용매로서 더욱 적합하다는 것을 확인할 수 있었다. 버섯은 채취 시기, 건조방법, 추출용매 또는 추출방법의 차이에 따라 추출되는 생리활성물질의 종류와 양이 달라지므로 향후 구강세균에 대해 항균효과를 나타내는 싸리버섯의 성분을 분리하고 그 성분에 따른 구강세균의 성장억제효과를 확인하는 연구가 필요하며, 또한 독성검사를 통해 안전성을 검증하는 추가적인 연구가 수반되어야 할 것으로 사료된다.
- 위와 같이 결과적으로 싸리버섯 추출물은 S. mutans, S. aureus, S. sanguinis, S. sobrinus, S.anginosus, S. ratti, S. criceti, A. actinomycetemcomitans, A. viscosus 및 A. israelii 등 10종의 구강 세균에 대하여 항균효과가 있음을 확인함으로써 치아우식증과 치주염 등의 구강질환에 효과적인 천연 항균소재로서 활용될 수 있으리라 생각한다.
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